Estructura Genoma Eucariota. Estructura Genoma Procariota

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1

• Organización compacta (poco espacio

entre genes)

•Información adicional en plásmidos • DNA no codificante en pequeños segmentos dispersos en el genoma (<11%)

• No hay intrones

• Organización en operones (E.coli aprox 600 operones con 2 o más genes)

•Genoma Nuclear

• Genoma compuesto por 2 o más moléculas de ADN linear (cromosomas) • Organización menos compacta

• DNA repetitivo (disperso y en tandem) • Intrones

•Genoma organelas

•Generalmente DNA circular •Nº elevado de copias por organela •Numerosas organelas por célula

Estructura Genoma

Eucariota

Estructura Genoma

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2 Super-enrollamiento

(agregado de giros al DNA)

•DNA girasa (topoisomerasa II) •DNA topoisomerasa I

• DNA genómico  Nucleoide :

empaquetamiento en forma organizada

Estructura Genoma Procariota

Molécula de DNA circular única (80%)

+ Proteínas básicas asociadas

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3

• Organización de dominios : 40-50 Loops super-enrollados (100kb)

•DNA genómico unido a un “core” proteico a partir del cual radian los loops

•Proteínas asociadas: DNA girasa, DNA topoisomerasa I, más al menos 4 proteínas HU la más abundante (Tetrámeros)

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4 Variaciones en Procariotas

•Algunos genoma linear

Ej: Borrelia burgdorferi

•Algunos genomas de tamaño mayor

Ej. B.megaterium (30 x 106_pb)

•DNA circular o linear subgenómico

 genoma multipartito

(Brivio cholera (2

cromosomas circulares, uno genes involucrados en metabolismo y virulencia), Borrelia (hasta 11 copias de 1 único cromosoma linear)

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5 Genoma eucariota nuclear

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6 Características de los cromosomas

• Centrómero:

– DNA centromérico: secuencias repetitivas • humanos DNA alfoide: repeticiones de 171pb

(1x106_{pb) (1500-30000 copias)}

• Arabidopsis: repeticiones de 180pb (0.9 a 1.5MB)

• Levaduras (S. cereviciae) : secuencia mínima 125pb

– Proteínas unidas al centrómero

• humanos al menos 7 proteínas, una de ellas CENP-A reemplaza a histona H3, formando nucleosomas más compactos

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8 – Indica el extremo de los cromosomas y los protege

• Evita recombinación entre cromosomas • Evita la unión de extremos de cromosomas

– Replicación completa de los cromosomas

– Organización funcional de cromosomas en el Núcleo

•Telómeros

–DNA repetitivo

•Humanos: cientos de copias de la secuencia – 5’-TTAGGG-3’

–Extensión del extremo 3’ como simple cadena –Proteínas teloméricas:

•TRF1 (regula el largo de los telómeros)

•TRF2 (mantiene la extensión de DNA simple cadena, T loop)

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9

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10 Cromatina :

50% DNA + 50% Proteínas básicas (Histonas)

1er nivel de organización: NUCLEOSOMAS

ADN:

aprox 200pb

• ADN asociado al core 147 pb • ADN linker 10-90 pb

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11 Histonas linker:

H1 a-e, H1º, H1t y H5

Histonas core:

H2A H2B H3 H4

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13

Metilación y Acetilación: grupo amino libre de Lisina

Metilación: en Arginina

Fosforilación: grupos OH de Serina y Treonina

Histonas: dominio carboxilo terminal globular + cola amino terminal desestructurada

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14 Modificaciones de Histonas

• Modificaciones:

– Acetilación/ Deacetilación de residuos Lys (HAT / HDAC) Accesibilidad transcripcional de la cromatina

• Acetilación de H3 y H4: neutralización de cargas positivas de Histonas genes activos

– Metilación de Lys y Arg Depende del nº de grupos metilo y del residuo modificado

• H3K4 genes activos

• H3K9 y H3K27 genes inactivos • Metilación R marca activa o represiva

– Fosforilación de Ser y Thr

• mitosis y meiosis: condensación/ decondensación de cromatina

– Ubiquitinación de K

– Sumoilación de K

– ADP ribosilación

• Variantes de Histonas

– Reemplazan a H3 o H2A en algunos nucleosomas • CENP-A en centrómeros

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15

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16 •Unión del DNA a la matriz nuclear : MAR (sec. ricas en AT)

•Dominios estructurales y funcionales

Loops de ADN 40-100kb Dominios estructurales •Loops de ADN Dominios funcionales •Regiones sensibles a DNasa •Límites: regiones aislantes, 1-2kb (insulator)

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17 Empaquetamiento en

cromosomas

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19

Heterocromatina /Eucromatina

Heterocromatina

•Principalmente DNA

repetitivo

(Centrómeros, Telómeros, Transposones)

•Baja densidad génica

•Densamente empaquetada

•Sin sitios HS

•Ordenamiento regular de

nucleosomas

•Replicación tardía en fase S

•Crossing-over reducidos

Eucromatina

•Sensibilidad a nucleasas

•Alta densidad génica

•DNA potencialmente activo

transcripcionalmente

•Histonas acetiladas

•Metilación Lys-4 H3

•DNA no metilado

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20

• Heterocromatina:

Modificaciones covalentes características

– Histonas desacetiladas

– Metilación Lys-9 H3 (unión prot HP-1) (H3 K9) – Metilación DNA (CpG)

• Heterocromatina Facultativa

– Regiones genómicas empaquetadas en algunos grupos de células o en 1 solo cromosoma homólogo

• Cromosoma X

• Heterocromatina constitutiva

– Grandes regiones principalmente secuencias repetitivas • Telómeros, centrómeros, transposones

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21 Mecanismos Epigenéticos en mamíferos

•Las modificaciones enzimáticas del DNA y de las histonas que forman el core del nucleosoma proveen información epigenética heredable, no codificada en la secuencia

de nucleótidos de la célula.

MECANISMO EPIGENETICO: cualquier mecanismo que provee información regulatoria a un genoma sin alterar su secuencia primaria de nucleótidos

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22 Modificación enzimática del DNA

 Metilación de citosinas (C)

Modificación enzimática del C5_{de la base Citosina, en su mayoría en dinucleótidos CpG}

(islas CpG)

•Patrón de metilación de una célula  Resultado de un proceso dinámico de metilación/demetilación

•El patrón de metilación de una célula somática diferenciada es estable y heredable

(DNMT1)

Establecimiento y mantenimiento de patrones de metilación del ADN requiere 3 enzimas catalíticamente activas: DNA metiltransferasa 1 (Dnmt1), Dnmt3a y Dnmt3b.

Dnmt2 y Dnmt3L (sin subunidad catalítica) se expresan en algunos tipos celulares y en

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23

•Reprogramación del patrón de metilación (demetilación /remetilación) en 2

etapas del desarrollo: •células germinales

•preimplantación del embrión

 Demetilación global del genoma y remetilación “de novo” (DNMT3 A y B)

•Células espermáticas y óvulos altamente metilados y con metilación diferencial de algunos genes en ambas células (genes “imprinted”)

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24 Modificación enzimática del Histonas

 Código de Histonas

•Metilación de Lisinas (K) y Argininas (R): Distintos efectos

dependiendo del número de grupos metilo y la posición del residuo.

- Genes inactivos, heterocromatina H3K9 y H3K27

- Genes activos, eucromatina H3K4 + acetilación de H3 y H4

•Acetilación / deacetilación (K): correlaciona con accesibilidad de la cromatina para la transcripción (HAT, HDAC)

•Ubiquitinación (K)

•Sumoilación (K)

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25 •Modificación de la estructura de la cromatina

•Activación / Inactivación de genes

•Rol en respuesta al daño celular: modificación de Histonas

(fosforilación) en respuesta a ruptura de doble cadena  señal para

mecanismo de reparación

•Inactivación de elementos transponibles

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26 •REGULACIÓN EPIGENÉTICA DE LOS GENOMAS DE MAMIFEROS

•PROMOTORES

•REGIONES REGULATORIAS DISTALES •IMPRINTING

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27 Cromosomas sexuales

•Pequeña región de homología con cromosoma X

•95% no autosomal (seq transpuestas de X, seq de X degeneradas, Amplicon (8 bloques palindrómicos)

•Pocos genes (aprox 156, la mitad pseudogenes)

•60 genes específicos de macho que se expresan en testículo (gen SRY) •1000-2000 genes (distrofina, proteínas de

coagulación sanguínea)

•La mayor parte de los genes sin contraparte en el Y (solo 9 genes descriptos)

•Inactivación de un cromosoma (compensación de dosis)

Cromosoma X

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28 Heterocromatina Facultativa

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29

•Co-evolution of X-chromosome inactivation and imprinting in mammals •Wolf Reik & Annabelle Lewis

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31 Inactivación del cromosoma X

Modificación del estado de la cromatina (actividad de acetilasas, metilasas).

Metilación del ADN

Bajos niveles de acetilación de Histonas (H4) Bajos niveles de metilación de H3K4

Altos niveles de metilación de H3K9 y H3K27 asociados a silenciamiento génico.

Nucleosomas del Xi presentan una variante de histona llamada macroH2A.

Inicio en un locus específico Xic y progresión a todo el cromosoma. Sitio de iniciación Xic: Gen Xist  ARN no codificante ARN Xist.

Inicio de la Inactivación

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X-chromosome inactivation: counting, choice and initiation Philip Avner & Edith Heard

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ARN Xist: permanece unido al ADN, recubrimiento del cromosoma Xi.

 Señal para el inicio de modificaciones de la cromatina (hipoacetilación, metilación del ADN)

Gen Tsix: Transcripto antisentido Tsix

 Regulador negativo de Xist: Regula la elección del cromosoma X que permanece activo

Región Xpr: sensado del número de cromosomas X. Coordina la expresión reciproca de Xist/ Tsix

Nature Reviews Genetics 2, 59-67

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35

Células embrionarias no

diferenciadas  ambos cromosomas X activos expresión de ARN Xist transiente en ambos cromosomas.

Células embrionarias diferenciadas  cromosoma X inactivo recubierto por ARN Xist

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36 Modelo de inactivación del

cromosoma X

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37 Imprinting

Genes cuya expresión está determinada por su origen parental.

Asimetría en la función de los genomas

parentales

Expresión exclusiva del alelo materno por imprinting del paterno o viceversa

Primeros genes “imprinted” descubiertos:

Factor de crecimiento insulínico tipo 2 (Igf2) y su receptor (Igf2r) La característica de los genes “imprinted” es expresión monoalélica y patrón de

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38 Mecanismo de imprinting:

• Iniciado durante gametogénesis, metilación en forma diferencial en

espermatogénesis y ovogénesis (Dnmt3a y Dnmt3bL).

• Genes “imprinted” (ratones: aprox 100 genes identificados).

Funciones distintas: crecimiento y desarrollo fetal y placentario

• En general genes “imprinted” agrupados en “clusters”: genes de

expresión materna o paterna y al menos un ARN no codificante (nc

RNA).

• Región de control del “imprinting” ICR (ICE o DMR) con metilación

del ADN y modificaciones de histonas alelo específicas de acuerdo

al origen parental.

Formación de células germinales primordiales: Remoción de todo imprinting

Los patrones de metilación genómica de ovocitos y espermatozoides

depende de la actividad de ADN metiltransferasas Dnmt

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Genes Dev. 2009 September 15; 23(18): 2124–2133.

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41 Genoma de Organelas

• Herencia “no medeliana”, segregación somática

• Origen endosimbiótico

• Moléculas de DNA circular, en general

• Número de copias por organela elevado (10- 100)

• Tamaño variable

– Mitocondrias: 16,5kb mamífero – 366 kb en plantas (hasta 2400 kb en algunas plantas)

– Cloroplastos: 100-200kb

• Contenido genético

– Proteínas involucradas en procesos de la organela – RNA ribosomales y de transferencia

• Acumulación de mutaciones diferente a DNA genómico

– En mamíferos tasa de mutación mayor, en plantas menor.

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• Genoma mitocondria

– Tamaño variable • Mamíferos 16,5 kb • Levaduras 84 kb • Plantas superiores: de 100 a 2400kb (Maiz 570kb) – 5 a 90 genes (37 genes en mamíferos) – Intrones – Sec.intergénica – Duplicaciones – Círculos subgenómicos

•Genoma cloroplastos

•100- 200kb •Aprox 200genes •20 a 40 copias/ organela •20 a 40 organelas /célula •Intrones

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43 Comparación del genoma mitocondrial de levadura y

mamífero

Mamífero

16kb Extremadamente compacto Sin Intrones

Algunos genes superpuestos 13 genes codifican proteínas (cad respiratoria)

Levadura

84kb Intrones

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45 Genoma cloroplasto (arroz)

Cloroplasto 120-190kb  Intrones 87-183 genes 4 RNA rib 30-32 ARNt

 genes codifican proteínas aprox 50 Prot ribosomales

RNA polimerasa Fotosíntesis