Anexo 1: Determinación de compuestos fenólicos
Para la determinación de compuestos fenólicos se utilizó el método espectrofotométrico Preparación del extracto:
Se pesó 0,5 g de la muestra triturada en un tubo falcon, se le añadió 6 mL de metanol al 80%, luego se agito en vortex por un minuto a 120 rpm y se almaceno en oscuridad a 3 °C por 24 horas. Pasado el tiempo se centrifugo a 4500 RPM por 15 min a 3°C, se separó el sobrenadante, se le inyecto nitrógeno por 2 minutos y se almaceno en oscuridad a 3°C hasta su análisis.
Procedimiento:
Del extracto se tomó 200 µL por triplicado, se adiciono 200 µL de reactivo Folin Ciocalteu 1N, 2 mL de carbonato de sodio al 7%; 2,6 mL de agua destilada se agito en el vortex por 1 minuto a 80 RPM y se dejó reposar por 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad.
Luego se midió la absorbancia a 750 nm. Teniendo como blanco agua destilada.
Standard Curve
Conc. (ug/ml)
0.009 0.500 1.000 1.500 1.994
Abs.
0.729
0.600
0.400
0.200
0.000 -0.061
y = 0.334383 x + 0.000000 Correlation Coefficient r2 = 0.99853
Figura 17: Curva estándar del ácido gálico a 750 nm
72 Anexo 2: Determinación de la capacidad antioxidante
Anexo 2.1. MÉTODO DPPH Preparación del extracto:
Se pesó 2 g de la muestra triturada en un tubo falcon, se le añadió 6 mL de metanol al 80%, luego se agito en vortex por un minuto a 120 rpm y se almaceno en oscuridad a 3 °C por 24 horas. Al cumplir el tiempo se centrifugo a 4500 RPM por 15 min a 3°C, se separó el sobrenadante, se le inyecto nitrógeno por 2 minutos y se almaceno en oscuridad a 3°C hasta su análisis.
Preparación del radical DPPH
Se pesó 3,9 mg de DPPH y se disolvió en 100 ml de metanol al 80%.
Procedimiento
Se tomó 100 µL del extracto, se le añadió 2900 µL del radical DPPH, se agito en el vortex a 120 RPM por un minuto y se dejó reposar por 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente, luego se realizó la lectura a 517 nm. El blanco fue metanol al 80%
Figura 18: Curva estándar del trolox a 517 nm
Standard Curve
Conc. (uM/l)
80.781 100.000 200.000 300.000 359.110
Abs.
0.583
0.500
0.400
0.300 0.264
y = - 8.62621e-004 x + 0.602527 Correlation Coefficient r2 = 0.95667
73 Anexo 2.2. MÉTODO ABTS
Solución madre de ABTS
Se preparó mezclando en partes iguales los reactivos A y B, la mezcla se dejó reaccionar por 12 horas a temperatura ambiente. La solución madre solo se podrá utilizar durante 4 horas siguientes al tiempo de reacción.
Reactivo A:
Se pesó 78,4 mg de ABTS y se enraso con agua destilada a 10 ml en una fiola. Se almaceno protegido de la luz a 3°C por un tiempo máximo de 5 días.
Reactivo B:
Se pesó 13,2 mg de per sulfato de potasio y se enraso con agua destilada a 10 ml en una fiola. Se almaceno protegido de la luz a 3°C por un tiempo máximo de 5 días.
Solución diluida de ABTS:
Luego de las 12 horas de reposo de la solución madre, se preparó la solución diluida de ABTS, para lo cual se tomó 1 ml de la solución madre y se diluyó con 60 ml de metanol puro. Luego se lee la absorbancia que debe ser de 1,1 ±0.02 a 734 nm. Si la absorbancia no es la indicada, se deberá corregir adicionando solución madre para concentrar o solvente para diluir, según sea el caso y hasta obtener la absorbancia indicada. Blanco:
metanol puro
Extracto hidrofílico:
Se pesó 3 g de la muestra triturada en un tubo falcon, se añadió 6 mL de metanol al 80%, luego se agito en vortex por un minuto a 120 rpm y se almaceno en oscuridad a 3 °C por 24 horas. Pasado el tiempo se centrifugo a 4500 RPM por 15 min a 3°C, se separó el sobrenadante, se le inyecto nitrógeno por 2 minutos y se almaceno en oscuridad a 3°C hasta su análisis.
Extracto lipofílico:
Al precipitado del extracto hidrofílico se le adiciono 6 ml de alcohol isopropílico, luego se agito en vortex por un minuto a 120 rpm y se almaceno en oscuridad a 3 °C por 24 horas.
74 Al cumplirse el tiempo se centrifugo a 4500 RPM por 15 min a 3°C, se separó el sobrenadante, se le inyecto nitrógeno por 2 minutos y se almaceno en oscuridad a 3°C hasta su análisis.
Procedimiento:
Se tomó 100 µL del extracto (hidrofílico o lipofílico), se le añadió 1900 µL de la solución diluida de ABTS, se agito en el vortex a 120 RPM por 30 segundos y se dejó reposar por 5 minutos en oscuridad a temperatura ambiente, luego se realizó la lectura a 734 nm. Se utilizó como blanco el solvente puro según el extracto empleado
Figura 19: Curva estándar de trolox para determinar capacidad antioxidante hidrofilia - método ABTS
y = -0,0022x + 1,167 R² = 0,9902 0
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
0 100 200 300 400 500 600
Abs.
Concentracion (mg/ul)
Curva estandar ABTS Hidrofilico
ABS vs CONC.
75 Figura 20: Curva estándar trolox para determinar capacidad antioxidante lipofílico -
método ABTS
y = -0,0012x + 1,0002 R² = 0,9704 0
0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
Abs.
Concentracio(mg/ul)
Curva estandar ABTS Lipofilico
76 Anexo 3: Determinación del contenido de betalaínas
Se determinó como suma de los pigmentos de betaxantina y betacianina por el método espectrofotométrico de componentes múltiples de Nilsson (1970). Los resultados fueron determinados en espectrofotómetro midiendo la absorbancia a 476 nm, 538 nm y600 nm.
El contenido de betalaínas totales se calcula mediante la siguiente ecuación:
𝐴𝐵𝑆. 𝑑𝑒𝑏𝑖𝑑𝑜 𝑎 𝑏𝑒𝑡𝑎𝑐𝑖𝑎𝑛𝑖𝑛𝑎𝑠 → 𝑥 = 1.095(𝑎 − 𝑐) 𝐴𝐵𝑆. 𝑑𝑒𝑏𝑖𝑑𝑜 𝑎 𝑏𝑒𝑡𝑎𝑥𝑎𝑛𝑡𝑖𝑛𝑎𝑠 → 𝑦 = 𝑏 − 𝑧 − 𝑥/3.1
𝐴𝐵𝑆. 𝑑𝑒𝑏𝑖𝑑𝑜 𝑎 𝑖𝑚𝑝𝑢𝑟𝑒𝑠𝑎𝑠 → 𝑧 = 𝑎 − 𝑥
Donde:
- a : absorbancia a 538 nm - b : absorbancia a 476 nm - c : absorbancia a 600 nm Calculo de betalaínas totales:
𝐵𝑇 ( 𝑚𝑔
100𝑔) = (𝐵𝐶 + 𝐵𝑋)
𝐵𝐶; 𝐵𝑋 ( 𝑚𝑔
100𝑔) = (𝐴 ∗ 𝐷𝐹 ∗ 106 𝑒 ∗ 𝑙 )
Dónde:
A es la absorbancia (x para BC; y para BX)
DF es el factor de dilución,
l es el ancho de la celda (1 cm).
Para la cuantificación de las betacianinas (BC) el coeficientes de extinción molar (e) = 60000 L/mol cm
Para la cuantificación de las betaxantinas (BX), el coeficientes de extinción molar (e) =48000 L/mol cm.
77 Preparación del extracto:
Se pesó 0,5 g de la muestra triturada en un tubo falcon, se le añadió 6 mL de buffer fosfato a pH 6,5, luego se agito en vortex por un minuto a 120 rpm y se almaceno en oscuridad a 3 °C por 24 horas, transcurrido el tiempo se centrifugo a 4500 RPM por 30 min a 3°C. Se separó el sobrenadante y se midió la absorbancia a 538 nm y 476 nm. Se utilizó como blanco agua destilada
78 Anexo 4: Determination de vitamina C
Donde:
- V: mL de gasto 2,6 diclorofenol indo fenol para titular la muestra.
- T: 2 mg/ mL de gasto 2,6 diclorofenol indo fenol para titular el patrón.
- W: gramos de muestra analizada.
79 Anexo 5: Proceso de germinado
1. Lavado de las muestras de quinua
2. Rehidratación de las muestras de quinua
3. Germinado de las muestras de quinua
80
Muestra: KIWICHA Remojado: 5H
T : 17°C
Muestra KIWICHA Remojado: 10 H
T : 17°C
Muestra KIWICHA Remojado: 5H
T : 25°C
MUESTRA:KIWICHA REMOJADO:10
T: 25°C
MUESTRA:1 REMOJADO:5 T: 17°C GERMINADO:62 NO GERMINADO: 39
MUESTRA:1 REMOJADO:10 H T: 17°C
GERMINADO: 56 NO GERMINADO: 49
MUESTRA:1 REMOJADO:5 T: 25°C GERMINADO:66 NO GERMINADO: 26
MUESTRA:1 REMOJADO:10 T: 25°C
GERMINADO: 78 NO GERMINADO: 19
Muestra 2 Remojado: 5H T : 17°C
GERMINADOS: 30 NO GERMINADO: 42
Muestra 2 Remojado: 10H T : 17°C
GERMINADOS: 34 NO GERMINADO: 27
Muestra 2 Remojado: 5H T : 25°C
GERMINADOS: 32 NO GERMINADO: 28
Muestra 2 Remojado: 10 25°C
GERMINADOS: 42 NO GERMINADO: 25
81
Muestra 3 Remojado: 5H T : 17°C
GERMINADOS: 79 NO GERMINADO: 18
Muestra 3 Remojado: 10 H T : 17°C
GERMINADOS: 65 NO GERMINADO: 24
Muestra 3 Remojado: 5H T : 25°C
GERMINADOS: 54 NO GERMINADO: 33
MUESTRA:13 REMOJADO:10 T: 25C
GERMINADO:51 NO GERMINADO: 12
Muestra: KIWICHA Remojado: 5H T : 17°C
GERMINADOS: 106 NO GERMINADO: 124
Muestra KIWICHA Remojado: 10 H T : 17°C
GERMINADOS: 300 NO GERMINADO: 68
Muestra KIWICHA Remojado: 5H T : 25°C
GERMINADOS: 98 NO GERMINADO: 55
MUESTRA:KIWICHA REMOJADO:10 T: 25C
GERMINADO:382 NO GERMINADO: 177
4. Secado de la quinua germinada
82 5. Molienda
6. Obtención de harina de quinua germinada
83 Anexo 6: Cuadros estadísticos para el análisis de investigación del contenido de
compuestos fenólicos totales en quinua
Tabla 34: Análisis de varianza para fenólicos totales en Quinua Blanca Huancayo
Fuente de variación
Suma de
cuadrados G.L. Cuadrado medio F Sig.
TRATAMIENTOS 4725,788 15 315,053 25,301 0,000
Error 398,469 32 12,452
Total corregido 5124,257 47
a. R2 = .922 (R2 ajustada = 0,886)
Tabla 35 Análisis de varianza para fenólicos totales en Quinua Roja Pasankalla
Fuente de variación
Suma de
cuadrados G.L. Cuadrado medio F Sig.
TRATAMIENTOS 3801,361 15 253,424 17,871 0,000
Error 453,778 32 14,181
Total corregido 4255,139 47
a. R2= .893 (R2 = .843)
Tabla 36: Análisis de varianza para fenólicos totales en Quinua Negra Collana
Fuente de variación
Suma de
cuadrados G.L. Cuadrado medio F Sig.
TRATAMIENTOS 3533,985 15 235,599 15,636 0,000
Error 482,155 32 15,067
Total corregido 4016,141 47
a. R2 = .880 (R2 ajustada = .824)
84 Anexo 7: Cuadros estadísticos para el análisis de investigación del contenido de
betalaínas en quinua
Tabla 37: Análisis de varianza para contenido de betalaínas en Quinua Blanca Huancayo
Fuente de variación
Suma de
cuadrados G.L. Cuadrado medio F Sig.
TRATAMIENTOS 39,827 15 2,655 76,725 0,000
Error 1,107 32 0,035
Total corregido 40,935 47
a. R2 = .973 (R2 ajustada = .960)
Tabla 38: Análisis de varianza para contenido de betalaínas en Quinua Roja Pasankalla
Fuente de variación
Suma de
cuadrados G.L. Cuadrado medio F Sig.
TRATAMIENTOS 95,292 15 6,353 36,575 0,000
Error 5,558 32 0,174
Total corregido 100,850 47
a. R2 = .945 (R2 ajustada = .919)
Tabla 39: Análisis de varianza para contenido de betalaínas en Quinua Negra Collana
Fuente de variación
Suma de
cuadrados G.L. Cuadrado medio F Sig.
TRATAMIENTOS 335,795 15 22,386 80,457 0,000
Error 8,904 32 0,278
Total corregido 344,699 47
a. R2 = .974 (R2 ajustada = .962)
85 Anexo 8: Cuadros estadísticos para el análisis de investigación del contenido de
vitamina C en quinua
Tabla 40: Análisis de varianza para vitamina C en Quinua Blanca Huancayo
Fuente de variación
Suma de
cuadrados G.L. Cuadrado medio F Sig.
TRATAMIENTOS 2616,671 15 174,445 93,596 0,000
Error 59,642 32 1,864
Total corregido 2676,313 47
a. R2 = .978 (R2 ajustada = .967)
Tabla 41: Análisis de varianza para vitamina C en Quinua Roja Pasankalla
Fuente de variación
Suma de
cuadrados G.L. Cuadrado medio F Sig.
TRATAMIENTOS 38001,495 15 2533,433 527,019 0,000
Error 153,827 32 4,807
Total corregido 38155,323 47
a. R2 = .996 (R2 ajustada = .994)
Tabla 42: Análisis de varianza para vitamina C en Quinua Negra Collana
Fuente de variación
Suma de
cuadrados G.L. Cuadrado medio F Sig.
TRATAMIENTOS 26766,566 15 1784,438 967,706 0,000
Error 59,008 32 1,844
Total corregido 26825,574 47
a. R2 = .998 (R2 ajustada = .997)
86 Anexo 9: Cuadros estadísticos para el análisis de investigación de la capacidad
antioxidante - método DPPH en quinua
Tabla 43: Análisis de varianza para capacidad antioxidante - método DPPH en Quinua Blanca Huancayo
Fuente de variación
Suma de
cuadrados G.L. Cuadrado medio F Sig.
TRATAMIENTOS 19569182,090 15 1304612,139 1323,502 0,000
Error 31543,271 32 985,727
Total corregido 19600725,360 47 a R2= .998 (R2 ajustada = .998)
Tabla 44: Análisis de varianza para capacidad antioxidante - método DPPH en Quinua Roja Pasankalla
Fuente de variación
Suma de
cuadrados G.L. Cuadrado medio F Sig.
TRATAMIENTOS 33829636,480 15 2255309,099 780,278 0,000
Error 92492,544 32 2890,392
Total corregido 33922129,020 47 a. R2 = .997 (R2 ajustada = .996)
Tabla 45: Análisis de varianza para capacidad antioxidante - método DPPH en Quinua Negra Collana
Fuente de variación
Suma de
cuadrados G.L. Cuadrado medio F Sig.
TRATAMIENTOS 18615778,170 15 1241051,878 73,051 0,000
Error 543645,676 32 16988,927
Total corregido 19159423,850 47 a. R2 = .972 (R2 ajustada = .958)
87 Anexo 10: Cuadros estadísticos para el análisis de investigación de la capacidad
antioxidante - método ABTS en quinua
Tabla 46: Análisis de varianza de capacidad antioxidante en quinua Blanca Huancayo - método ABTS
Tabla 47: Análisis de varianza de capacidad antioxidante en quinua Roja Pasankalla - método ABTS
Fuente de variación
Suma de
cuadrados G.L. Cuadrado medio F Sig.
TRATAMIENTOS 83831360,010 15 5588757,334 354,811 0,000
Error 504043,327 32 15751,354
Total corregido 84335403,340 47 a. R2 = .994 (R2 ajustada = .991)
Tabla 48: Análisis de varianza de capacidad antioxidante en quinua Negra Collana- método ABTS
Fuente de variación
Suma de
cuadrados G.L. Cuadrado medio F Sig.
TRATAMIENTOS 55391084,210 15 3692738,947 371,182 0,000
Error 318355,131 32 9948,598
Total corregido 55709439,340 47 a. R2 = .994 (R2 ajustada = .992)
Fuente de variación
Suma de
cuadrados GL
Media
cuadrática F Sig.
TRATAMIENTOS 35958324,610 15 2397221,641 196,477 0,000
Error 390433,849 32 12201,058
Total corregido 36348758,460 47 a. R al cuadrado = .989 (R al cuadrado ajustada = .984)
88 Anexo 11. Cuadros estadísticos para la Kiwicha
Tabla 49: Análisis de varianza para el contenido de fenólicos totales
Fuente de
variación
Suma de
cuadrados G.L. Cuadrado medio F Sig.
TRATAMIENTOS 1429,934 14 102,138 12,180 0,000
Error 251,566 30 8,386
Total corregido 1681,500 44 a. R2 = .850 (R2 ajustada = .781)
Tabla 50: Análisis de varianza para el contenido de betalaínas
Fuente de variación
Suma de
cuadrados GL
Media
cuadrática F Sig.
TRATAMIENTOS 193,827 14 13,845 13,953 0,000
Error 29,768 30 ,992
Total corregido 223,595 44
a. R al cuadrado = .867 (R al cuadrado ajustada = .805)
Tabla 51: Análisis de varianza para el contenido de vitamina C
Fuente de variación
Suma de
cuadrados GL
Media
cuadrática F Sig.
TRATAMIENTOS 9663,531 14 690,252 718,631 0,000
Error 28,815 30 ,961
Total corregido 9692,347 44
a. R al cuadrado = .997 (R al cuadrado ajustada = .996)
Tabla 52: Análisis de varianza para la capacidad antioxidante - método DPPH
Fuente de variación
Suma de
cuadrados G.L. Cuadrado medio F Sig.
TRATAMIENTOS 196263833,700 14 14018845,260 386,860 0,000
Error 1087125,413 30 36237,514
Total corregido 197350959,100 44 a. R2 = .994 (R2 ajustada = .992)