PROGRAMA: DOCTORADO EN TECNOLOGÍA DE POLÍMEROS
AUTOR: LIDIA ELIZABETH VERDUZCO GRAJEDA FIRMAe . t/4 ¿-y.
TITULO: Bioconjugación de Papaína y L-lactato deshidrogenasa con Poli (N-vinil-pirrolidona) Sintetizado vía Polimerización Radicálica Controlada! Viviente
ASESORES: Dr. Jorge Romero García FIRMA
Dr. Ramiro Guerrero Santos FIRMA
El Centro de Investigación en Química Aplicada clasifi documento de tesis como ABIERTO.
Un documento clasificado como Abierto se expone en los estantes del Centro de Información para su consulta. Dicho documento no puede ser copiado en ninguna modalidad sin autorización por escrito del Titular del
ii
Centro de Información o del Director General del CIQA.
Saltillo, Coahuila, a 16 de febrero de 2012
ClON
plÍ q
LC) u
o -
C1
,ello de i1 Institución Dr.4anMedezNoneIl
Declaro que la información contenida en la Parte Experimental así como en la Parte de Resultados y Discusiones de este documento y que forman parte de las actividades de investigación y desarrollo realizadas durante el período que se me asignó para llevar a cabo mi trabajo de tesis, será propiedad del Centro de Investigación en Química Aplicada.
Saltillo, Coahuila a 16 de febrero de 2012
LIDIA ELIZABETH VERDUZCO GRAJEDA Nombre y Firma
*
Tesis
Bioconjugación de Papaína y L-lactato deshidrogenasa con Poli (vinilpirrolidona)
Sintetizado vía Polimerización Radicálica Controlada! Viviente
Presentada Por:
M.C. Lidia Elizabeth Verduzco Grajeda
Para obtener el grado de:
Doctor en Tecnología de Polímeros
Asesorada por:
Dr. Jorge Romero García Dr. Ramiro Guerrero Santos
e,
TESIS
Bioconjugación de Papaína y L-lactato deshidrogenasa con Poli (N-vinil-pirrolidona) Sintetizado vía Polimerización Radicálica Controlada! Viviente
Presentada por:
LIDIA ELIZABETH VERDUZCO GRAJEDA Para obtener el grado de:
Doctor en Tecnología de Polímeros
Asesorada por:
Dr. Jorge Romero García Dr. Ramiro Guerrero Santos
SINODALES
Dr. Alfredo ler.
orres Lubián
l
f
Dr. Antonio S. Ledezma Pérez Secretario
Dra. atalina e rumen 2do. Vocal
Dr. Eleazar Moreno Cortez
3er. Vocal
A esa Imagen que ilumina mi vida: Mi madre
A la magia que reconstituye el alma y el espíritu: Mi Familia
Aún recuerdo el primer día cuando al llegar a CIQA, tropecé, comenzando ahí una odisea que cambiaría mi forma de ver y entender la vida. Sin saber, personas maravillosas llegarían a cruzarse en mi camino quedándose, y entre ese recorrido:
Pláticas y alegrías eternas, así como gratas sonrisas se volvieron parte fundamental de la rutina diaria, tomar café, coca-cola y mantecadas por las mañanas en compañía de mis grandes amigos: El orden leal (Hortensia), mis ojos favoritos (Judith), las polifonías de la gorda (Julia), la sonrisa andante (Miguel), la simpatía presente (Aida), la amistad incondicional (Javier), los agradables regaños (Dra. Graciela), el mate compartido (Gastón y Yamila), las eternas pláticas de todo (Dr.
Román), el ejemplo de vida (Claudia), mi hennanito guapo (Carlos), la fidelidad simbolizada (Cristina), la lealtad errante (Isis), mi hermanita consentida (Karla), mi aliento incondicional (Paola), la palabra concreta (Eddi), el arte de discutir con estilo (Ivan), mi compañera del alma (Gaby), el consejo claro y sencillo (Tony), mi regalo favorito de cumpleaños, el pastel de flan (Dra Ivana), las palabras cortas (Dr Eduardo), la sonrisa eterna (Arxel), mi Guru (Elisa), la claridad personificada (Alondra), el ejemplo de valentía (Liz), la pelea divertida con amistad clara (Enrique), la fortaleza encarnada (Isela), el rebelde con causa (Pedro), el eterno soñador (Marco Guillen), las pláticas vespertinas (Florentino), y a todas aquellas personas que compartieron conmigo horas y horas plenas dentro y fuera del laboratorio.
A todos y cada uno de ellos: Gracias
"La libertad está en ser dueños de la propia vida"
A los Doctores Jorge Romero y Ramiro Guerrero, por sus conocimientos compartidos durante este de proyecto.
A mis sinodales. Dr. Antonio Ledezma, Dr. Román Torres, Dr. Alfredo Rosales, Dr. Iván Moreno y la Dra. Catalina Pérez por sus comentarios y aportaciones durante la validación de esta tesis.
A los técnicos que fueron parte fundamental del trabajo, en especial a la M. C. Gabriela Padrón, ¡ng. Judith Cabello, M. C. Julieta Sánchez, Imelda Vargas García, Nancy Gpe.
Espinoza Pinales y a Silvia Torres por su apoyo incondicional durante todo el trayecto recorrido para la elaboración de este trabajo.
A la Universidad Autónoma de Sonora en especial la Dra. Dora Rodríguez por su apoyo en el análisis de dicroísmo circular, así como a todas las personas que fueron parte vital de éste proyecto a través del tiempo
A CONACYT por el apoyo otorgado con el proyecto C13-2008-01, 103123, así como a la beca terminal obtenida del mismo. Al mismo tiempo quiero agradecer al Centro de Investigaciones en Química Aplicada (CIQA) por las instalaciones prestadas para la realización de este trabajo.
Resumen
Introducción .1
Antecedentes ... .. ... .. ... ... ... . .... IlE
2.1.Síntesis de Polímeros ... 1
2.1.1. Generalidades sobre la polimerización radicálica por desactivación reversible (RDRP) ... 2
2.1 .2.Síntesis de polímeros mediante polimerización radicálica por desactivación reversible (RDRP) ... 4
2.1.3. Polimerización radicálica por adición-fragmentación reversible con transferencia de cadena (RAFT) ... .. ... . ... .. ... ... . ... . .... ... 2.1.4. Selección del agente RAFT ... . ... ... . ... 8
2.1.5. Agentes de transferencia del tipo tritiocarbonato ... . ... 9
2.1.6. Agentes de transferencia del tipo Xantato... ... .... ... .. ... ... ... . ... 10
2.1.7. Síntesis de polímeros mediante polimerización RAFT con grupos extremos terminales funcionalizados... 11
2.2.Enzimas ... ... ... ... ... .. ... . ... . ... . ... . ... 15
2.2.1. Actividad Enzimática ... . ... . ... ... . ... 16
2.2.2. Papaína (EC 3.4.22.2) ... 17
2.2.3. L-lactato-deshidrogenasa (LDH) (EC 1.1.1.27)... 18
2.3.Bioconjugación ... 19
2.3.1. Estrategias de Síntesis para el Diseño de Conjugados Polímero
-
Proteína ... 232.3.1.1. Bioconjugación vía injerto a ... 23
2.3.1.2. Bioconjugación "injerto a" vía a-terminal mediante enlace covalente ... 24
2.3.1.3. Bioconjugación "injerto a" vía a-terminal mediante enlace covalente ... .. ... .. ... .... 28
2.3.1.4. Bioconjugación "injerto a" vía a, o-terminal mediante enlace covalente ... .. ... 29
2.3.1.5. Bioconjugación "injerto de" vía enlace covalente ... .. ... ... ... 30
2.3.1.6. Bioconjugación "injerto a través de" vía enlace covalente.. ... . ... . .... . ... 30 3.Objetivos e Hipótesis ...
3.1 Justificación... 32
3.2.Hipótesis ... ... ... . ... .. ... . ... ... ... . ... ... 33
3.3.Objetivo General ... . ... 34
3.4.Objetivos Particulares ... 34
4.Parte Experimental .... .. ... .. ... . ... . ... .. ... ..
iv
4.1.Metodología ... 35
4.2.Materiales ... . ... ... .... ... ... . ... . ... . ... . ... . ... 36
4.3.Análisis y equipos ... 36
4.3.1. Resonancia MagnéticaNuclear (RMN). ... ... ... ... ... . ... 36
4.3.2. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR)... ... .. ... . ... 36
4.3.3. Espectroscopia de Ultravioleta-visible (UV-Vis) ... . ... . .... .. ... . ... . ... 36
4.3.4. Cromatografia por Exclusión de Tamaños (SEC). La determinación de peso molecular (Mw) e índice de polidispersidad (DI) de los ... ... ... ... . ... ... 36
4.3.5. Espectroscopia de Fluorescencia ... . ... ... ... ... 36
4.3.6. Dicroísmo circular ... . ... .. ... .. ... 36
4.3.7. Cromatografia Líquida de Alta Resolución (HPLC) ... . ... 37
4.4.Smntesis de agentes RAFT ... 39
4.4.1. Síntesis de agente de tipo iritiocarbonato 2([(butilsulfani1)-carbOflOtiOil] sulfanil) - ácido propanóico(ATC-1) ... .. ... . ... . ... .. ... . ... . ... ... ... .... 39
4.4.2. Síntesis del agente RAFT de tipo Xantato ácido 4-(etoxicarbonotioiltio) metil benzoico (ATC-2) ... . ... . ... . ... . ... . ... ..40
4.5. Síntesis de poli(N-vinil-pirrolidOna) mediante polimerización RAFT y su caracterización.. .... .40
4.5.1. Determinación de la presencia del grupo ácido carboxílico final en las cadenas de PVPCOOH-1 mediante el marcaje con pirenmetilamina ... . ... .. ... 41
4.5.2. Análisis de la presencia del grupo ácido carboxílico final en PVPCOOH-1 mediante Resonancia Magnética Nuclear de Protón ... 42
4.6. Aplicación de poli(N-vinil-pirrolidona) en la bioconjugación con enzimas. ... . ... 43
4.6.2. Activación del grupo ácido-terminal mediante el uso de ésteres activos de N-
hidroxisuccinimida(NHS). ... . ... . ... . ... . ... . .... . ... 44 4.6.3. Determinación del grado de conjugación mediante el Ácido TrinitrobenceneSulfónico
(TNBS)... 45 4.6.4. Evaluación Catalítica del conjugado PVP-COOH—papaína (P-PVPC) y su comparación con la
enzima nativa ... . .... . ... . ... ... 45 4.6.5. Evaluación de la estabilidad y respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a diferentes
temperaturas... ... ... . ... . ... .. ... 46 4.6.6. Determinación de las constantes cinéticas de Michaeles-Menten (1(m) y Velocidad máxima
de reacción (Vmax) para P-PVPC y papaína libre ... . ... 46 4.6.7. Evaluación de la estabilidad y su respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a diferente
pH... ... .. ... .. ... . ... . ... 47 4.6.8. Evaluación de la respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a metales presentes en el
medio ... 47 4.6.9. Evaluación de la estabilidad de P-PVPC y papaína libre a 37°C y 40°C... ... 47 4.6.10. Bio conjugación de PVP COOH-2 con lactato deshidrogenasa de músculo de conejo
(Oryctolagus cuniculus) ... 48 4.6.11. Evaluación Catalítica del conjugado L-PVPC y su comparación con la enzima nativa ...48 5 Resultados y Discusión ... . ... . ... V 5.1 Polimerización R.AFT de poli(N-vinil-pirrolidOna) con un ácido carboxílico terminal.
Utilización de agentes de tipo tritiocarbonato (ATC-1) y Xantato (ATC-2) ... .. ... 50 5.1.1. Polimerización vía radicales libres en masa de N-vinil-pirrolidOna (NVP) empleando ATC-1.
... ..
50 5.1.1.1. Caracterización de poli (vinilpirrolidofla) (PVPCOOH-l).. ... . ... .... ... 50 5.1.2. Análisis de grupo ácido carboxílico terminal...
5.1.2.1. Marcaje de poli (N-vinil-pirrolidona) (PVPCOOH-1) utilizando pirenmetilamina para la detección espectroscópica del grupo ácido terminal ... ... . ... ... 56 5.1.2.2. Análisis de grupo acido carboxílico terminal mediante esterificación del grupo ácido
presenteen PVPCOOH-1 ...
5.1.3 Polimerización vía radicales libres en masa de N-vinil-pirrolidona (NVP) empleando ácido 4- (etoxicarbonotioiltio) metil benzoico (ATC-2).... ... .. ... 61 5.2. Bioconjugación de N-vinil-pirrolidona ácido terminal sintetizado mediante ATC-1
(PVPCOOH-1) a la enzima papaína (Carica papaya) ... . ... 67 5.2.l.Determinación del peso molecular de P-PVPC mediante Exclusión de Tamaños utilizando
Cromatografía Liquida de Alta Resolución (HPLC). ... .... ... ... ... ... ... 69 5.2.2. Análisis conformacional de P-PVPC mediante Dicroísmo Circular Ultravioleta lejano (Far-
UV-CD). ... ... . ... . ... .... ... ... . ... 71 5.2.3. Evaluación Catalítica del conjugado PVPC - papaína (P-PVPC) y su comparación con la
enzimanativa... ... . ... ... ... .... ... .. ... . ... 73 5.2.3.1. Determinación de las constantes cinéticas de Michaeles- Menten (Km) y Velocidad
máxima de reacción (V máx) de P-PVPC y papaína nativa ... .. ... 73 5.2.3.2. Evaluación de la estabilidad y su respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a diferentes
temperaturas... . ... . ... . ... 74 5.2.3.3. Evaluación de la estabilidad y su respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a diferentes
pH... . ... .. ... 76 5.2.3.4. Evaluación de la respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a iones metálicos presentes enel medio... ... ... .. ... ... 77 5.2.3.5. Evaluación de la estabilidad en solución de P-PVPC y papaína libre...79 5.3. Bioconjugación de N-vinil-pirrolidona ácido terminal sintetizado mediante ATC-2
(PVPCOOH-l) a la enzima L-lactato deshidrogenasa de musculo de conejo (Orictoraculus cuniculus). ... . ... ... .. ... . ... .... ... ... 81 5.3.1. Análisis de la bioconjugación de PVPC00H-2 a LDH .... ... .. ... 81 5.3.2. Caracterización de L-PVPC obtenido mediante técnicas espectroscópicas. .... ... 82 5.3.3. Determinación del peso molecular de L-PVPC mediante Exclusión de Tamaños utilizando
Cromatografía Liquida de Alta Resolución (HPLC). ... . ... . ... 84 5.3.4. Determinación de la actividad catalítica de L-PVPC y enzima libre en presencia de NADH y
NAD+ ... .. ... ... .... ... . ... 86 5.3.5. Evaluación enzimática a diferentes temperaturas y pH para LDH y L-PVPC...90
5.3.7. Estabilidad en solución de L-PVPC y LDH libre.. ... 90 Conclusiones... ... VI Anexos... .. ... . ... . ... ... ... ... VII Referencias... .. ... . ... .. ... VIII
Índice de Figuras
Figura 2-1 Comportamiento esperado en una polimerización viviente, a) Concentración constante de
especies propagantes, b) número de cadenas constantes ... .. ... . ... .... ... 3
Figura 2-2. Mecanismo de reacción para la polimerización radicálica por transferencia de átomo (ATRP) ... ... . ... .. ... ... 5
Figura 2-3. Ejemplos de los distintos tipos de agentes RAFT... ... ... . ... 8
Figura 2-4. Estructura química del N-vinil - pirrolidona y su homopolímero poli (N-vinil- pirrolidona) ... .. ... ... . ... ... ... ... 12
- Figura 2-5. Estructuras de los diferentes agentes MADIX utilizados en la polimerización de NVP... .. ... .... ... . ... .. ... . ... 13
Figura 2-6. Estructuras de agentes RAFT de tipo tritiocarbonato utilizados en la polimerización de NVP... . ... .... ... ...14
Figura 2-7. Principales estructuras encontradas en las proteínas ... . ... ... ... ... . ... 16
Figura 2-8, Estructura tridimensional y mecanismo de reacción de la papaína Carica papaya)...18
Figura 2-9. Estructura tridimensional y mecanismo de reacción de la L-lactato deshidrogenasa (Oiyctolagus cuniculus) ... ... . ... .... ... . ... 19
Figura 2-10. Medios de conjugación i) vía enlace no covalente y u) Vía enlace covalente...21
Figura 2-11. Esquema representativo del uso de glicopolímeros en conjugación ...22
Figura 2-12. Selección del sitio o multi-sitios de conjugación. . ... . ... 23
Figura 2-13. Estrategia de bioconjugación utilizada en injerto a...24
Figura 2-14. Reacción simplificada de amidación utilizando carbodiimidas ... 25
Figura 2-15. Bioconjugación de polímeros a- terminal mediante enlace covalente ...26
Figura 2-16. Reacción de reducción de tiocarbonil-tio, a) vía aminolisis y b) vía termólisis... ... 27
Figura 2-17. Reacción de cuantificación de grupos tiol mediante la técnica de Eliman (arriba) y funcionalización de polímeros conteniendo grupos tiol terminal con nanopartículas (abajo) . ... 27
Figura 2-18. Ruta de síntesis en la obtención de o-aldehido terminal ... ... 28
Figura 2-19. Síntesis de polímeros heterotelequélicos para bioconjugación a, co-terminal ... 29
Figura 2-20. Estrategia de bioconjugación utilizada en injerto de ... .. ... 30
Figura 2-21. Ruta de síntesis de conjugado BSA-pHEMA a través del residuo cisteína ...31
Figura 2-22. Bioconjugación en fase sólida en superficies (izquierda) y nanopartículas (derecha) . 31
Figura 4-1 Curva de calibración de proteínas mediante SEC-HPLC ...38
Figura 4-2. Marcaje de PVPCOOH-1 utilizando pirenmetilamina. a) Reacción de neutralización del Pirenmetilamina hidrocloruro, b) reacción de derivatización de PVPCOOH mediante PyMeNH2. 42 Figura 4-3. Reacción de esterificación de PVPCOOH con alcohol bencílico en presencia de DMAP!EDC. concentración molar en relación al peso molecular del ácido. ... ... 43
Figura 4-4. Reacción de bioconjugación llevada a cabo entre PVPCOOH-1 y la enzima papaína.. 43
Figura 4-5 Reacción del ácido trinilrobencensulfónico en presencia de grupos aminos libres...45
Figura 4-6. Reacción catalítica de la papaína en presencia de N-benzoil-p-nitroanilida (BAPA) .... 46
Figura 4-7. Reacción de bioconjugación de PVPCOOH-2 con L-lactato deshidrogenasa ...48
Figura 4-8. Reacción química reversible catalizada por la enzima L-lactato deshidrogenasa (LDH) en presencia de NAD+ y piruvato .... . ... . ... . ... .. ... ... ... .. ... 49
Figura 5-1. Esquema de reacción de la polimerización de NVP utilizando ATC-1...51
Figura 5-2. Espectro de 1H RMN para PVPCOOH-1 en CDC13 a 300 MHz... ... ---- ... 51
Figura 5-3. Espectro de FTIR-ATR para PVPCOOH-1 ... . ... .. ... 52
Figura 5-4. Grafica de Peso molecular y PDI contra conversión de NVP con AIBN a 60°C en presenciade ATC-1 ... --- ... .... ... 54
Figura 5-5. Cromatografía de permeasión en gel de PVPCOOH-1 en DMF con estándares de PMMAa 40°C ... . ... .. ... . ... . ... ... ... . ... 55
Figura 5-6. Espectro UV-visible (izquierda) de PVPCOOH-1 antes y después de la derivatización con PyMeNH2, y el espectro de fluorescencia (derecha) para PyPVPCOOH-1 y PyMeNH2 libre, excitados a X 340 nm a una concentración 0.2 mg/mL en solvente metanol ...57
Figura 5-7. Imagen obtenida de una solución de PyPVPCOOH-1 al ser excitado con una - lámpara de Uy-visible a 340 nm y su comparación con PVPCOOH-1 sin modificar...58
Figura 5-8. Espectro RMN 'H obtenido para PVPCOOH-1 esterificado con alcohol bencílico en CDC13 a300MHz ...60
Figura 5-9. Reacción de polimerización de NVP utilizando ACT-2, en masa a 60°C y relación molar de 300/2/0.4 (NVP/ACT-2/AIBN) ... .. ... .... ... .. ... ... ... ... 61
* Figura 5-10. Espectro de lH RMN para PVPCOOH-2 obtenido en CDC13 a 300 MHz. Perteneciente a PVPCOOH-2, 24h a 60°C.. ... .. ... . ... .... ... . ... 67
Figura 5-11. Comportamiento de la polimerización de NVP iniciada con AIBN a 60°C en presenciade ATC-2 ... ... . ... . ... . ... .. ... 63
Figura 5-12. Gráfica de peso molecular y PDI contra conversión de NVP iniciada con AIBN a 60°C en presenciade ATC-2... ... . ... . ... 65
Figura 5-13. Cromatografia de permeasión en gel para PVPCOOH-2 en DMF a 40°C y 1 mg/mL. 66 Figura 5-14. Espectro FTIR-ATR de polímeros de PVP y bioconjugados de PVP-papaína. a)
PVPCOOH-1, b) PVPCOOH-NHS, c) papaína libre y d) P-PVPC. ... ... ... . ... 68
Figura 5-15. Análisis de HPLC-SEC para P-PVPC y papaína libre. Comatograma completo (a) y acercamiento de los cromatogramas (b)... 70
Figura 5-16 Obtención del peso molecular de P-PVPC mediante HPLC-SEC ... ..70
Figura 5-17. Espectro de Dicroísmo circular experimental (izquierda) y calculado mediante SELCON (derecha) obtenido para papaína libre, PVPCOOH y P-PVPC.... ... . ... 72
Figura 5-18. Efecto de la temperatura en la velocidad de actividad enzimática. Concentración de BAPA 5 mM, con un tiempo de 30 mm... ... .. ... . ... . ... . ... . ... . ... 75
Figura 5-19. Grafica representativa del cálculo de la energía de activación (SG) para ambos sistemas... 76
Figura 5-20. Respuesta al pH en la actividad enzimática de a) P-PVPC y b) enzima libre ... 77
Figura 5-2 1. Inhibición de la actividad catalítica de Papaína y P-PVPC en presencia de iones metálicos... 78
Figura 5-22. Evaluación de la estabilidad en solución de P-PVPC y papaína libre a 37°C y 40°C 79 Figura 5-23. Espectro de FT]IR-ATR para PVPCOOH-2 (a), PVPCOOH-NHS (b) y L-PVPC (c) 82 Figura 5-24. Espectro de UV-Vis para LDH libre, PVPCOOH-2 y L-PVPC ... . ... ... ... ... 83
Figura 5-25. Cromatograma de HPLC-SEC para LDH libre y L-PVPC ... 85
Figura 5-26. Detenmnación del peso molecular (Mw) de L-PVPC mediante SEC-HPLC ... 85
Figura 5-27. Respuesta de LDH y L-PVPC a la presencia de NADH a diferentes temperaturas ... 87
Figura 5-28. Respuesta de LDH libre a ambos sustratos (concentración de 6.6 mM piruvato y 30 mM de lactato) ... 88
Figura 5-29. Comportamiento cinético de LDH (en presencia de NADH y piruvato) y L-PVPC (en presencia de NAD y lactato) a diferentes concentraciones de sustrato y 25°C ... 89
Figura 5-30. Estabilidad en solución de LDH libre, PVPCOOH-2 y L-PVPC a 32°C durante 30 días en buffer Tris-HC1 pH 7.5., a) 1 semana, b) 2 semana, c) 3 semana, d) 4 semana . ... 90
Figura 5-3 1. Posible conformación adoptada por L-PVPC en solución . ... . ... . ... ... 91
Índice de Tablas
Tabla 4-1. Relación de enzimas utilizadas en la curva de calibración... ... . .... ... . ... 38 Tabla 5-1. Pesos moleculares y polidispersidad obtenidas para PVPCOOH-1, polimerizado en masa en la presencia de ATC-1 y AIBN a 60°C... ... 53 Tabla 5-2. Relación de pesos moleculares obtenidos en la polimerización de NVP utilizando ATC-2 en masa a 60°C e iniciada mediante AIBN ...62
Índice de Esquemas
Esquema 2-1. Mecanismo general de una RDRP ... .... ... 2 Esquema 2-2. Mecanismo de la polimerización radicálica por transferencia de cadena por adición-
fragmentación(RAFT) .... .... ... . ... . ... . ... ... 7 Esquema 4-1. Secuencia de experimentos realizados para llegar al objetivo de esta tesis...35
Resumen
La bioconjugación de moléculas biológicamente activas como las enzimas a superficies o sistemas acarreadores ha resultado ser una técnica útil en una amplia variedad de usos tanto en sistemas médicos como industriales y del medio ambiente. Aplicaciones tales como la detección o análisis a metales en aguas residuales, liberación controlada de fármacos en el torrente sanguíneo o la búsqueda constante del incremento de la estabilidad en solución del medio biológico a diversas condiciones de temperatura y pH son sólo algunas de las más importantes.
El uso de polímeros hidrosolubles en bioconjugación ofrece ventajas gracias a la diversidad de propiedades que pueden ser obtenidas a través de un rango de polímeros con diferentes estructuras y funcionalidades, así como características definidas que incluyen biocompatibilidad, alta solubilidad, entre otras.
De manera particular el polímero hidrosoluble poli (vinilpirrolidona) (PVP) ha llamado la atención - en aplicaciones médicas, esto debido a sus propiedades únicas, tales como, alta solubilidad en agua y en solventes orgánicos, es no iónico, no tóxico, y ha sido utilizado como sustituto de plasma, acarreador macromolecular de fármacos, y bioconjugación.
Las técnicas para la obtención de polímeros como el PVP, han incursionado en bioconjugación, gracias a la factibilidad de otorgar un grupo funcional final, lateral o en ambos extremos de una cadena polimérica. Tal es el caso de la polimerización radicálica controladalviviente (PRC/V) también conocida como RDRP (radical desactivation reversible polimerization), la cual engloba técnicas conocidas como Polimerización radicálica por adición-fragmentación reversible con transferencia de cadena (RAFT) y Diseño Macromolecular por Intercambios de xantatos (MADIX) entre otras, las cuales precisan de control sobre el peso molecular así como el índice de polidispersidad a los polímeros obtenidos, facilitando la selección y conjugación con grupos definidos presentes en las enzimas.
Por tanto en este trabajo, se propone el uso de las técnicas de RAFT y MADIX para la síntesis de la poli (vinilpirrolidona) funcionalizada con un grupo activo y su bioconjugación con enzimas modelo como la papaína y la lactato deshidrogenasa para la obtención de bioconjugados con características sinérgicas y su evaluación en parámetros como presencia de metales en el medio, estabilidad en
Los resultados obtenidos para papaína demuestran que la conjugación con PVP le otorgó un incremento en su respuesta catalítica tanto en temperaturas como en el pH, superior a las presentadas por la enzima nativa, de igual manera, la estabilidad en solución durante 25 días, demuestra que la conjugación con PVP es una ruta viable en la bioconjugación con esta enzima.
Por el contrario para el caso de lactato deshidrogenasa los resultados obtenidos de respuesta catalítica demostraron una inherente inestabilidad del bioconjugado, sin embargo estudios posteriores demuestran que la conjugación es efectiva, logrando con esto incursionar en la bioconjugación de polímeros como el PVP con dicha enzima, la cual debido a su estructura de gran tamaño disminuye la capacidad de seleccionar y actuar de manera específica en su bioconjugación con este u otro medios.
1. Introduccion
Durante las últimas décadas, la síntesis de polímeros mediante polimerización radicálica controlada viviente (PRC/V), entre las que se incluye la polimerización radicálica por adición-fragmentación (RAFT) y la polimerización radicálica por transferencia de átomo (ATRP), entre otras, han facilitado la obtención de estructuras poliméricas con nuevas arquitecturas, ampliando así el espectro de sus aplicaciones en diferentes áreas del conocimiento. En particular, la unión covalente de estos polímeros (funcionalizados con grupos reactivos, tales como NH2, COOH, SH, etc. en su estructura) con moléculas de origen biológico, principalmente biomacromoléculas (proteínas, ADN, ARN, polisacáridos, etc.,) es un tema de investigación que ha atraído la atención de un buen número de grupos de investigación alrededor del mundo. Este tipo de macromoléculas son conocidas como bioconjugados, biomacromoléculas híbridas o quimeras.
La síntesis de proteína-polímero (bioconjugados) tiene como propósito resaltar y aprovechar las propiedades intrínsecas, funciones y ventajas de ambos componentes, naturales y sintéticos. Idealmente, tales moléculas biohíbridas deben minimizar las limitaciones de sus componentes al expresar sus características de forma sinérgica y mediante la adquisición de nuevas propiedades que predominarían en complejidad a sus contrapartes individuales. En la síntesis de bioconjugados, la polimerización mediante la técnica conocida como grafting to o injerto a es preferida sobre otras, esto debido a la posibilidad de conferir en el extremo terminal de la cadena del polímero un grupo funcional, con la capacidad de reaccionar con los grupos funcionales presentes en moléculas biológicas.
En las últimas décadas se han sintetizado bioconjugados de polímero-proteína, esencialmente a través del acoplamiento al azar con el componente biológico, utilizando uno o varias matrices poliméricas. Los resultados más destacados se ubican en el área terapéutica, en donde la unión covalente de un extremo del polímero a una proteína o fármaco, en muchas ocasiones ha dado como resultado una mayor estabilización de la molécula así como mejora en su actividad biológica e inclusive alcanzar una aplicación práctica. En el caso de las enzimas la bioconjugación busca mejorar la actividad catalítica, aumentar la solubilidad y estabilidad de estas moléculas en soluciones acuosas o mezclas de solventes orgánicos con agua, así como evitar la inhibición por sustrato, u otro inhibidores como metales pesados, además de ampliar la estabilidad a condiciones ambientales como pH y temperatura.
Dentro de las más importantes enzimas con diversas aplicaciones se encuentran las del tipo proteasa, cuya capacidad de romper enlaces peptídicos las hace versátiles y ampliamente utilizadas. Entre las proteasa con mayor uso se encuentra la papaína (Carica papaya E.C. 3.4.22.2) la cual, consta de una cadena simple de péptidos formada por 211 aminoácidos residuales y cuya aplicación se extiende a la industria alimenticia, farmacéutica, cosmética y textil. Por otro lado tenemos las oxidoreductasas, las
cuales llevan a cabo reacciones de óxido-reducción dentro del sistema celular. Dentro de las más importantes se conoce a la D-lactato deshidrogenasa (LDH), ésta enzima consta de 4 unidades monoméricas, constituidas por 334 aminoácidos residuales cada una, formando un complejo globular de gran tamaño y estabilidad. Cada subunidad contiene un centro activo, y su principal aplicación se sitúa en la ciencia médica. Primordialmente en la detección de lactato en sangre, donde, elevados niveles de este, pueden ser indicadores de diversas enfermedades, entre las que se incluyen patologías cardiovasculares y acidosis láctica, entre otras.
En años recientes los sistemas bioconjugados utilizando poliméricos han constituido una alternativa al desarrollo del área de inmovilización de enzimas. Es el caso de enzimas como la papaína y la LDH, los materiales mesoporosos como la silica o polímeros modificados superficialmente como poli(etilen-glicol), membranas de poli(éter sulfona), polímeros epóxicos, entre otros, los cuales han sido utilizados en el área de inmovilización de enzimas. La búsqueda constante por mantener la eficiencia de la actividad enzimática, tiempo de almacenamiento, susceptibilidad a cambios externos, recuperación después de su uso y una rápida difusión del sustrato hacia la enzima. Uno de los polímeros utilizados en bioconjugación de enzimas y que promete ampliar sus estudios es el conocido como poli-(vinil-pirrolidona) (PVP), el cual fue el primer polímero aplicado como una alternativa al uso de poli (etilen-glicol). Sin embargo, su investigación se vio limitada por la complejidad de su polimerización. Por otro lado el uso de las técnicas de RAFT y MADIX han facilitado la síntesis de esté polímero con características definidas como peso molecular, índice de polidispersidad y funcionalidad.
En este trabajo se propone la síntesis del polímero de tipo hidrosoluble denominado poli (N-vinil- pirrolidona) ácido terminal (PVPCOOH), obtenido a partir de las técnicas de polimerización RAFT/MADIX, con el propósito de llevar a cabo su bioconjugación con las enzimas papaína y D-lactato- deshidrogenasa, mediante la técnica de grafting to también conocida como injerto a. Así mismo se propone la evaluación de propiedades del bioconjugado tales como su estabilidad en solución, respuesta catalítica y la actividad enzimática en comparación a su forma nativa. Los resultados demuestran la habilidad de los bioconjugados obtenidos de papaína (Papaína-poli (vinilpirrolidona) conjugado (P- PVPC)) y lactato deshidrogena (Lactato- poli (vinilpirrolidona) conjugado (L-PVPC)), para incrementar de manera favorable su respuesta a las propiedades evaluadas, abriendo una alternativa de investigación en la síntesis de este tipo de compuestos.
2. Antecedentes
2.1. Síntesis de Polímeros
La ciencia de los polímeros ha experimentado una evolución constante desde los años 50's hasta nuestras días, esto gracias al desarrollo de técnicas modernas y multidisciplinarias en el campo de la investigación de los materiales, lo que ha dado como resultado un avance sin precedentes en el área de la síntesis de polímeros. A partir de los años 70's la conjunción de la ciencia de polímeros con otras disciplinas de las ciencias de los materiales y biomédicas ha permitido el desarrollo de diversas aplicaciones estructurales a nivel tecnológico, médico y biológico. Específicamente en el área biológica, la síntesis de estructuras supramoleculares de carácter polimérico representa una de las aplicaciones más prolíferas dentro del conocimiento de los polímeros. Estos estudios pioneros catalizaron el desarrollo de la polimerización radicálica por desactivación reversible (RDRP por sus siglas en inglés) o polimerización radicálica controlada viviente (PRC/V) trayendo consigo un importante avance en el desarrollo de nuevas arquitecturas poliméricas con una alta definición, dificil de obtener por otras técnicas convencionales de polimerización 111
La RDRP emergió como una ruta alterna a la polimerización jónica viviente para la obtención de polímeros con propiedades altamente definidas en cuanto a pesos moleculares predeterminados (Mn) e índices estrechos de polidispersidad (PDI). En forma análoga a la polimerización vía radicales libres convencional (PRC), la RDRP se puede llevar a cabo en distintos medios de reacción (solución, masa, dispersión, emulsión, miniemulsión, etc.) 111, dificil de conseguir en una polimerización de tipo iónica. En contraste con la PRC, la RDRP surgió con la finalidad de mantener un carácter viviente en las cadenas poliméricas, es decir minimizar considerablemente las reacciones de terminación o de transferencia propias de una PRC y mantener la capacidad de continuar el crecimiento de las cadenas en una segunda etapa, proporcionando con esto un control en el peso molecular y en la distribución de éste [2] Aunado a la posibilidad de generar funcionalidades definidas en las cadenas terminales del polímero sintetizado.
En la actualidad, los polímeros sintéticos forman parte esencial de numerosos y variados productos de uso cotidiano y también de especialidades. Estas aplicaciones se ven reflejadas en áreas como la electrónica, óptica, biomédicas, automotriz, aeronáutica, etc [3]• De manera particular, el desarrollo de los polímeros sintéticos en el área biomédica, se inició fundamentalmente en el plano terapéutico, debido a la necesidad de incrementar el tiempo de la bioactividad de un determinado fármaco, y al mismo tiempo disminuir la proteólisis provocada por enzimas y así su eliminación del fármaco en el sistema renal, lo cual se ha conseguido utilizando polímeros de bajo peso molecular (20,000 g/mol) [4]• De ésta manera la RDRP ofrece diversas rutas viables para el diseño de nuevos polímeros, las cuales incluyen; diversas condiciones
extremos de las mismas, todo ello aplicable en la unión con diferentes biomacromoléculas en donde la bioconjugación depende principalmente de la estrategia de RDRP utilizada [5]
2.1.1. Generalidades sobre la polimerización radicálica por desactivación reversible
• (RDRP)
Las diferentes técnicas de RDRP, en general están regidas por un mecanismo de transferencia degenerativa y otras por terminación reversible. Los ejemplos del primer tipo son la polimerización radicálica viviente por transferencia degenerativa de electrón (SET-DTLRP) [6],
Polimerización Radicálica por Transferencia de Jodo (RJTP) , Polimerización Radicálica por Adición-Fragmentación (RAFT) y Diseño Macromolecular por Intercambio de xantatos (MADIX). Las del segundo tipo, incluyen la polimerización mediada por un radical estable o Polimerización Mediada por Nitróxidos (NMP), y la polimerización mediada por metales, entre las cuales se incluye la Polimerización Radicálica por Transferencia de Átomo (ATRP) y polimerización radicálica viviente por transferencia de electrón (SET- LRP) [8]•
El principio de todas estas estrategias de RDRP es lograr el incremento del tiempo de vida de un radical propagante vía el establecimiento de un equilibrio reversible entre las especies propagantes (P) y las especies durmientes (P-X) (Esquema 1-1). Este equilibrio se ve fuertemente desplazado hacia las especies durmientes disminuyendo significativamente la concentración instantánea de los radicales en propagación y minimizando reacciones de transferencia y terminación irreversibles entre cadenas [9]
PrwX
PIWTj
+ Monómero Esquema 2-1. Mecanismo general de una RDRP.
Un sistema ideal de polimerización controlada/viviente debe presentar las siguientes características 1101:
a) La concentración de especies activas (propagantes) se mantiene constante a lo largo de la polimerización, debido a la gran disminución de los eventos de terminación. Consecuentemente, la evolución de la gráfica de conversión expresada como ln con el tiempo de reacción (Ecuación 1) es lineal cuando la concentración de radicales en propagación es constante.
La desviación de este comportamiento tiene dos interpretaciones; una curva cóncava significa que la iniciación es lenta mientras que una curva convexa indica que ocurren reacciones de terminación irreversible (Figura 2-1)
1n = k[P]t Ecuación 1
Tiempo Conversión
Figura 2-1 Comportamiento esperado en una polimerización viviente, a) Concentración constante de especies propagantes, b) número de cadenas constantes 101
b) El grado de polimerización (X) presenta un incremento lineal con respecto a la conversión de monómero (p) (Ecuación 2). Esto indica un número de cadenas constante a lo largo de la polimerización, donde un M inferior al comportamiento lineal indica reacciones de transferencias no deseadas, mientras de forma contraria un M superior revela una ineficiencia del iniciador en la generación de radicales o reacciones de acoplamiento (ver Figura 2-ib).
Ecuación 2
c) El índice de polidispersidad (PDIMw/Mn) es inferior a 1.5 en reacciones controladas. En una reacción de polimerización el PDI está íntimamente ligado a la velocidad de iniciación, generalmente en una iniciación lenta el PDI disminuye conforme avanza la conversión de monómero (Ecuación 3). Un
Donde t= tiempo de polimerización, [M]o y [M] representan la concentración de monómero inicial y al tiempo 1 , k,, =
constante de polimerización y [P]= concentración de especies activas.
incremento en el valor de PDI significa que ocurren reacciones de terminación a lo largo de la polimerización.
M
1 + 1/X
Ecuación 3d) Las cadenas deben presentar un alto porcentaje de funcionalización en los extremos, y estos a su vez deben ser activas en reacciones subsecuentes. Es decir, las cadenas funcionalizadas tienen la capacidad de reiniciar la polimerización en una segunda etapa con el mismo monómero (extensión de cadena) o con otro distinto para formar copolímeros en bloques.
Una polimerización de tipo RDRP puede no cumplir estrictamente con los criterios descritos anteriormente y aun así considerarse como controlada/viviente. Esto depende de la proporción de cadenas - inactivas que se generen durante la polimerización (7,8,9, 101
2.1.2. Síntesis de polímeros mediante polimerización radicálica por desactivación reversible (RDRP)
ATRP y RAFT son las estrategias de polimerización más utilizadas en el área de síntesis de polímeros con aplicaciones biológicas, esto, debido a su amplia diversidad de grupos químicos compatibles y condiciones de reacción, que incluyen temperatura, solventes, entre otros y que facilitan su - uso sobre una amplia gama de monómeros de tipo vinílicos como estireno, N-vinil-pirrolidona, entre
otros.
La polimerización ATRP fue desarrollada independientemente por Matyjaszewski/Wang y Kato "° como una extensión de la adición radicálica por transferencia de átomo (ATRA) conocida como reacción de Kharasch en la que mezclas equimolares de compuestos halogenados y alquenos reaccionan catalíticamente para formar aductos de manera quasi-cuantitativa. En ATRP el mecanismo (Figura 2-2) se basa en un sistema redox entre un halogenuro de alquilo (RX) y un complejo metálico (MY/L) con una relación molar alqueno/RX muy superior a la relación estequiometrica. La reacción incluye la transferencia del halógeno hacia el complejo metálico generando un radical R., iniciándose así la adición al doble enlace del monómero. El radical resultante oxida al nuevo complejo metálico X-M,1Y/L para regenerar el enlace C-halógeno y para regenerar el complejo metálico original.
El equilibrio se desplaza hacia las especies inactivas producido por un alto estado de oxidación en el catalizador, generado por un grado de acoplamientos radical-radical durante las etapas iniciales de la
polimerización. La ATRP se ha utilizado en la polimerización con monómeros comunes, estírenos, metacrilatos, metil-acrilamidas y acrilonítrilo. Además de otros monómeros que contienen grupos reactivos o altamente lábiles (epóxidos, lactonas o dienos), los cuales pueden ser polimerizados por ésta técnica. La velocidad de activación y desactivación (ka y kd) de cada monómero en combinación con la velocidad de propagación (ko) determinan la velocidad de polimerización. Los iniciadores son halogenuros de alquilo (X=Br o Ci) en los que R debe permitir la estabilización del radical formado. Los catalizadores están compuestos por un metal de transición (cobre, níquel, rutenio, paladio, etc.) y un átomo de bromo o cloro principalmente. Este tipo de catalizadores son susceptibles de sufrir oxidación durante el proceso de polimerización [9,10,11]
R-Br + CuBr(L) R + CuBr2(L)
Kd
R-Mn-Br + CuBr(L) RM
CuBr2(L)
Figura 2-2. Mecanismo de reacción para la polimerización radicálica por transferencia de átomo (ATRP) La síntesis por ATRP de varios polímeros hidrosolubles o amfifilos para aplicaciones en biomedicina y biotecnología [11]
ha sido posible. Recientemente, la combinación de la ATRP con otras técnicas de polimerización como RAFT, se ha convertido una alternativa viable en el diseño de nuevos copolímeros con arquitecturas bien definidas. La polimerización ATRP, además permite la post-modificación en la funcionalidad a, co mediante diversas rutas 1121, lo que hace de ATRP una plataforma promisoria y versátil.
Sin embargo ATRP presenta limitaciones importantes. Por ejemplo, algunos monómeros o iniciadores con grupos funcionales como ácidos carboxílicos y ciertos grupos jónicos no pueden ser utilizados, debido a que de alguna forma limitan la catálisis durante la polimerización de estos compuestos. Por otro lado, monómeros como el acetato de vinilo, alquenos halogenuros cuyo radicales no están estabilizados por efectos inductivos o de resonancia son difíciles de polimerizar. Otra limitación importante es que el catalizador debe ser eliminado del polímero resultante o del medio de reacción'°' 11,12
2.1.3. Polimerización radicálica por adición-fragmentación reversible con transferencia de cadena (RAFT)
La aplicación de agentes de transferencia de cadena (CTA) para control del peso molecular obedece
A partir de los 80's, el uso de tioles (R-SH) emergió para este propósito, la labilidad del enlace S-H y la alta reactividad del radical tioil son la base de la efectividad de estos compuestos [13] Con la aparición de la polimerización RAFT (por sus siglas en ingles), el uso de CTAs de tipo reversible para el control del peso molecular y la polidispersidad, se convirtió en uno de los métodos más versátiles para conferir características vivientes y controladas en la polimerización radicálica.
La polimerización por medio de Diseño Macromolecular vía Intercambio de xantato (MADIX) es una variante de este tipo de síntesis de polímeros. Los primeros reportes de RAFT y MADIX surgieron en 1998, cuándo de manera simultánea Rizzardo y col y Rhodia Chimie reportaron el uso de compuestos del tipo Z(C=S)SR y ZO(C=S)R, para la polimerización de una amplia variedad de monómeros vinílicos, bajo distintas temperaturas de reacción (ambiente hasta 110°C), logrando con ello pesos moleculares controlados y PDI estrechos (l .2,). El proceso RAFT involucra una polimerización vía radicales libres en la presencia de CTAs del tipo ditiocompuestos [14]
Estas reacciones pueden ser conducidas en masa, solución, emulsión o suspensión y se inician en presencia de azo-compuestos o peróxidos. El mecanismo de polimerización RAFT conlleva un intercambio reversible del grupo controlador S=C(Z)S- entre especies activas y durmientes mediante una reacción de adición-fragmentación. Esto permite mantener el carácter viviente de la polimerización y donde la constante de transferencia de cadena es la métrica que determina la eficiencia de cada CTA. En otra palabras, esto significa que la capacidad para realizar un intercambio rápido entre las especies (activas y durmientes) generaría polímeros con baja polidispersidad. La selección de los grupos Z y R es esencial para asegurar una alta eficiencia, donde Z tendrá la capacidad de estabilizar y activar al grupo tiocarbonilo, mientras que R deberá ser un buen grupo saliente y capaz de reiniciar el proceso de polimerización. El mecanismo propuesto para una polimerización RAFT se representa en el Esquema 2
EL
Iniciación Iniciador kd
>
1 •M
J>
M
00
P11
• Transferencia de cadena
Pn • +
kadi. kp_s_S + R
kp (\ ) Z Z kf Z
1 2 3
Reiniciación
•
M
R' ___ M
___
Equilibrio
+ sTSPn
kadip kadi,p P m_SS+
p.k
U M
Z k..a(1ip 4
k.aa'i.p Z k1,U M
• Terminación
P1
+ Pffl • k1Polímero inactivo
Esquema 2-2. Mecanismo de la polimerización radicálica por transferencia de cadena por adición- fragmentación (RAFT)'14'
En este proceso la reacción se inicia con la ruptura homolítica del iniciador para dar lugar a la formación de radicales libres los cuales en presencia de un monómero iniciará el crecimiento de la cadena polimérica, dando lugar a los radicales propagantes (P). Estas especies químicas se adicionan al doble enlace C=S del agente de transferencia (1) dando lugar a la especie radicálica intermediaria (2), está a su vez mediante una reacción de fragmentación forma el polímero durmiente (3) y libera un nuevo radical re-iniciante (R'). Éste radical reinicia la polimerización formando nuevas cadenas activas en crecimiento (P), las cuales en contacto con las especies durmientes establecen un rápido equilibrio dinámico mediante el proceso de adición-fragmentación (4). Si la velocidad de este equilibrio es suficientemente alta, la posibilidad de que dos especies propagantes (P y P . ) se encuentran por difusión se hace muy pequeña y en consecuencia, la velocidad de terminación bimolecular irreversible es despreciable. En otras palabras, la concentración de cadenas en crecimiento se mantiene en un mínimo en comparación con las
terminación por combinación o desproporción no pueden evitarse en su totalidad ya que son propias del mecanismo de polimerización radicálica [12, 13, 141
2.1.4. Selección del agente RAFT
La selección de los grupos sustituyentes Z y R son una parte crucial en la estructura del agente RAFT, ya que el grupo R se convierte en radicales libres en la etapa de pre-equilibrio y Z provee efectos inductivos que favorecen el ataque del doble enlace C=S. Además R debe tener mayor labilidad que el radical propagante, así como la capacidad de reiniciar eficientemente la polimerización. Algunos factores que deben ser considerados para la selección de estos grupos, son entre otros los factores estéricos, estabilidad del radical formado, y los efectos polares que son los elementos determinantes en la capacidad de este grupo R para fragmentarse y reiniciar. Por lo contrario, el grupo Z determina la reactividad y estabilidad para facilitar la fragmentación del agente y participa en el control de la eficiencia en la mediación de la polimerización [10, 141
Los CTA se clasifican de acuerdo al grupo sustituyente Z. Estos incluyen a los ditioésteres (Z=R'), tritiocarbonatos (Z=S-R'), xantato (Z=O-R') y ditiocarbamatos (Z=N-R'), en donde R' es un grupo alquilo o arilalquilo (Figura 2-3). Los CTA tienen una estrecha relación con las constantes de velocidad de adición y de transferencia es decir, tienden a incrementarla de acuerdo a su sustituyente. Dependiendo de la naturaleza y la estabilidad del grupo Z (fuerte o débil) los CTA tienen una actividad más o menos acentuada. Un CTA demasiado activo puede producir un periodo de inducción o retardación en la velocidad de polimerización. El grupo R tiene un papel importante en la cinética de polimerización, es decir, un agente RAFT con un grupo R dificilmente fragmentable que reaccione ineficientemente en la re- iniciación no proveerá de control a la polimerización o provocará una fuerte acción de inducción [15]
°
J
O-R S-R
/
oC:>-<S---\-JC0OH
(:3~o
Ditioéster Tritiocarbonato Xantato Ditiocarb amato Figura 2-3. Ejemplos de los distintos tipos de agentes RAFT
2.1.5. Agentes de transferencia del tipo tritiocarbonato
Los agentes del tipo tritiocarbonato presentan una menor constante de transferencia que los del tipo ditiobenzoato, sin embargo presentan un excelente control sobre monómeros de tipo (meta)-acrilatos y estirénicos. Una ventaja que ofrece este tipo de agentes es que tienen un tiempo de retardación mínimo, además presentan constantes altas de transferencia. Estos tipo de agentes al igual que los ditioésteres presentan como desventaja la coloración, la cual le confieren al polímero final, además de un olor desagradable (provocado por la descomposición del grupo tiocarbonil-tio) [14, 151
Los agentes tritiocarbonatos se han estudiado ampliamente en la síntesis de polímeros potencialmente útiles en aplicaciones biológicas. Kujawa y col [16] reportaron la polimerización de NIPAM empleando S- n-octadecil-S'-(a.a'-dimetil-a"-N-octadecilacetamida) tritiocarbonato para la obtención de un polímero - telequélico conteniendo un grupo terminal hidrofóbico (n-octadecil) logrando con ello un buen control en el peso molecular y polidispersidad (Mn = 12-49 kDa y PDI =1.2) del PNTPAM obtenido. Wang y col 1171 diseñaron una serie de agentes tritiocarbonatos diácidos simétricos para la obtención de poli (acrilato de butilo) (poli(nBuA)) en la síntesis de polímeros telequélicos y su subsecuente síntesis directa de un copolímero BAB funcionalizado a,Ú)-ácido terminal, los autores observaron qué las estructuras del CTA influyen en la efectividad del control del Mn (20,000) y PDI (1.14-1.20).
En donde un radical generado a partir de un radical primario es más estable qué aquel generado de un radical terciario. Un caso particular de CTA fue propuesto por He y col 181, quienes reportaron un agente de tipo tritiocarbonato. Estos autores conjugaron covalentemente el grupo Z (ácido) de este agente a una molécula de DNA previamente anclada mediante interacciones no covalentes sobre un sustrato de oro.
Éste agente RAFT se utilizó para la obtención de un poli (OEGMA) - ácido terminal (Mn = 32,000 g/mol y PDI=1.4) mediante la polimerización de oligo(etilen-glicol) metacrilato (OEGMA) en presencia de AIBN, el polímero resultante tiene aplicación como sonda molecular en la detección de ADN.
Los agentes tritiocarbonatos pueden ser simétricos o no simétricos, en función del número de grupos salientes con los que cuenten, uno en el primer caso y dos en el segundo. Este último permite diseñar estructuras en forma tribloque. Por ejemplo Postma y col [191, reportaron la síntesis de una serie de agentes CTA conteniendo un grupo ftalimidometil como grupo Z, para la obtención de poliestireno (PS) funcionalizado con un grupo amino terminal. Las principales diferencias presentadas entre estos CTA's fueron de carácter estructural, en donde estos agentes mostraron una constante de transferencia superior
derivatización del grupo ftalimida-a un amino terminal mediante hidrazinólisis fue bastante elevada en ambos casos (80%).
Sin embargo, los agentes de tipo tritiocarbonato presentan cierta limitación al utilizarse en la polimerización con algunos monómeros, (ej. acetato de vinilo (VAc), N-vinil-pirrolidona (NVP), acrilato de octadecilo, entre otros). Esto se atribuye a la estabilidad relativa del radical intermediario y a la baja labilidad del grupo saliente formado por este tipo de monómeros. Pero a pesar de ello, existen reportes relativos a su polimerización pero con limitado control en el Mn y PDI20'211. Un ejemplo de ello es la síntesis de terpolimeros en gradiente de PVP con estireno y anhídrido maléíco fotoiniciada con rayos Uy, en la presencia de S,S '-dibencil-tritiocarbonato [22] La homopolimerización de NVP con este CTA fue deficiente, sin embargo el control en la terpolimerización fue aceptable, esto último atribuido al complejo de carga formado entre el NVP y el anhídrido maléíco.
2.1.6. Agentes de transferencia del tipo xantato
La polimerización con agentes de tipo xantato se denominada MADIX, el mecanismo de reacción es similar a la polimerización RAFT con la diferencia de que el grupo Z en el CTA es un grupo O-alquil.
Una ventaja que ofrecen los agentes MADIX es la posibilidad de utilizarse con monómeros cuyo radical intermediario presenta baja labilidad [23]
Las constantes de transferencia son bajas ( :5 1.0) y cuando se utilizan monómeros de tipo estirénicos, metacrílicos y acrílicos no proveen de un buen control en la polimerización de estos. Sin embargo, con la selección apropiada del grupo O-alquil, este control se puede mejorar. Es conocido que la efectividad del agente xantato utilizado en la polimerización depende del grado de sustitución del grupo O-alquil. La estabilidad del radical saliente aumenta en el siguiente orden; O-tert-butil ? O-arilo ? 0-isopropilo > O-etilo ? O-metilo, en consecuencia la reactividad del xantato aumenta en el mismo orden [23] Aunque en todos los caso el grupo R debe tener la capacidad de reiniciar la polimerización 114,23]•
Postma y col [24]
compararon la polimerización de NVP con agentes (CTA's) de tipo xantato y tritiocarbonato. A diferencia del tritiocarbonato la polimerización con el agente xantato resultó ser más eficiente en cuanto al control del peso molecular y el índice de polidispersidad (Mn -64 kDaJ PDI 1.6 y Mn -32 kDa y PDI 1.1 respectivamente). Resultados similares se obtuvieron en la copolimerización mediada por xantatos de los monómeros NVP y YAc. Por otra parte Mori y col [25] reportaron la síntesis de un polímero de poli (vinilcarbazol) (pVC) tipo estrella de cuatro brazos. En estas polimerizaciones se utilizaron agentes de tipo MADIX monofuncional y MADIX tetrafuncional, respectivamente. Asimismo, dichos autores reportaron valores de Mn controlados desde inicios de la polimerización. Estos reportes
demuestran que el uso de xantatos como CTA's, son útiles en el control de la polimerización de los monómeros VAc, pVC y NVP. Para ello es determinante tener un control apropiado en la selección del grupo R.
- 2.1.7. Síntesis de polímeros mediante polimerización RAFT con grupos extremos terminales funcionalizados
Una característica importante que presenta la síntesis de polímeros mediante polimerización RAFT, es la retención de los grupos funcionales presentes en el agente de transferencia en ambos extremos del polímero. Esto permite la funcionalización directa a-terminal y a-terminal con grupos funcionales específicos en los extremos de la cadena del polímero. Así la selección apropiada del agente RAFT o la post-modificación de los grupos mediante diversas rutas de reacción126' como aminólisis [27], reducción por radical inducido, hidrólisis [28] eliminación térmica, etc., conduce a la obtención de diversos grupos funcionales (ácidos carboxílicos, grupos arilo, hidroxilos, aminas, esteres o éteres), facilitando su aplicación en la conjugación con las biomoléculas. Los ácidos carboxílicos presentes en los polímeros sintetizados por esta estrategia han sido los más utilizados para este propósito, esto debido a que son capaces de reaccionar covalentemente con los grupos funcionales de las moléculas biológicas para formar amidas o esteres. En este caso, la eficiencia de la reacción de conjugación dependerá de la reactividad de las contrapartes y de la longitud de la cadena polimérica.
La síntesis de agentes RAFT conteniendo grupos ácidos carboxílicos (-COOH) en su estructura, se ha utilizado en la polimerización de diversos monómeros. Moad y col sintetizaron y compararon una serie de agentes RAFT conteniendo grupos ácidos carboxílicos en la polimerización de metil-metacrilato. Estos autores observan un control eficiente del peso molecular (126,000), PDI estrechos (1 .5) y conversiones de hasta el 99%.
Recientemente Boyer y col, han reportado la síntesis de polímeros solubles en agua, mediante polimerización RAFT, resultando ser una herramienta muy versátil en la conjugación con moléculas de origen biológico. Para ello se han utilizado monómeros como ácido-láctico (LA), ácido acrílico (AA) y vinil alcohol entre otros. (VA), etc. Un ejemplo importante a destacar es la N-vinipirrolidona, la cual es uno de los monómeros de mayor aplicación en la síntesis de polímeros dirigida a la obtención de bioconjugados para aplicaciones biotecnológicas, biomédicas y de nanotecnología
La poli (vinilpirrolidona) es un polímero con múltiples aplicaciones entre otras razones debido a su
dispersante de nanotubos de carbono, (sustituto de plasma en sangre), acarreador de medicamentos [301, bioconjugacion, hidrogeles, hemocompatible, membranas para ultra filtración, válvulas bioprostéticas, entre otras.
La estructura química del monómero de N-vinil-pirrolidona (NVP) y su homopolímero poli(N-vinil- pirrolidona) se representan en la Figura 2-4, en donde la unidad repetitiva muestra un ciclo altamente polar con un grupo lactama (amida cíclica) capaz de formar interacciones de tipo puente de hidrogeno. El resto de la estructura está formada por grupos metinos y metilenos que le confieren carácter nopolar, altamente hidrófobo. Este monómero es soluble en un amplio intervalo de solventes poco polares y no polares, entre los que se incluyen como ejemplos cloroformo, metanol y cloruro de metileno [31]
—CH2CH—
Polimerización vía
radicales libres
CY
NVP PvP
Figura 2-4. Estructura química de la N-vinilpirrolidona y su homopolímero poli (vinilpirrolidona) La síntesis de poli (vinilpirrolidona) se reportó en los 40s, mediante polimerización en masa o solución, - vía radicales libres. Sin embargo algunos reportes indican la baja reproducibilidad de los experimentos cinéticos, atribuyéndolo principalmente a la impureza del monómero, y la capacidad del radical propagante para abstraer protones generando alta frecuencia de reacciones de transferencia. Además se estima que su velocidad de polimerización así como su correspondiente energía de activación dependen - fuertemente de la naturaleza del solvente utilizado, en ambos casos atribuido a la influencia de la
polaridad del solvente durante la reacción de propagación [32]
En aplicaciones con sistemas biológicos, la funcionalidad, peso molecular y PDI de los polímeros son factores importantes. La polimerización de NVP utilizando agentes de polimerización tipo RAFT/MADIX se ha estudiado ampliamente [28.321• Varios autores han reportado la síntesis de agentes de transferencia tipo MADIX con diferentes grupos funcionales para la polimerización de NVP, y que son útiles en la conjugación con moléculas de origen biológico. MacDowall y col [33] diseñaron un agente MADIX para polimerizar PVP con un grupo final N-succinimidil-éster (Figura 2-5 (1)) que permitió conjugar de manera directa a este polímero con la lisozima. En la síntesis del polímero se pudo obtener un buen control en el peso molecular (33,000 gImo!), así como un índice de polidispersidad estrecho
s
00 - 0_\
rN0>O'
0 \1 2
o
3
Figura 2-5. Estructuras de los diferentes agentes MADIX utilizados en la polimerización de NVP Wan y col [34] llevaron a cabo la polimerización de NVP mediante MADIX, utilizando fluoroalcoholes.
Estos autores consiguieron (Figura 2-5 (2)) no sólo un buen control en Mn y PDI (26,700 g/mol y 1.3 respectivamente), pero además consiguieron un buen control en la tacticidad del PVP a bajas conversiones de monómero.
Mishra y col 1351 obtuvieron copolímeros en bloques de tipo amfifilos, mediante la utilización de un macroagente MAIIX de caprolactona obtenido por polimerización por apertura de anillo (ROP Ring open polymerization) y su posterior aplicación como CTA en la polimerización de NVP (Figura 2-5 (3)), logrando un buen control en la síntesis de esta macromolécula (Mn 7,200 g/mol, 1.25)
Algunos agentes de tipo tritiocarbonato también han sido utilizados en la polimerización de NVP. Hu y col, llevaron a cabo la síntesis de polímeros en gradientes vía 'y irradiación (utilizando PVP con estireno y metil acrilato), (Figura 2-6 (1)) logrando un buen control en la polimerización y en la formación del terpolimero. Postma y col ensayaron la polimerización con un grupo ftalimidometil tritiocarbonato (Figura 2-6 (2)) con NVP sin embargo aunque se logró un control en el Mn (8,000 g/mol) el PDI obtenido fue relativamente alto (~:1.48). En este trabajo también se reportó un agente similar al ftalimidometil tritiocarbonato, pero de tipo xantato, confiriéndole a PVP de un buen control de Mn y PDI (6,000 g/mol, 1.15), inclusive a altas conversiones.
s o s
y s C
N--/ S—\—1 o
2
Figura 2-6. Estructuras de agentes RAFT de tipo tritiocarbonato utilizados en la polimerización de NVP Hay reportes de la síntesis de PVP mediante polimerización ATRP. Lu y col [36]
reportaron la síntesis de PVP utilizando Me6Cyclam, un ligante cíclico, en la síntesis de este polímero se obtuvo buen control en Mn y PDI (7,800 g/mol, 1.21) así como también la copolimerización de NVP con otros monómeros Sin embargo, los reportes de la polimerización de PVP utilizando ATRP son escasos.
Debuigne y col reportaron la polimerización de NVP utilizando PRMC (Polimerización Radicálica Mediada por Cobalto) mediante el uso un macroagente de poli (vinilacetato). En donde el índice de polidispersidad fue bajo y el peso molecular Mn experimental, fue próximo a el peso teórico calculado esperado.
En resumen la polimerización a través de las diferentes estrategias de tipo RAFT ofrece, una plataforma versátil para la síntesis controlada de polímeros funcionales en donde las ventajas más importantes de esta técnica son:
- La capacidad para controlar la polimerización con una amplia gama de monómeros y solventes, incluyendo agua.
- Obtención de polímeros con una amplia variedad de grupos funcionales, permitiendo la obtención de polímeros con grupos laterales (pendientes) y funcionalidades en los extremos de la cadena, lo cual es deseable para la unión covalente con moléculas biológicas.
- El diseño de diversas arquitecturas poliméricas incluyendo copolímeros (alternados), gradientes, injertados y en bloques.
- Compatibilidad de RAFT con diferentes métodos de polimerización (masa, solución, emulsión, dispersión, etc.) y modificación superficial y generación de polímeros conjugados in situ.
- Potencialidad de conjugar los polímeros obtenidos con sistemas biológicos mediante diversas rutas (o injerto a, injerto de, injerto a través de, entre otras).
Por todas esas características, RAFT es una alternativa muy útil y efectiva. Este conj unto de estrategias junto con RDRP han permitido la síntesis de bio-macromoléculas con alto potencial tecnológico y comercial.
2.2. Enzimas
La unión de 2 o más aminoácidos (aa), llegan a formar grandes cadenas llamadas polipéptidos o proteínas. Su estructura y característica está determinada por la secuencia y numero de aminoácidos que la conforman. Donde su estructura determina tanto su función como su forma tridimensional. Las proteínas participan en gran variedad de procesos biológicos los cuales son determinados por su capacidad de interaccionar con otras moléculas. Siendo uno de sus principales roles en las células su función como catalizadores biológicos, los cuales reciben el nombre de enzimas.
Las enzimas presentan alta selectividad en sustratos y especificidad en reacciones. Se encuentran en cuatro estructuras principales: La primaria es la forma más básica y está conformada por la secuencia principal de aminoácidos de la cadena proteica. La secundaria, es un arreglo o conformación local de segmentos de aa, resultado de la formación de enlaces puentes de hidrógeno entre ellos (Figura 2-7). Las conformaciones más frecuentes encontradas en una estructura secundaria son:
Hélice alfa: La cadena polipeptídica se desarrolla en espiral sobre sí misma y es conformada por los enlaces de hidrógeno formados entre -C=O del aminoácido "n" y el -NR del "n+4" (cuatro
* aminoácidos más adelante en la cadena).
Hoja plegada beta: La cadena principal se estira al máximo que permiten sus enlaces covalentes, y establece una configuración espacial, formada entre dos o más cadenas paralelas (que corren en el mismo sentido) o antiparalelas (que corren en direcciones opuestas) las cuales se adosan estrechamente por medio de puentes de hidrógeno y diversos arreglos entre los radicales libres de los aminoácidos. Esta conformación tiene una estructura laminar y plegada.
La estructura terciaria es resultado de interacciones polares o no polares producida por el posicionamiento de los aminoácidos durante el doblamiento. Dado que esta estructura tridimensional es estabilizada principalmente por enlaces débiles no covalentes, tiende a perderse cuando la proteína es extraída de su medio ambiente natural. Lo anterior se le conoce con el nombre de "desnaturalización";
una proteína que sufre desnaturalización ya no puede llevar a cabo ninguna de su funciones biológicas. La cuaternaria es el resultado de la agrupación de dos o más cadenas polipeptídicas dentro de una conformación altamente estable y es estabilizada por interacciones van der Waals y enlaces jónicos. [37, 381
4
o o .
21
L
N N' H -r -
-Primaria Secundaria
Alpha hhil
TJ
Terciaria Cuaternaria
Figura 2-7. Principales estructuras encontradas en las proteínas.
Las enzimas pueden catalizar de manera independiente o por medio de un cofactor o coenzima, los cuales actúan como "acarreadores" de un grupo específico en la función catalítica de la enzima. El sitio más importante de estas es llamado sitio activo, el cual contiene grupos sustituyentes que enlazan al sustrato y catalizan su transformación química. Lá actividad enzimática depende de varios factores entre los que se encuentran la temperatura, el pH, la concentración de sustrato, entre otras. Donde la sensibilidad a estos factores en un medio biológico determina su eficiencia catalítica [38]
2.2.1. Actividad Enzimática
La actividad catalítica de las enzimas fue observada por Leonor Michaelis y Maud Menten (1913) quienes postularon una expresión matemática basada en un estado estacionario para la determinación de la velocidad enzimática de reacción. Ellos proponen la formación de un complejo intermediario (ES) entre el sustrato (5) y la enzima (E) durante el proceso de conversión, dicho complejo es reversible. Al descomponerse ES, la velocidad de reacción (V) se mantiene constante a ciertos pasos de reacción, coincidiendo con la velocidad inicial (Vo) de manera que al aumentar la concentración inicial de sustrato se desplaza el equilibrio hacia la formación de ES al igual que Vo alcanzando un valor constante el cual se conoce como velocidad máxima (V max). En este punto la enzima se encontrará en condiciones de saturación de sustrato, por lo que un aumento en la concentración de este ya no tendrá efecto en la catálisis. Este valor no es fácilmente medible por lo que Michaelis —Menten, determinan que la concentración de sustrato en este punto es determinada por una constante Km la cual relaciona V maxl2 y
es única para cada afinidad de determinado sustrato. Lo anterior es expresado en lo que hoy se conoce como la ecuación de Michaelis-Menten:
Vmax [S]
V 0
= Ecuacion 4Km
+ [
SI4
Esta ecuación puede ser transformada algebraicamente en una ecuación experimentalmente más práctica, mediante la derivación y reacomodo simple de los recíprocos de ambos lados de la ecuación, a partir de esto se obtiene la ecuación de Lineweaver - Burk:
L_
Km +___
Ecuación 5yo - VMAX VMAX
La cual permite obtener parámetros importantes de una reacción enzimática como son la V máx y la constante de Michaelis-Menten Km , 111
Dentro de las enzimas más importantes se encuentran las proteasas cuya función es romper enlaces amidas para reducirlos a aminoácidos o cadenas polipéptidicas para la formación de proteínas de menor tamaño, y las oxidorreductasas, las cuales catalizan el proceso de óxido —reducción en determinadas reacciones biológicas. Entre las enzimas proteasas más importantes se encuentran las cisteínas proteasas como las catepsinas, bromelaina y la papaína. De igual manera para las oxidorreductasas existen la glucosa-oxidasa, alcohol deshidrogenasa y la L- lactato —deshidrogenasa.
2.2.2. Papaína
La papaína (EC 3.4.22.2) es una cisteína proteasa hidrolasa, está basada en la requisición de un grupo tiol residual para su actividad catalítica, también conocida como sulfidril proteasa, se encuentra principalmente en el látex de la fruta Carica papaya. Está enzima ha sido estudiada ampliamente ya que presenta una alta actividad proteolítica, ha sido utilizada en la síntesis de péptidos, oligómeros y como biosensor.
Su actividad enzimática p
