Se utilizó el método hipotético – deductivo y el explicativo. (Morales, i., 2018). Así mismo se detalla las diferentes metodologías trabajadas en la presente” investigación:
2.2.1. Análisis físico y fisicoquímico proximal de maca micro pulverizada ecotipo amarillo (lepidium meyenii walpers):
a) Análisis físico: Descripción física (aspecto, color, olor y textura), descritos en la ficha técnica de maca amarilla micropulverizada, proporcionada por la empresa Koken del Perú SAC.
b) Análisis de granulometría: para “la determinación del tamaño de partícula se utilizó el método recomendado por Kent, (2005), con algunas modificaciones, información proporcionada por la empresa Koken del Perú.
c) Determinación de humedad: método recomendado por referencia de NTP N° 205.002:1979.
d) Determinación de ceniza: método recomendado por referencia de NTP N°
205.004:1979.
e) Determinación de proteínas: método recomendado por AOAC, 1990.
f) Determinación de grasa: método recomendado por referencia de NTP N°
205.006:1980.
g) Determinación de fibra: método recomendado por referencia de NTP N°
205.003:1980.
h) pH: método recomendado por la AOAC (1997).
i) Acidez: método recomendado por la NTC 4106 – 1997.”
45
2.2.2. Proceso de aislado de la proteína de la maca amarilla micropulverizada: método tomado de Quispe y rojas (2013), con algunas modificaciones.
Materiales de laboratorio
Envase de acero inoxidable de capacidad 5 litros.
Materiales de vidrio: Vasos de precipitación, Pipetas, fiolas, bagetas, varillas y embudos.
Equipos
Agitador mecánico, adecuado para él proceso.
Centrifuga, marca centurión scintific modelo K24.
pH-metro, marca metrohm, modelo: 827.
Liofilizador, marca freeze dryer modelo BK-FD10PT.
Balanza analítica, marca pionner PA2014 blanco humo. Cap. 210 gr.
Reactivos
Hidróxido de sodio 6N (Merck).
Ácido clorhídrico 6N (Merck).
Agua destilada.
Procedimiento experimental en 2 etapas:
Etapa I concentración de las proteínas:
La maca amarilla micro pulverizada se somete a un proceso de concentración de la proteína por acción de ácido clorhídrico a 6N, para el desarrollo de este método se muestra la figura 12
46
Figura 13
Diagrama de flujo del proceso de concentración de proteína de maca ecotipo amarillo.
Etapa II aislado de la proteína:
El concentrado de proteína de maca se somete a un proceso de aislado de la proteína por acción de hidróxido de sodio a 6N, para el desarrollo de este método se muestra la figura 13.
Centrifugado 12000 rpm
acondicionado
Pasta proteica Sobrenadante
Liofilización
concentrado de proteína de maca Maca micro pulverizada
Suspensión I: 1:10 (P/V) Suspensión II: 1:5 (P/V)
Precipitación pH 4.5
Agitación 30 minutos Centrifugación 6000 rpm
Material insoluble sobrenadantes HCL 6N
Agua
Segunda extracción
47
Figura 14
Diagrama de flujo del proceso de concentración de proteína de maca ecotipo amarillo.
2.2.3. Análisis químico proximal del aislado de la proteína de maca Método utilizado AOAC, 1990.
2.2.4. Hidrolisis enzimático de la proteína aislada de la maca ecotipo amarillo
Se utilizó el método (Cheftel et al. 1989).
Materiales de laboratorio
Materiales de vidrio: Pipetas, vasos de precipitación, fiolas, bagetas, embudos y varillas.
Centrifugado 6000 rpm Precipitación pH 4,5
Pasta proteica Sobrenadante
Liofilización
aislado de proteína de maca Maca micro pulverizada concentrada
Suspensión I: 1:5 (P/V) Suspensión II: 1:4 (P/V)
Precipitación pH 9,4
Agitación 30 minutos Centrifugación 6000 rpm
sobrenadante residuo
NaOH 6N Agua
Segunda extracción
48 Equipos
Reactor se adecuo con una caja de Tecnopor.
Baño maría marca thermo Fisher modelo GEN10SUV.
Incubadora marca digisytem laboratory instruments modelo DSI- 300D.
Termómetro digital con pincetas, marca center modelo 308.
Agitador magnético marca Velp scientifica.
Centrifuga, marca centurión scintific modelo K24.
pH-metro, marca metrohm, modelo: 827.
Liofilizador, marca freeze dryer modelo BK-FD10PT.
Congelador, marca DEEP FREEZER modelo BDF-86V58.
Balanza analítica, marca pionner PA2014 blanco humo Cap. 210 gr.
Reactivos
Hidróxido de sodio 6N (Merck)
Ácido clorhídrico 6N (Merck)
Agua destilada.
Enzima
Flavourzyme (protease from aspergillus oryzae) Merck.
Procedimiento experimental
La metodología del proceso de hidrolisis de la proteína aislada de la maca (Lipidium meyenii Walpers) ecotipo amarillo, por acción de concentraciones enzima/sustrato y control de temperatura, pH y tiempo, este procedimiento se muestra en la figura 14.
Hidrólisis Enzimática: “La Hidrólisis se realizó de 50 a 60 °C (Novozymes, 1999), se adecuo un biorreactor en una caja de Tecnopor.
El sustrato a la concentración optima, tras la adición de la enzima en los niveles a determinar de 0.5 a 1.5%, a una relación (E/S).
Inactivación Térmica: Luego del proceso de la hidrólisis enzimática y aplicando la relación enzima/sustrato (E/S) para los niveles de concentración de enzima, tiempo, temperatura y pH, se realizó la inactivación de la enzima por 5 minutos a 85 °C con agitación contante (Novozymes, 1999), mediante esta operación se puede detener la acción enzimática sobre el sustrato.
Enfriamiento: El hidrolizado obtenido fue enfriado en baño maría a 20 °C
49 de temperatura.
Centrifugación: Posteriormente se realizó la centrifugación del hidrolizado a 6000 rpm durante 10 minutos para obtener la pasta de hidrolizado proteico.
Liofilización: El hidrolizado se sometió al secado por liofilización, ya que, al no emplear calor, evita en gran medida las pérdidas nutricionales y organolépticas.”
Figura 15
Diagrama de flujo del proceso de hidrolisis de la proteína de maca ecotipo amarillo.
2.2.5. Grado de hidrolisis: método recomendado por (Kim et al., 1990).
Materiales de laboratorio
Materiales de vidrio: Pipetas, vasos de precipitación, fiolas, bagetas.
Equipos
Baño maría marca thermo Fisher modelo GEN10SUV
Incubadora marca digisytem laboratory instruments modelo DSI- 300D.
Termómetro digital con pincetas, marca center modelo 308.
Agitador marca Velp scientifica.
Centrifuga, marca centurión scintific modelo K24.
pH-metro, marca metrohm, modelo: 827.
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Balanza analítica, marca pionner PA2014 blanco humo. “Cap. 210 gr.
Espectrofotómetro Reactivos
Acido tricloroacético (TCA) al 10% (Merck)
Agua destilada
Procedimiento experimental
El grado de hidrólisis se determinó mediante el método descrito por (Kim et al., 1990), midiendo la proteína soluble de muestras tratadas con ácido tricloroacético (TCA) al 10%. El procedimiento se realizó de la siguiente manera:
Retirar 2 mL de proteína hidrolizada y agregar 2 mL de TCA, agitar la mezcla por 10 min y centrifugar a 5000 rpm por 10 min en una centrífuga para separar la proteína soluble del precipitado, como se indica (Anexo 9 ). El sobrenadante y las proteínas solubles en proteínas totales se determinaron espectrofotométricamente a 330 nm. (Anexo 10). El grado de hidrólisis es calculado aplicando la ecuación:
Para la determinación de la proteína total se realizó una hidrólisis ácida a fin de que la proteína se hidrolice completamente en sus aminoácidos constituyentes. Se mezcló 0,05 g del sustrato óptimo con 2 mL de HCl 6 N en ampolletas que serán cerradas herméticamente y calentadas a 100 °C por 48 horas en una estufa.” (Wilchek y Miron, 2003).
2.3. Diseño de la investigación