Enzimas

Por todas esas características, RAFT es una alternativa muy útil y efectiva. Este conj unto de estrategias junto con RDRP han permitido la síntesis de bio-macromoléculas con alto potencial tecnológico y comercial.

4

o o .

1

L

^{r -}

Primaria Secundaria

Alpha hhil

TJ

Terciaria Cuaternaria

Figura 2-7. Principales estructuras encontradas en las proteínas.

Las enzimas pueden catalizar de manera independiente o por medio de un cofactor o coenzima, los cuales actúan como "acarreadores" de un grupo específico en la función catalítica de la enzima. El sitio más importante de estas es llamado sitio activo, el cual contiene grupos sustituyentes que enlazan al sustrato y catalizan su transformación química. Lá actividad enzimática depende de varios factores entre los que se encuentran la temperatura, el pH, la concentración de sustrato, entre otras. Donde la sensibilidad a estos factores en un medio biológico determina su eficiencia catalítica [38]

2.2.1. Actividad Enzimática

La actividad catalítica de las enzimas fue observada por Leonor Michaelis y Maud Menten (1913) quienes postularon una expresión matemática basada en un estado estacionario para la determinación de la velocidad enzimática de reacción. Ellos proponen la formación de un complejo intermediario (ES) entre el sustrato (5) y la enzima (E) durante el proceso de conversión, dicho complejo es reversible. Al descomponerse ES, la velocidad de reacción (V) se mantiene constante a ciertos pasos de reacción, coincidiendo con la velocidad inicial (Vo) de manera que al aumentar la concentración inicial de sustrato se desplaza el equilibrio hacia la formación de ES al igual que Vo alcanzando un valor constante el cual se conoce como velocidad máxima (V max). En este punto la enzima se encontrará en condiciones de saturación de sustrato, por lo que un aumento en la concentración de este ya no tendrá efecto en la catálisis. Este valor no es fácilmente medible por lo que Michaelis —Menten, determinan que la concentración de sustrato en este punto es determinada por una constante Km la cual relaciona V maxl2 y

es única para cada afinidad de determinado sustrato. Lo anterior es expresado en lo que hoy se conoce como la ecuación de Michaelis-Menten:

Vmax [S]

V 0

Km

+ [

4

Esta ecuación puede ser transformada algebraicamente en una ecuación experimentalmente más práctica, mediante la derivación y reacomodo simple de los recíprocos de ambos lados de la ecuación, a partir de esto se obtiene la ecuación de Lineweaver - Burk:

L_

^___

yo - VMAX VMAX

La cual permite obtener parámetros importantes de una reacción enzimática como son la V máx y la constante de Michaelis-Menten Km , 111

Dentro de las enzimas más importantes se encuentran las proteasas cuya función es romper enlaces amidas para reducirlos a aminoácidos o cadenas polipéptidicas para la formación de proteínas de menor tamaño, y las oxidorreductasas, las cuales catalizan el proceso de óxido —reducción en determinadas reacciones biológicas. Entre las enzimas proteasas más importantes se encuentran las cisteínas proteasas como las catepsinas, bromelaina y la papaína. De igual manera para las oxidorreductasas existen la glucosa-oxidasa, alcohol deshidrogenasa y la L- lactato —deshidrogenasa.

2.2.2. Papaína

La papaína (EC 3.4.22.2) es una cisteína proteasa hidrolasa, está basada en la requisición de un grupo tiol residual para su actividad catalítica, también conocida como sulfidril proteasa, se encuentra principalmente en el látex de la fruta Carica papaya. Está enzima ha sido estudiada ampliamente ya que presenta una alta actividad proteolítica, ha sido utilizada en la síntesis de péptidos, oligómeros y como biosensor.

Su actividad enzimática puede ser determinada por la velocidad de digestión (rompimiento) de proteínas o por la hidrólisis de sustratos como esteres o amidas derivados de aminoácidos. Está proteína consiste de una cadena simple de péptidos de 212 residuos, y un grupo tiol en su centro activo. Tiene un peso molecular de 23 kD ± 1000 D (1 D= g/mol en unidades) y su estructura conformacional es estabilizada por tres puentes disulfuro. La cadena principal esta plegada, en dos formas principales formando una hendidura, donde se encuentra el sitio activo (triada Cisteína (Cys —25), Asparagina (Asp-158 e Histidina

(His-159) Figura 2-8. Puede funcionar entre pH 6 - 8, se activa en presencia del aminoácido cisteína, y se inhibe en presencia de metales pesados que pueden reaccionar con los grupos sulfidrilos ^[39,401

4

HN

-

H2N

NWH

Figura 2-8, Estructura tridimensional y mecanismo de reacción de la papaína Carica papaya.

2.2.3. L-lactato-deshidrogenasa (LDH)

La forma activa de la LDH está conformada por cuatro sub-unidades monómericas (tetrámero), cada unidad está provista de un centro activo, y un peso molecular aproximado de 36 kD. Para llevar a cabo su actividad catalítica, es co-catalizada por el cofactor Nicotinamida adenina dinucléotido (NADH), donde dependiendo de las condiciones puede actuar en la reducción de piruvato a lactato o en su forma reducida (NAD) en la reacción inversa (Figura 2-9). Existen 2 sub-unidades las cuales se distinguen principalmente del tejido obtenido, es decir, la sub-unidad M (músculo) es producida en tejidos encontrados en el riñon y los músculos esqueléticos, contrario a la sub-unidad H (Heart, corazón), la cual es producida en dicho órgano.

Su centro activo está conformado por la triada Arginina (Arg -109), Histidina (His-195) y Arginina (Arg- 171), los cuales anclan en sustrato lactato y el cofactor NADH, llevando a cabo el proceso de conversión.

La LDH es ampliamente utilizada en el análisis de L-lactato en sangre, el cual es un factor importante en la determinación de ciertas enfermedades. Un ejemplo de ello, es el sistema cardiovascular, donde un indicio de la presencia de actividad enzimática encontrada en suero, puede ser síntoma de daño producido en determinado órgano.

MW MP

14

1 11 Mi

1 -

NAD-

NA1 + I1 + 21 .--.-.-...-'- ^NAUJI

HIC ^1.1)11 HC,Jt

NAIY NADIJ

Figura 2-9. Estructura tridimensional y mecanismo de reacción de la L-lactato deshidrogenasa.

- Una de las características que son frecuentemente buscadas en las enzimas es la conservación de su actividad biológica, así como su estabilidad a diversas condiciones de reacción 1 ^{38, 401} Existen métodos, como la inmovilización que son aplicados inclusive a nivel industrial. A nivel terapéutico se están desarrollando sistemas que involucren a las enzimas como biosensores, los cuales determinan de manera rápida la presencia de arialítos, disminuyendo el tiempo de análisis y pronta obtención de resultados, he aquí donde las enzimas en conjunto con medios sintéticos como los polímeros están siendo investigados, mediante una técnica relativamente nueva conocida como bioconjugación.