1.2. Bases teóricas y conceptuales
1.2.3. Enzimas usadas en la hidrolisis de Proteínas
Las enzimas “son catalizadores coloidales, por su composición son solubles en agua, estos son formados dentro de células vivas que puedes se de animales o vegetales, que tienen la capacidad de actuar al exterior de las células y sin contacto de alguna de ellas (Bravermen, 1967).
Las enzimas que actúan como biocatalizadores son complejos altamente específicos y altamente eficientes producidos por las células de los organismos vivos que aceleran las reacciones biológicas a través de vías definidas y su actividad está sujeta a regulación (Schmidt, 1982). En esencia, las enzimas son catalizadores orgánicos producidos por microorganismos y utilizados para acelerar las reacciones de productos energéticos y la formación de células, formando el grupo más grande e importante de moléculas de proteínas en el interior de las células como se puede mostrar en la figura 06. (Rittmann, 2001)
Debido a su naturaleza de la proteína, las enzimas son afectadas a sus mismos factores igual que a la proteína como: solventes, temperatura, sales, pH y otros componentes, que modifican la estructura química provocando una pérdida de la actividad catalítica.” (Novozymes, 1999; Belitz y Grosch, 1992).
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Figura 6
Estructura de una enzima [Sanchez, S. y Demain, A.L. “Enzyme and Microbial Technology”, 2002]
b) Clasificación de las enzimas Enzimas proteolíticas
Proteínas o enzimas proteolíticas que son catalizadores que rompen los enlaces peptídicos y contiene su propia especificidad, es decir actúan específicamente en determinadas uniones o enlaces peptídicos.
Proteínas o enzimas proteolíticas que son catalizadores que rompen los enlaces peptídicos y poseen su propia especificidad, es decir, atacan específicamente un determinadas uniones o enlaces peptídicos.
se mencionan dos tipos de proteasas: “las endopeptidasas atacan los enlaces peptídicos internos de las proteínas y descomponen a las proteínas en fragmentos peptídicos más pequeños, tienen una especificidad hacia los aminoácidos hidrofóbicos; y las exopeptidasas rompen los enlaces externos catalizando la eliminación de residuos aminoacídicos desde los extremos N o C terminales, denominadas aminopeptidasas y carboxipeptidasas respectivamente, dando como resultado aminoácidos individuales.” (Lehninger, 1970; Novozymes, 1999). En la figura 7, se muestra un esquema.
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Figura 7
Hidrólisis de proteínas con endo y exoproteasas “Clasificación Internacional de Enzimas”
[Lehninger, 1993]
Las enzimas utilizadas para la hidrólisis de proteínas son de diferentes fuentes así la papaína, ficina y bromelina son extraídas de plantas; la pepsina, renina, tripsina y quimotripsina son obtenidas de tejidos animales y finalmente, las enzimas de origen microbiano aisladas a partir de hongos o bacterias (Cheftel et al., 1989).
Las proteasas Comerciales
En la actualidad se tiene disponibilidad comercial muchas enzimas o proteasa de uso alimentario se muestra en la tabla 8. Las “proteasas pueden ser clasificadas de acuerdo a su origen (vegetal, animal, fúngico o bacteriano), de acuerdo a su acción catalizadora (endo o exo de acuerdo a su actividad). La acción de la endoproteasa hidroliza enlaces amídicos dentro de la cadena de las proteínas. La exoproteasa, a lo contrario, realiza acción de eliminación de aminoácidos terminales de la proteína o péptidos. Según la naturaleza centro catalítico de la proteasa esto difiere de acuerdo con los aminoácidos y otros aminoácidos ligados que intervienen en la formación de complejos enzimáticos del sustrato.”
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Tabla 8
Algunas de las proteasas disponibles comercialmente en grado alimenticio.
Tipo de Proteasa Nombre Fuente Tempi
’C)
Rango De pH
Sitio de acción catalitico Serinproteasa
Animal Tripsina Porcino, bovino 30-60 7.0-9.0 •Lis (o Arg)—
Quimotripsina 45-55 8.0-9.0 *Trp (oTir.Fe)
Elastasa 6.0-8.0 •Ala-
Bacteriana Substilisin. Carlsberg Bacillus Licheniformis 50-60 6.0-10.0 •AAhf- Alcalasa
Subst. BPN Bacillus 40-55 6.0-10.0
Substilisin Novo amyloliquefaciens Cisteinproteasas
Plantas Papaína Papaya 40-75 5.0-8.0 *Fe(oVal,Leu)
Bromelaina Pina 20-65 5.0-8.0 AAhf-
Ficina Látex de Ficus 5.0-8.0
Aspartato proteasas
Animal Pepsina Porcino, bovino 1.0
4.0 Fe(o Tir ,Leu )
*- Trp
Quimosina Becerro 4.0-6.0 (o Fe, Tir )
Fúngica Aspergilopeptidasa A
Aspergillus saito/ 35-50 2.0-5.0 Glu, Asp, Leu
Newlasa Rhizopus sp 40-50 3.0-6.0 Similar a la
peptidasa Métalo proteasas
Animal Carboxipeptidasa A Páncreas 7.0-8.0 "Carbonilo del
AA Terminal del péptido Excepto Pro, Arg,Lis
Bacteriana Neutrasa Bacillus
amyloliquefaciens 40-55 6.0-7.5 -Fe Leu ,Val *-- Termolisina B. thermoproteolyticus 7.0-9.0 lie Leu Val Preparaciones
enzimáticas Mezcla de Papaína, quimopapaina y lisozima .Mezcla de tripsina,
quimiotripsina, elastasa y Carboxipeptidasa.
Papaína cruda Fruto de la papaya 5.0-9.0 Muy amplia
especificad Pancreatina Páncreas (bovino) 30-80 7.0-9.0 Muy amplia especificad Veron P. Sumicina LP,
Biocína A
Aspergillus oryzae 40-55 4.0-8.0 Muy amplia especificad
Pronasa Streptomyces Griseus 7.0-9.0 Muy amplia
especificad Nota: tabla tomada de “Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana” [Universidad de Lleida – España, 2008].
Flavourzyme (proteasa microbiana)
Flavourzyme, “originada por Aspergillus oryzae es un complejo enzimático consistente de varias endoproteasas y exoproteasas, con especificidad de ambos tipos, amino y carboxipeptidasa. El pH óptimo del complejo enzimático está en el rango de 5,0–7,0 y la temperatura óptima está alrededor de 50°C.” (Novozymes, 1999).
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Las enzimas en los hidrolizados de proteínas
Es el estándar o parámetro que es utilizado para el control de los procesos de hidrolisis y también se utiliza como un indicador en los estudios de caracterización nutricional y funcional de hidrolizados proteicos. El grado “de hidrolisis en su proporción nos ayuda a medir el alcance del desdoblamiento hidrolítico de las proteínas y podemos definirlo como la cadena ramificada de enlaces peptídicos que se ha hidrolizado con respecto al número de cadenas o enlaces peptídicos hidrolizables. Se muestra como la especificidad enzimática, las características físicas y químicas del sustrato y los estándares de hidrolisis empleados, donde se encuentra la concentración de sustrato, concentración de encimas, temperatura y pH.
El grado de hidrolisis se clasifica de acuerdo a dos grupos: hidrolizados extensivos (GH>10%) y parciales (GH<10%). Y cada uno de estos presentan propiedades muy específicas que influyen su utilización.”
Los hidrolizados “parciales, se caracterizan por poseer pequeñas fracciones de aminoácidos libres y de pequeños péptidos, un amplio espectro de péptidos de tamaño medio y una gran cantidad de material de alto peso molecular, no tienen hipoalergenicidad. Debido a su baja viscosidad y sabor relativamente aceptable, se los usa como fuente de nitrógeno en productos nutricionales especiales para adultos o como suplementos; muestran un aumento en la solubilidad, capacidad espumante y emulsionante de las proteínas.” (Kinsella, 1976).
En los hidrolizados extensivos “estas propiedades disminuyen, los productos obtenidos están compuestos en forma mayoritaria por aminoácidos libres o péptidos pequeños (di y tripéptidos) de bajo peso molecular, como se muestran los datos en la Tabla 9. Presentan reducida alergenicidad por lo que son usados principalmente en fórmulas infantiles hipoalérgicas.” (Fox et al., 1982).
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Tabla 9
Perfil del peso molecular de diferentes proteínas hidrolizadas Hidrolizado
parcial Hidrolizado
extensivo Peso molecular de la fracción
(Daltons)
GH < 10% GH > 10%
% de cada fracción
< 500 3,8 90,2
500 - 1000 1,1 5,5
1000 - 2000 1,8 2,9
2000 - 3000 3,7 1,4
> 5000 89,7 0,0
Nota: Tabla tomada de “Elaboración de un suplemento alimenticio en polvo para consumo humano a partir de una mescla de hidrolizado de soya y almidón de maíz” [Munive, 2009, p.
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La determinación “del grado de hidrólisis se puede realizar mediante diversos métodos de análisis: la solubilidad en ácido tricloroacético, determinación del nitrógeno amino (NA) mediante valoración con formol, el método del ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS), el método de Balashingam que usa el para–dimetil amino benzaldehído, etc.” (Mahmoud, 1994).
Su estructura de un hidrolizado proteico se basa a su naturaleza de su estructura compuesta por aminoácidos, péptidos y esto en general proteína.
Las propiedades y características de los aminoácidos se basan en su naturaleza como iones radicales de ácido anfótero, y este tiene la capacidad de desarrollar cargas positivas y negativas dependiendo de su pH, lo que determina que 'tiene una propiedad conocida como punto isoeléctrico, donde positivo y las cargas negativas están en equilibrio o en equilibrio la carga neta es cero. Los aminoácidos con un pH por debajo o por debajo del punto isoeléctrico están en forma catiónica y cuando están por encima del punto isoeléctrico están en forma aniónica. (Stryer, 1985; Lehninger, 1970).
Liofilización
Es un “proceso donde se congela un producto y posterior a este proceso se introduce a cámaras de vacío, para proceder a la eliminación de humedad por acción de la sublimación. De esta manera se realiza la eliminación del agua desde su estado sólido al estado líquido. Como se muestra en la figura 6, para acelerar el proceso se utilizan ciclos de congelación y sublimación, para obtener y eliminar toda el agua libre que cualquier producto contiene en su estado inicial, pero aun así conserva la estructura molecular de la sustancia, seca se utiliza principalmente en la industria alimentaria para mantener sus propiedades
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originales. Esta es una técnica bastante costosa y muy lenta si quieres compararla con otros métodos de secado tradicionales, pero después de este proceso obtendrás un producto de mejor calidad que con el método tradicional porque no se absorbe el calor que se usa para desnaturalizar la mayoría de los nutrientes y composición organoléptica.” (Mancebo, María Fernanda, 1994).
Figura 8
“Seminario de liofilización, sociedad internacional de liofilización” [Jennings, Thomas A, 1993].
En el diagrama de fases la frontera entre el gas y liquido va desde el punto triple hasta el punto crítico. La liofilización (flecha azul) lleva el sistema alrededor del punto triple, evitando así la transición directa de líquido a gas de un secado tradicional (flecha verde).
1.2.4. Metodología de superficie de respuesta
Conocida como (MSR), “es una colección de técnicas de números y procesamiento de datos más utilizadas al modelizar y analizar los problemas en los que una respuesta de interés recibe el apoyo de distintos factores y donde el interés es optimizar esta respuesta.” (Senanayake y Shahidi, 2002; Montgomery, 2003, LiyanaPathirana y Shahidi, 2005, Bas y Boyaci, 2007; Fan, et. al., 2008).
La MSR “conceptualiza lo que sucede con las variables independientes, solas o en conjunto, en el proceso. Además de ello analiza los efectos de las variables independientes, este método experimental forma una ecuación matemática (Bas
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y Boyaci, 2007). En una expresión de números, se puede decir el que investiga está interesado en la supuesta” “relación funcional”:
𝑛 = 𝑓(𝑋1, 𝑋2, … . . , 𝑋𝑛 ) + 𝜀
Siendo “n” la respuesta, “f es la función poco conocida de respuesta, x1, x2,…, xn denotan las variables independientes, n es el número de las variables independientes y finalmente Ɛ representa el ruido o error estadístico que representan otras fuentes de variabilidad no cuantificadas por f”. “Estas fuentes vienen inmersos efectos tales como la medición del error. En general se tantea que el error tiene una distribución normal (con media cercana al cero y variabilidad uno)” (Bas y Boyaci, 2007).
Para Montgomery, (2003) “en la mayoría de los problemas de la MSR, la forma de la relación entre la respuesta y las variables independientes es desconocida. Por lo tanto, como primer punto en la MSR es mostrar una aproximación adecuada de la verdadera relación funcional entre Y y el conjunto de variables independientes,” Por lo general, “se emplea un polinomio de orden inferior en alguna región de las variables independientes”. Si la “respuesta se muestra muy bien modelada por una función lineal de las variables independientes, entonces la ecuación de aproximación es el modelo de primer orden:
𝒀 = 𝖰𝑶 + 𝖰𝟏𝑿𝟏 + 𝖰𝟐𝑿𝟐 + ⋯ + 𝖰𝒌𝑿𝒌 + 𝗌
Si hay curvatura en el sistema, entonces debe usarse un polinomio de orden superior, tal como el modelo de segundo orden”:
Las ecuaciones polinómicas de bajo grado son más prácticas de manejar respecto a las de grados mayores, debido a que mantienen pocos términos, lo cual se significa que el requerimiento de menos valores observados de la respuesta para estimar los parámetros (los β’s) de la ecuación (Box y Draper, 1987).” Por lo general, en “la superficie de respuesta, ɳ se representa gráficamente como en la Figura 07, en donde se tiene ɳ contra los niveles x1 y x2. Para ayudar a visualizar la forma de una superficie de respuesta, con frecuencia se recurre a los ploteos de contorno” (Montgomery, 2003).
38 a) Procedimiento secuencial
Muchas “veces cuando se está en un punto de la superficie de respuesta que está apartado del óptimo, como en el caso de las condiciones de operación que se observa en la figura 08, el sistema presenta una curvatura moderada y el modelo de primer orden será apropiado. “El objetivo en este caso el llevar al experimentador de manera rápida y eficiente por la trayectoria del mejoramiento hasta la vecindad general del óptimo.”
Figura 9
Superficie de respuesta tridimensional donde se indica la respuesta esperada ɳ como función de las variables x1 y x2, [Montgomery, 2003]
Figura 10
Gráfica de contorno de una superficie de respuesta, [Montgomery, 2003]
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Figura 11
El carácter secuencial de la Metodología de Superficie de Respuesta (MSR), [Montgomery, 2003]
Una vez encontrado el óptimo,” puede “emplearse un modelo más elaborado, como el de segundo orden, y llevarse a cabo un análisis para localizarse como el ascenso a una colina, donde la cima de ésta representa el punto de la respuesta máxima”. Si el verdadero óptimo es un punto de respuesta mínima, entonces la situación puede considerarse como el descenso a un valle (Montgomery, 2003). El objetivo último de la MSR es determinara las condiciones de operación óptimas del sistema o determinar una región del espacio de los factores en la que se satisfagan los requerimientos de operación.” (Montgomery, 2003; Liyana– Pathirana y Shahidi, 2005).
b) Diseño de composición Central
El diseño de composición central (DCC) “es el más utilizado en la etapa de búsqueda de segundo orden debido a su gran flexibilidad”: “se puede generar a partir de un diseño factorial completo 2k o fraccionado 2k – p agregando puntos sobre los ejes y al centro, además de otras propiedades deseables. Este diseño contiene tres tipos de” puntos:
Una “réplica de un diseño factorial en dos niveles, completo o fraccionado.
A esta parte del DCC se le llama porción factorial.
No puntos o repeticiones al centro del diseño, con n0≥ 1.
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Dos puntos sobre cada eje a una distancia del origen. Estos puntos se llaman porción axial. La manera en que se ensamblan y el DCC resultante se muestran en figura 10, para los casos de dos y tres factores.”
Figura 12
Mostrario y fabricación de los DCC para k=2 y 3 factores, [Montgomery, 2003]
“Con k factores el número total de corridas experimentales es N = 2k+ 2k + n0.” “El número de corridas al centro y la distancia de los puntos axiales (𝖺) deben escogerse de manera adecuada, dependiendo de las propiedades que se quieren en e l DCC. Si se quiere que el diseño sea rotable se toma 𝖺 igual a:
∝= (𝐹)1/4
Donde F es el número de puntos en la parte factorial. Si se desea que el DCC sea ortogonal se toma 𝖺 igual a”:
Donde N es el total de corridas experimentales. Si se desea que el DCC sea ortogonal y rotable, se deben cumplir las relaciones”,
1
∝=(𝐹)4 𝑦 𝑛0 ≈ 4√𝐹 + 4 − 𝐹
Las repeticiones en el punto central también se pueden escoger de manera que el diseño sea sustentable y de precisión uniforme.” Un diseño “es de precisión uniforme si var [̂𝑌ˆ(𝑥)] en el centro del diseño (radio r = 0), es igual a la varianza en la esfera de radio r = 1”. “Esta propiedad proporciona
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aproximadamente un valor constante de la var [̂𝑌ˆ(𝑥)] dentro de la esfera unitaria (de radio uno)”. Escoger para rotabilidad y precisión uniforme, o acercamiento uniforme es:
1
∝= (𝐹)4 𝑦 𝛿4(√𝐹 + 2) − 𝐹 − 2𝑘
Donde el valor de la constante 𝛿4 dado el número de factores k, se obtiene de la siguiente tabla:”
1 2 3 4 5 6 7 8
𝜹𝟒 0,7844 0,8385 0,8704 0,8918 0,9070 0,9184 0,9274”
c) Diseño de “composición central con centros en las caras.
En este diseño los puntos centrales se ubican en el centro de las caras, es decir, a = 1. Esta variante resulta particularmente útil cuando ya se corrió el diseño 2k y se quiere completar un DCC, pero se complica correr los tratamientos con niveles más allá de los valores –1 y +1 debido a restricciones del proceso.”
d) Diseño central compuesto pequeño.
Box y Draper, (1987) “proponen un diseño central compuesto cuya parte factorial se construye a partir de una factorial fraccionado que tiene resolución menor que V, las corridas axiales y al centro se determinan como el DCC”. En cuanto al número de corridas, este diseño es sin pensarlo una de las propuestas más rentables que se pueden aplicar para ajustar el modelo de segundo orden.
“Los tratamientos se pueden realizar con un paquete estadístico, por ejemplo, Statgraphics incluye este diseño como opción. La desventaja de este diseño es que algunos efectos de interés pueden ser alias”.