modificado se purificó mediante precipitación/disolución en dos ciclos, utilizando cloruro de metileno/éter etílico como disolventes.
s
C4H9S
CH3 OH
DMAP/EDC
OH n
Figura 4-3. Reacción de esterificación de PVPCOOH con alcohol bencílico en presencia de DMAP/EDC.
Rendimiento 54%
1HRIvIJ\T5 (ppm) 7.4-7.2 (IOH, ArH), 4.8 (21-1, ArCH20), 3.9 (IH, -C(=S)-S-CH-N), 3.28 (CH2-N-), 3.24 (CH2-S-), 2.5(C1-1-CH2-CH), 2.16 (CH2-C=0), 2.1(CH2-CH2) 31.22 (CH3-CH-COOH), 1.1(CH3-CH2- CH2)
4.6.2. Activación del grupo ácido-terminal mediante el uso de ésteres activos de N- hidroxisuccinimida (NHS).
La reacción de activación del grupo carboxil se realizó disolviendo PVPCOOH-1 (0.3 g, 1.18x10 mol) y N-hidroxisuccinimida (0.0859 g, 0.746 mmol) en CH2Cl2 (5 mL). Esta mezcla se mantuvo en agitación magnética constante, hasta alcanzar la disolución total de los reactivos. Posteriormente la mezcla se colocó en un baño de hielo a una temperatura < 5.0 °C. A continuación se agregó 1-[3- (dimetilamino) propil]-3-etilcarbodiimida hidrocloruro (0.140 g, 7.30 x 10- mol), la reacción se mantuvo en agitación por una hora a esta temperatura, posteriormente se retiró del baño de hielo y la reacción se dejó completar a temperatura ambiente por un periodo más de 5 horas.
Una vez activado el PVPCOOH-1 con la NHS se precipitó en éter etílico y se secó durante 24 h a 40°C.
La EDC y NHS sin reaccionar se eliminaron por ultrafiltración a través de membranas de fibras huecas con restricción de peso molecular
lx
iO3 como límite de corte (AIG Technology Corporation, Needharm, MA, USA). El producto retenido se liofilizó (73.0 % eficiencia). La conjugación de PVPCOOH-l-NHS (0.250 g, 9.82 x 10 5 mo!) con papaína (0.lg, 4.16 x 10.6 mol) se realizó disolviendo ambos productos en buffer de fosfatos salino (PBS) (60 mL, 0.1M pH 7.5) y la mezcla se incubó durante 2 horas a 5°C.Posteriormente la mezcla de reacción se purificó mediante ultrafiltración utilizando membranas de fibra hueca con restricción de peso molecular 3x104 daltons (AIG Teclinology Corporation, Needharm, MA, USA) con el fin de separar el polímero (PVPCOOH-l-NHS) y a la papaína sin reaccionar o no bioconjugada. La cantidad de proteína conjugada fue evaluada mediante el método de microensayo Biorad (Anexos).
4.6.3. Determinación del grado de conjugación mediante el Ácido Trinitrobencenesulfónico (TNBS).
La determinación de la cantidad de grupos aminos conjugados a PVPCOOH- 1 se llevó a cabo mediante el método de Habbeb y col [861
Para ello se preparó una solución al 0.1% de reactivo TNBS en una solución al 4% de NaHCO3, pH 8.5. En un tubo de ensayo con rosca, se colocó 1 mL de la solución de TNBS al cual se le adiciono 1 mL de NaHCO3 y 1 ml de solución de enzima o bioconjugado según sea el caso, se homogenizó la mezcla y los tubos fueron llevados a un baño de aceite precalentado a 40°C por 2 h. Transcurrido el tiempo a los tubos se les agregó 1 mL de dodecil-sulfato de sodio (SDS) al 10 % para solubilizar la proteína y prevenir su precipitación, subsecuentemente se adicionó 0.5 mL de 1-ICJ 1N. La lectura de las muestras se llevó a cabo mediante Uy-visible a una longitud de onda de 335 nm, la cual es característica del grupo trinitrobenceno. La cuantificación se realizó mediante la ley de Beer. La reacción se muestra en la Figura 4-5:
0 0
N 0
R-NH +
so31. R-HN ¡
O_ N L N 0
II II ti It
o 0 0 0
TNRIQ Derivado color naranla 1
Figura 4-5 Reacción del ácido trinitrobencensulfónico en presencia de grupos aminos libres
4.6.4. Evaluación Catalítica del conjugado PVP-COOH—papajna (P-PVPC) y su comparación con la enzima nativa
La actividad catalítica de la enzima nativa y del bioconjugado se determinó utilizando N-Benzoil- Arginina-p-Nitroanilina (BAPA) como sustrato, determinando la absorción a 410 nm de la p-nitroanilina, formada durante la hidrólisis del sustrato (Figura 4-6). Esta actividad proteasa se expresa en unidades BAPA producidas por unidad de tiempo, el ensayo está basado en el método de Earlanger y col [87], adaptado para papaína. Para el cálculo de las unidades BAPA se utilizó la siguiente ecuación 9:
Unidades BAPA
= Atmtn*1000* - VR
8800
Ecuación 9.
Donde A es la absorbancia obtenida a 410 nm de la p-nitroanilina liberada, t es el tiempo estimado de reacción, 1000 es el factor de conversión (mL a L), VR es el volumen de reacción (3 mL) y 8800 cm' es el coeficiente de absorción molar de la p-nitroanilina a 25°C. La actividad catalítica representa el tiempo que tarda 1 mol de papaína en convertir un micromol de BAPA a nitroanilina y se expresa como tmol*L
tmin'. En algunos casos la actividad se reportó como actividad específica en porciento que relaciona la actividad catalítica con la cantidad de proteína presente en el medio, expresada como unidades BAPA/ mg de proteína o U/mg.
La solución de BAPA (0.0435g) se preparó disolviendo este compuesto en dimetilsulfóxido (DMSO) (1 mL) y ajustado el volumen total a 100 mL con una solución conteniendo L-Cisteína hidrocloruro (5mM) y ácido etilendiaminetetracético (EDTA) (2 mM), disueltos previamente en buffer Tris 50 mM, pH 7.5 (99 mL). La formación de p-nitroanilina se realizó mediante espectroscopia UV-Vis monitoreando el cambio de absorción a X 410 nm en el trascurso de 30 mm. El medio de reacción consistió de: 2.5 mL de buffer Tris, 0.25 mL de solución BAPA y 0.25 mL de solución de P-PVPC (1 mgI mL) o papaína (1 mg/mL). Con excepción de los casos en donde se indique lo contrario.
H .
NO2
H2C H
Papaína
CH2 H2C
NH H2N NH
BAPA
Sitio activo p -nitroanilida
Figura 4-6. Reacción catalítica de la papaína en presencia de N-benzoil-p-nitroariil ida (BAPA)
4.6.5. Evaluación de la estabilidad y respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a diferentes temperaturas
El ensayo de respuesta a la temperatura se realizó en un intervalo de 35 a 85 °C. A una concentración de 5 mM de solución BAPA, manteniendo las concentraciones de L-cisteína (5mM), EDTA (2mM) y condiciones de reacción constantes.
4.6.6. Determinación de las constantes cinéticas de Michaeles-Menten (Km) y Velocidad máxima de reacción (Vmax) para P-PVPC y papaína libre
Para la determinación de las constantes cinéticas se prepararon concentraciones de la solución
intervalo de 2mM a 5 mM y manteniendo las concentraciones de L-cisteína (5mM) y EDTA (2mM) constantes. La reacción se llevó a cabo a 65 oc en un tiempo de reacción de 30 mm.
4.6.7. Evaluación de la estabilidad y su respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a diferente pH
El ensayo de respuesta se realizó en un intervalo de pH 4.0 - 8.5 A una concentración de 5 mM de solución BAPA, manteniendo las concentraciones de L-cisteína (5mM), EDTA (2mM) y condiciones de reacción constantes (65°C y 30 mm). El sistema de buffers utilizado fue el siguiente: citrato (pH 4.0- 6.0), buffer fosfato de sodio (pH 6.4 - 7.0) y buffer TrispH (7.5 - 8.5).
4.6.8. Evaluación de la respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a metales presentes en el medio
La respuesta a metales de P-PVPC y papaína libre se realizó de la siguiente manera: se prepararon soluciones de 10 mg U', 5 mg U' y 2.5 mg U' de sales de plata (NH4Ag), cobre (CuC12) y magnesio (HgCl2). Posteriormente en una gradilla se colocaron tubos de ensayo conteniendo 2.5 mL de sustrato (solución BAPA), 0.25 mL de la solución de metal, los cuales se llevaron a un baño de aceite precalentado a 65°C, para su temporización. Consecutivamente se agregaron 0.25 mL de solución de P- PVPC o papaína libre (previa temporización (5 segundos máximo) para evitar el choque térmico) y la reacción se continuó por 30 mm. Transcurrido el tiempo los tubos fueron retirados del baño e
* inmediatamente fueron agregados a cada tubo una solución de ácido acético 30% (y/y) (1 mL) para detener la reacción enzimática. Se leyó la cantidad de p-nitroanilina formada a los 30 minutos de haberse detenido la reacción.
4.6.9. Evaluación de la estabilidad de P-PVPC y papaína libre a 37°C y 40°C
La evaluación de estabilidad del bioconjugado fue evaluada a 37°C y 40°C durante un periodo de 30 días con medición de actividad cada 5 días. Una solución de 1 mg/mL de P-PVPC y papaína fueron colocadas dentro de una incubadora para mantener la temperatura constante. El medio de reacción contenía 2.5 mL de buffer Tris, 0.25 mL de solución BAPA y 0.25 mL de solución de P-PVPC (1 mg/
mL) o papaína (1 mg/mL) los cuales reaccionaron durante 30 minutos. Transcurrido el tiempo los tubos fueron retirados del baño e inmediatamente fueron agregados a cada tubo una solución de ácido acético 30% (y/y) (1 mL) para detener la reacción enzimática. Se leyó la cantidad de p-nitroanilida formada a X 4lOnm.
4.6.10. Bioconjugación de PVPCOOH-2 con lactato deshidrogenasa de músculo de conejo (Oryctolagus cuniculus)
La activación de LDH se realizó de acuerdo al procedimiento descrito en la sección 4-6 para la papaína y es presentado en la Figura 4-7. En una reacción típica se mezclaron PVPCOOH-2 (0.680 g, 8.30 x10 5 mol) y NT-lS (0.01467 g, 1.30 x 10 4mo1) en C1-1202 (5 mL). Posteriormente, la mezcla se incubó a una temperatura de < 10°C en un baño de hielo. Consecutivamente se agregó una solución de EDC (0.02435 g, 1.30 x 10 mol) previamente disuelto en CH202 (2 mL). La reacción continúo durante 5 h a estas condiciones. Transcurrido el tiempo el baño fue retirado y la reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 21 h, el polímero activado se purificó mediante ciclos de solución / precipitación con éter etílico / cloruro de metileno (el proceso se repitió dos veces), para finalmente secarlo a vacío. La eliminación del EDC y NHS sin reaccionar se llevó a cabo utilizando un sistema de ultrafiltración a través de membranas de fibras huecas con peso molecular
lxi
como límite de corte (A/G Technology Corporation, Needharm, MA, USA). El producto retenido se liofilizó. El rendimiento de la reacción para obtener PVPC001-1-2-NHS alcanzo el 79.0 %. Subsecuentemente PVPC00H-2-NHS (0.540 g, 6.60 x 10mol) y LDH (300 ptL, 0.0033 g, 2.64 x 10.8 mol) se disolvieron en buffer Tris HC1 (30 mL, 0.02 M pH 7.3) y la mezcla se incubo a una temperatura de < 10°C durante 3 h.
s ço o
si-EDCINHS o—N
o
11CkMe2 5°C
1
ço 2
Tris HCI LDH10°C
Figura 4-7. Reacción de bioconjugación de PVPCOOH-2 con L-lactato deshidrogenasa
4.6.11. Evaluación Catalítica del conjugado L-PVPC y su comparación con la enzima nativa
LDH cataliza la reacción reversible de piruvato a lactato en donde utiliza como cofactor NADH (Nicotinamida adenina dicnucleótido en su forma reducida), el cual participa en el intercambio de electrones durante la reacción química, este compuesto absorbe fuertemente 340 nm en la región del ultravioleta. Én la reacción inversa, lactato a piruvato, la LDH reduce el cofactor NAD (Nicotinamida
adenina dicnucleótido en su forma oxidada) a NADH observándose en UV un incremento en la absorbancia a 340 nm durante el proceso de reducción (Figura 4-8). En este trabajo, la actividad catalítica de LDH-PVPC y LDH nativa se determinó utilizando L-lactato como sustrato y NAD como cofactor. El coctel de la reacción consistió de 2.75 mL de buffer Tris-HCI (20 mM, pH 7.3), 100 ILL de solución de NADH o NAD (6.6 mM, en buffer Tris- HCI (0.02 M, pH 7.3), y 100 1tL de L-lactato (30 mM, en buffer Tris-HCI (20mM, pH 7.3)), y 50 .iL de solución de L-PVPC o LDH (1 mgI mL en buffer Tris-HCI (20 mM, pH 7.3)). Para las evaluaciones de temperatura y obtención de parámetros cinéticos se utilizó el procedimiento descrito anteriormente.
ADP ---
O ADP
Ribo ADP
RIbo
J-o
Reducción
0.
/NH2
OH OH
NAD
NAD+H+2e - NADB
H3c ç0 LDH H3c\10
NAD NADH OH
Figura 4-8. Reacción química reversible catalizada por la enzima L-lactato deshidrogenasa (LDH) en presencia de NAD y piruvato
!;.Resultados y
D iscusión
5.1. Polimerización RAFT de poli(N-vinil-pirrolidona) con un ácido carboxílico terminal. Utilización de agentes de tipo tritiocarbonato (ATC-1) y xantato (ATC-2)
La N-vinil-pirrolidona, al pertenecer a los monómeros no conjugados del grupo de las N-vinil amidas, se caracteriza por poseer un átomo de nitrógeno enlazado directamente al grupo vinílico y difiere de las acrilamidas al no estar conjugado con el grupo carboxilo; de manera que la polimerización vía radicales libres produce polímeros con alto peso molecular y con un porcentaje de funcionalización menor al 40 %. Además, estos monómeros no son capaces de formar radicales estabilizados por resonancia o efectos inductivos, por lo que su polimerización mediante RDRP no se ha logrado de forma eficiente, es decir el control de peso molecular y el índice de polidispersidad en la mayoría de los casos no se ha controlado, esto atribuido a que predominan las reacciones de transferencia hacia el solvente y al monómero.
Desde el uso de los tioles como agentes de transferencia, el diseño y uso de los de tipo tritiocarbonato ha demostrado gran utilidad en la obtención de polímeros controlados y funcionalizados. Por lo que en este trabajo, se utilizó el agente de transferencia denominado ATC-1 el cual contiene una función ácido carboxílico en su estructura para la polimerización de NVP en masa. Con esto, se otorgó la funcionalidad al polímero obtenido y además permitió realizar la unión con grupos aminos libres presentes en la enzima papaína. Por lo que a continuación se describen los resultados obtenidos.
5.1.1. Polimerización vía radicales libres en masa de N-vinil-pirrolidona (NYP) empleando ATC-1.
5.1.1.1. Caracterización de poli (vinilpirrolidona) (PVPCOOH-1)
La reacción de polimerización mediada por el agente ACT-1, para la obtención del poli (NVP) el cual fue denominado PVPCOOH-1 se esquematiza en la figura 5-1. Donde el polímero, resultó ser un polvo sin olor de color blanco, el cual al ser caracterizado mediante RMN 'H permitió asignar las señales con las correspondientes al PVPCOOH-1 (Figura 5-2). El protón del metino unido al átomo de nitrógeno del anillo heterocíclico (d) se asoció con la señal ubicada a 33.2 ppm, la señal a 33.8 ppm se relacionó con el metileno unido directamente al nitrógeno y que forma parte del anillo (b), mientras que las señales a 5 1.9 (a) y 32.5 (c) ppm respectivamente se relacionaron a los metilenos pertenecientes a el anillo de la pirrolidona, empalmándose a su vez con el metileno de la cadena alifática (e). Las señales asignadas al
adyacente al átomo de azufre de la cadena hidrocarbonada no fueron observadas, atribuido esto al alto peso molecular del PVP (22 000 glmol).
s CH3
AIBN, 60°C » C4H9S
XS OH
ATC-1
ço OFigura 5-1. Esquema de reacción de la polimerización de NVP utilizando ATC-1
Figura 5-2. Espectro de 'H RMN para PVPCOOH-1 en CDC13 a 300 MHz
Para corroborar la estructura del PVPC00H-1 y en particular la presencia del grupo carboxilo en este polímero, el material se caracterizó por medio de análisis FTIR. La Figura 5-3 muestra el espectro obtenido para PVPCOOH-1, en donde se pueden observar las señales correspondientes al PVP y el cual presenta los siguientes picos. La poli (NVP) tiene la capacidad de absorber hasta un 40% de su peso en agua, esto debido a los grupos carboxilos presentes en su estructura. En base a esto la primera señal a 3462 cm' puede ser atribuida al estiramiento (—O-H) formado por puentes de hidrógeno intermoleculares, formados por el grupo carboxilo del anillo y el hidrógeno del agua absorbida durante su exposición a la atmósfera; la presencia de las señales a 2950 cm' y a 1422 cm' representan los movimientos de
1673 cm es asignado como la flexión del enlace carbonilo (—C=O) presente en el anillo adyacente al nitrógeno. Sin embargo la presencia de la funcionalidad ácida, no fue observada de igual manera por ésta técnica, por lo que el uso de un experimento alterno para determinar la presencia de la funcionalidad requerida.
o
Ca
E
(1)=
1
1-
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Numero de onda (cm 1)
Figura 5-3. Espectro de FTIR-ATR para PVPC00H-1 5.1.1.2. Estudio cinético de la polimerización de NYP en presencia de ATC-1
Los resultados del estudio cinético de la polimerización de NVP en presencia del agente tritiocarbonato ATC-1 se muestran a continuación. Esta reacción se llevó a cabo a 60°C y se empleó AIBN como iniciador. La principal característica de esta polimerización es la ausencia de color en el medio de reacción, lo que sugiere que el ATC-1 se consumió en su totalidad. Este fenómeno se podría atribuir a la baja capacidad del radical carboxilo formado durante la fragmentación de ATC-1 para reiniciar la polimerización de PVP I881 Otra característica a resaltar es el incremento repentino de la viscosidad del medio en un tiempo muy breve (3 horas) de iniciada la reacción, esto se atribuyó a un incremento repentino del peso molecular producido posiblemente por reacciones de terminación entre cadenas poliméricas E91
A las 12 horas de iniciada la reacción, se observó una alta viscosidad en el medio cuando se alcanzó un 40% de conversión, lo que sugiere que esta y el peso molecular del polímero producido se incrementaron rápidamente. Este comportamiento se puede atribuir a un proceso de autoaceleración en la velocidad de
sistema, situación comparable a una polimerización vía radicales libres. Este efecto se observa en mayor medida en polimerizaciones en masa [90]
Este comportamiento influyó en las características del polímero obtenido lo cual resultó en altos pesos moleculares (Mn) e índices de polidispersidad (PDI). Los resultados para los polímeros obtenidos son presentados en la Tabla 5-1. Estos resultados no concuerdan con las características esperadas en una polimerización de tipo RDRP, por lo que posiblemente este fenómeno se deba a un intercambio lento entre el agente ATC-1 y el radical propagante de PVP, lo cual dio como resultado la formación de un intermediario estable, minimizando así la capacidad de desactivación y por ende un pobre control de la polimerización [911
Tabla 5-1. Pesos moleculares y polidispersidad obtenidas para PVPCOOH-1, polimerizado en masa en la presencia de ATC-1 y AIBN a 60°C
2 150 1242 4685 1.9 6.03
5 150 3453 8322 1.6 20.72
12 150 6297 10363 1.7 36.35
24 150 6495 22591 1.5 38.97
aAZObjS (isobutironitrilo) (AIBN) concentración 7.5 x10 M. CMLWC [M]0/[RAFT] x convn x 111 + 239. °GPC en DMF como eluente a 40°C y estándares de PMMA. e Conversión del monómero determinada gravimétricamente
Lo anterior se confirmó mediante el análisis del peso molecular e índice de polidispersidad obtenidos por GPC para el PVP en presencia de ATC-1 a lo largo de la reacción de polimerización (Figura 5-4). El Mn se incrementó con el tiempo hasta alcanzar una conversión final de monómero del 39% en un periodo de 24 h. Por otro lado el PDI fue alto a bajas conversiones de monómero, pero disminuye gradualmente con el tiempo. Este comportamiento es clásico en polimerizaciones con características "vivientes", en donde el PDI disminuye conforme aumenta el porciento de conversión y el peso molecular. Sin embargo la presencia de altos pesos moleculares (tres veces mayor al esperado), sugiere un periodo de iniciación rápido y una terminación bimolecular (cabeza-cabeza) entre cadenas propagantes. Esto trae como consecuencia cadenas de alto peso molecular, y a su vez indica que la velocidad de transferencia no fue lo suficientemente rápida en comparación a la velocidad de propagación [92]
Por otro lado en la curva teórica de Mn contra conversión (Figura 5-4) se aprecia un incremento lineal conforme aumenta la conversión. Este comportamiento no concuerda con el Mn experimental calculado
por medio de análisis de GPC. El doble de incremento de Mn al 40 % de conversión, sugiere una posible autoaceleración (4 punto) en el proceso de la polimerización o un mayor porciento de reacciones de terminación biomoleculares, lo cual podría ser provocado por efectos difusivos dentro del sistema de reacción, lo que significa que al alcanzar altos pesos moleculares hay un incremento en la viscosidad del medio por lo que las cadenas solo reaccionan con monómeros propagando aceleradamente y por ende incrementando el peso molecular de forma repentina [931
25000
MnGPC 20000 PDI
15000 5
O) 5
10000 4
5
3 55000
2
O 1
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Conversión
Figura 5-4. Grafica de Peso molecular y PDI contra conversión de NVP con AIBN a 60°C en presencia de ATC-1
De igual manera, en la misma gráfica se observa el comportamiento del PDI (Figura 5-4) el cual presenta una disminución conforme aumenta el grado de conversión con respecto al tiempo. Esto también se puede atribuir a la participación de una polimerización viviente vía radicales libres, es decir, una rápida iniciación acompañada de la disminución de las reacciones de terminación e intercambio rápido durante el equilibrio entre especies durmientes y activas [94]
Sin embargo para una de polimerización controlada, los valores de PDI deben ser inferiores a 1.5, valor que no se alcanzó aun después de 24 h de reacción. Reportes en la literatura mencionan que la velocidad de polimerización está determinada no solo por la concentración de agente de transferencia sino también por la naturaleza del grupo saliente. En nuestro caso, la relación monómero/CTA-1 fue de 150, lo que podría sugerir que la velocidad de polimerización se vio disminuida en comparación con una
polimerización vía radicales libres de NVP. Sin embargo el efecto de autoaceleración es comúnmente observado en una polimerización viviente vía radicales libres a bajas concentraciones de agente de transferencia, por lo que en este caso la presencia de ATC-1 no minimizó este comportamiento aún a conversiones relativamente altas (40%) [90, 92, 94]
La Figura 5-5 muestra los resultados de caracterización mediante cromatografia de permeación en gel (GPC) del PVPCOOH-1 a diferentes tiempos de reacción. En la gráfica se aprecia un desplazamiento hacia bajos volúmenes de elución lo cual está relacionado con el incremento del peso molecular con el tiempo. Además la presencia de un hombro en las diferentes curvas sugiere un comportamiento bimodal de las especies presentes4. Comportamiento atribuido a la baja eficiencia en el control de la polimerización por el agente RAFT y a la presencia de cadenas poliméricas muertas [95]
60 65 70 75 8:0 85
Volumen de elucion (mL)
Figura 5-5. Cromatografia de permeación en gel de PVPC00H-1 en DMF con estándares de PMMA a 40°C.
Este comportamiento del ATC-1 en la polimerización de NVP puede ser atribuido a su propia estructura, y ha una limitación en la capacidad de ATC-1 de transferir durante el proceso de polimerización [96]
Convertine y col .Reportes en la literutura donde se realizó la polimerización de NVP con tritiocarbonatos de tipo simétrico conteniendo la funcionalidad COOH en ambos extremos, se observó que el comportamiento cinético presentado en este tipo de polimerizaciones es atribuido a la eficacia del radical propagante formado por el PVP, aunado a la disminución de la labilidad del grupo saliente del agente provocada por la presencia del grupo ácido, así como la baja capacidad de estabilizase del grupo R, al igual que las condiciones específicas de cada reacción y las reacciones secundarias que pudieran presentarse las cuales son comunes en la síntesis de PVP [97]