GENERALIDADES Y CARACTERÍSTICAS DE LOS MARCADORES MOLECULARES DE LOS MARCADORES MOLECULARES

ORIENTADOS A LA IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES

Para la identificación de especies comerciales, los primeros marca- dores moleculares desarrollados fueron los marcadores proteicos. El análisis de alozimas y antígenos especie-específicos resulta una herra- mienta fácil, rápida y fiable para el estudio de muchos polimorfismos.

Sin embargo, presentan una serie de inconvenientes como la expre- sión diferencial según los tejidos y los diferentes estadíos de desarrollo.

Además, en el caso de productos manufacturados, el estudio de las proteínas es prácticamente imposible debido a la desnaturalización de la mayoría de ellas.

Los marcadores moleculares basados en el ADN son mucho más efectivos que los proteicos. En primer lugar, el análisis directo del genoma no se ve afectado por el tejido empleado o por el estadío de desarrollo. En segundo lugar, el ADN es más resistente a la degradación que las proteínas. No obstante, la integridad del ADN de partida es de crucial importancia y determinará la técnica que se puede emplear.

El método de conservación de los individuos influirá en la calidad del ADN: a bajas temperaturas el ADN se degrada poco y es muy estable (Cerda y Koppen 1998), pero durante el procesado por calor se degra- da rápidamente, generalmente en fragmentos de 500 pares de bases (pb) o menos (Chikuni et al. 1990; Unseld et al. 1995).

Tanto el genoma mitocondrial como el nuclear pueden ser emplea- dos en la obtención de marcadores moleculares para la identificación de especies comerciales (Tabla 1). El genoma mitocondrial presenta una abundancia importante con respecto al nuclear. Además, al ser circular ofrece una mayor resistencia a la degradación (Borgo et al.

1996), con lo que en muestras manufacturadas la amplificación por PCR de ADN mitocondrial es probablemente más fácil de conseguir que la de ADN nuclear. También los genes mitocondriales que codifi- can para proteínas presentan una tasa de evolución tal que permite su uso en la identificación de especies (Wan et al. 2004). Por su parte, el ADN nuclear, aunque puede degradarse más fácilmente, presenta más regiones a analizar y el número de loci que se pueden obtener en un solo análisis es mayor que en el caso del ADN mitocondrial.

A la hora de elegir un marcador que resulte útil en la identificación de especies se debe tener en cuenta, en primer lugar, que sea fiable, es decir, que la identificación de las especies sea inequívoca. Para ello, el marcador debe presentar variación suficiente para diferenciar especies, pero ser lo suficientemente conservado para que la variación intraespecífica no solape a la interespecífica (Vences et al. 2005).

Además, el marcador ha de ser reproducible, rápido y realizable en

Región v Referencias ADN Mitocondrial

Citocromo b PCR-RFLP Céspedes et al. 1998 ; Russell et al. 2000 ;Chapela et al. 2003 FINS Bartlett y Davidson 1992; Sotelo et al. 2001; Chapela et al. 2003 PCR-SSCP Rehbein et al. 1997; Martínez y Daníelsdóttir 2000

rDNA 16S PCR-RFLP Banks et al. 1993 ; Borgo et al. 1996 ; Carrera et al. 1999

FINS Guha et al. 2006

PCR-SSCP García-Vázquez et al. 2006

Cebadores específicos Banks et al. 1993 ; Trotta et al. 2005

rDNA 12S PCR-RFLP Borgo et al. 1996 ; Fajardo et al. 2006

FINS Lo et al. 2006

PCR-SSCP Asensio et al. 2001

Cebadores específicos Rodríguez et al. 2003; Martín et al. 2007 ADN Nuclear

rDNA 18S PCR-RFLP Kenchington et al. 1993

FINS Ijima et al. 2006 ; Santaclara et al. 2006

PCR-SSCP Livi et al. 2006

Región ITS (parcial

o completa) PCR-RFLP Heath et al. 1995 ; Toro 1998a,b; López-Piñón et al. 2002

FINS Pérez et al. 2005

Cebadores específicos Connell 2002

rDNA 5S Amplificación por PCR Carrera et al. 2000; Pérez y García-Vázquez 2004

PCR-RFLP Freire et al. 2005

Cebadores específicos Rodríquez et al. 2001 Genes de copia

única Amplificación por PCR Inoue et al. 1995

PCR-RFLP Fernández et al. 2000

PCR-SSCP Fernández et al. 2002b

ADN anónimo RAPD Martínez e Yman 1998 ; Martínez y Daníelsdóttir 2000

ISSR Balasaravanan et al. 2006; Maltagliati et al. 2006 ; Dusinsky et al. 2006 AFLP Chen et al. 2005 ; Kim et al. 2006; Maldini et al. 2006

SCAR Rego et al. 2002 ; Das et al. 2005 ; Zhang y Cai 2006 TABLA 1

Principales regiones y técnicas empleadas en la identificación de especies

un laboratorio con equipamiento rutinario. La mayoría de las técnicas empleadas para la identificación de especies se basan en un principio en la amplificación por PCR (Bossier 1999). Se pueden amplificar fragmentos específicos o bien fragmentos al azar. La amplificación de fragmentos específicos requiere de un cierto conocimiento de la secuencia a amplificar. No obstante, se han desarrollado cebadores universales que permiten la amplificación de regiones de ADN tanto nuclear como mitocondrial en un amplio rango de especies. Es el caso del ADN ribosómico nuclear y mitocondrial (White et al. 1990), o de la Citocromo C Oxidasa en mitocondrias (Folmer et al. 1994).

Cuando se emplean estos cebadores universales se pueden obtener tamaños diferentes para cada una de las especies analizadas, con lo que la diferenciación resulta en este caso muy sencilla (ej. Pérez y García-Vázquez 2004). En otras ocasiones sin embargo se obtienen fragmentos del mismo tamaño en especies incluso alejadas. Existen diferentes técnicas que permiten identificar las diferencias existentes entre los fragmentos amplificados. Una de ellas consiste en realizar una digestión con enzimas de restricción: se trata de los marcadores PCR-RFLPs, una variación de los RFLPs (Botsein et al. 1980) en donde se sustituye la hibridación por Southern Blot por la amplificación de segmentos de ADN por PCR. El resultado de la digestión se puede observar en una electroforesis en gel de agarosa. Tiene la ventaja de ser un método sencillo y relativamente rápido y económico. Además, no es necesario partir de un ADN de alto peso molecular, lo que sí ocurre en los RFLPs tradicionales. Sin embargo, tienen la desventaja de depender de enzimas de restricción, y sin conocimiento previo no es posible saber si alguna nos permitirá diferenciar las especies, con lo que generalmente se debe probar una batería amplia de enzimas de restricción para poder analizar mucho más a fondo el fragmento amplificado. Existen numerosos trabajos que utilizan la técnica de PCR-RFLP para la identificación de las especies (ej. Céspedes et al.

1998; Quintero et al. 1998 2001; Carrera et al. 1999; Russell et al.

2000; Santaclara et al. 2006)

En otras ocasiones, tras la amplificación lo que se hace es secuen- ciar el fragmento amplificado para poder identificar las diferencias en la secuencia. La obtención de la secuencia permitirá reconocer sitios

de restricción que pueden ser empleados en una digestión dirigida.

También, a partir de las diferencias encontradas, se pueden diseñar oligonucleótidos específicos con los que se amplificará de manera selectiva el fragmento de una u otra especie. Generalmente se diseñan los cebadores de manera que el tamaño del fragmento amplificado en cada una de las especies sea diferente, evitando así posibles erro- res. Según esta técnica, cualquier locus puede ser amplificado, tanto región codificante como no codificante. Si bien el desarrollo de los cebadores específicos requiere un trabajo importante, una vez desa- rrollados es una técnica sencilla y rápida. Normalmente los ensayos de identificación se realizan empleando PCR multiplex para conseguir así en un único paso la identificación de los individuos analizados. Esta técnica se ha empleado en la identificación de muchos patógenos (ej.

Kengluecha et al. 2006; Neubauer y Hess 2006; Chen et al. 2006), algas (Connell 2002), peces (ej. Trotta et al. 2005), rumiantes (Martín et al. 2007) y productos manufacturados como el foie gras (Rodríguez et al. 2001, 2003).

La secuencia obtenida se puede comparar con un grupo de secuen- cias de referencia para obtener las relaciones filogenéticas y estimar valores de distancia genética. Esta es la técnica denominada FINS (Forensically Informative Nucleotide Sequencing), desarrollada por Barlett y Davidson (1992). La identificación de las especies se realiza en este caso comparando los valores de distancias y la morfología de los árboles filogenéticos. Las secuencias analizadas presentarán una menor distancia genética con aquellas de la especie a la que pertene- cen. El fragmento amplificado suele ser de tamaño pequeño, entre las 250 pb, de manera que puede ser secuenciado rápida y fácilmente sin necesidad de clonación previa. Regiones de genes ribosomales y mito- condriales son las más empleadas para esta técnica. Algunos ejemplos se encuentran en peces (Quintero et al. 1998; Sotelo et al. 2001;

Pérez et al. 2005) y moluscos (Chapela et al. 2003; Santaclara et al.

2006).

Las diferencias entre los fragmentos amplificados también pue- den ser observadas por PCR-SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism). Esta técnica permite diferenciar fragmentos de ADN del mismo tamaño pero con secuencia distinta (Ortí et al. 1997;

Sunnucks et al. 2000). La principal ventaja es que es un método muy rápido y emplea el equipamiento habitual de un laboratorio de Biología Molecular. Además esta técnica permite discriminar entre dos secuencias que solamente se diferencian en un nucleótido (ej. Wattier et al. 2006). El producto de amplificación se desnaturaliza para gene- rar cadenas simples, y se hace migrar en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Las cadenas simples formarán conformaciones dife- rentes según su secuencia. La detección de los PCR-SSCP se realiza por tinción con plata, fluorescencia o radioactividad. Los PCR-SSCP se han utilizado, entre otros, para la identificación de diferentes especies de bivalvos y peces (Asensio et al. 2001; Livi et al. 2006; García-Vázquez et al. 2006).

Existen técnicas en las que no es necesario partir de conocimiento alguno del genoma de los organismos objeto de estudio. Los marcado- res RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) fueron los primeros en ser desarrollados (Welsh y McClelland 1990; Williams et al. 1990).

Se basan en la amplificación con un único cebador en condiciones de astringencia baja. Al emplear un cebador de tamaño muy pequeño (10 nucleótidos), es muy probable que un genoma contenga varios sitios de unión al cebador, y que además estén uno cerca de otro y en orientación opuesta. La técnica RAPD analiza el genoma completo en busca de ese tipo de repeticiones invertidas, y amplifica fragmentos de tamaño variado. El polimorfismo en los patrones RAPD puede ser debido a: (1) existen diferencias en la secuencia que hay entre dos repeticiones invertidas, con lo que se amplifican tamaños distintos o (2) alguna de las repeticiones invertidas no se encuentra en todos los individuos. Dado que no se tiene conocimiento alguno de la secuencia amplificada, no se podrá distinguir entre uno y otro tipo de variación.

La principal ventaja de la técnica RAPD es su rapidez y su mínimo desa- rrollo: tan sólo se realiza una amplificación por PCR y los productos amplificados se corren en un gel de electroforesis de agarosa. Uno de sus principales problemas es, sin embargo, su reproducibilidad (Olive y Bean 1999). Al tratarse de amplificaciones aleatorias generalmente con temperaturas de annealing muy bajas, hay que asegurarse que las bandas producidas son reproducibles. La integridad del ADN es uno de los factores más influyentes en la reproducibilidad de los resultados.

Los marcadores RAPD fallan en su utilización en individuos sometidos a procesos de enlatado, si bien hay algunos casos en los que se han obtenido resultados adecuados con ADN de muestras procesadas (Martínez e Yman 1998; Martínez y Daníelsdóttir 2000).

Otros marcadores para los que tampoco es necesario el conoci- miento previo de la secuencia y que permiten analizar una fracción importante del genoma son los ISSR y los AFLPs. Los marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) fueron descritos por primera vez en 1994 (Zietkiewicz et al. 1994). El principio de este tipo de marcadores es el mismo que el de los RAPD, aunque en este caso los cebadores empleados están constituidos por una secuencia microsatélite con los extremos degenerados. Los cebadores buscan en el genoma repeti- ciones microsatélite invertidas y amplifican la secuencia que hay entre ellas. Los marcadores ISSR han sido empleados para la identificación de especies en plantas (Balasaravanan et al. 2006), peces (Maltagliati et al. 2006) y dípteros (Dusinsky et al. 2006) entre otros.

Los marcadores AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphisms) fueron desarrollados por Vos et al. en 1995. En este caso, el ADN genómico se digiere con dos enzimas de restricción y posteriormente se colocan dos adaptadores que permiten la amplificación de los frag- mentos. Para la amplificación se emplean cebadores que presentan una parte común con los adaptadores y otra parte de bases selectivas.

La visualización de las amplificaciones debe realizarse en geles de poliacrilamida ya que se trata de patrones complejos. Pese a estos patrones complejos, los AFLPs han resultado ser útiles para la identi- ficación de plagas (Kim et al. 2006), y se ha desarrollado una base de datos de marcadores AFLPs para la identificación de 32 especies de peces, moluscos y crustáceos (Maldini et al. 2006).

Cuando al analizar los marcadores RAPD, ISSR o AFLP aparece algu- na banda característica de una determinada especie se puede intentar amplificar de manera selectiva esta banda. Esto es lo que se conoce como marcador SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) (Paran y Michelmore 1993). Para la obtención de un marcador SCAR se debe clonar y secuenciar la banda de interés para poder diseñar cebadores para amplificarla. Aunque el desarrollo de esta técnica es más laborioso que el de las descritas anteriormente, presenta una

serie de ventajas que la hacen muy atractiva: (1) se detecta un único locus; (2) la amplificación es mucho más reproducible y (3) pueden ser convertidos en marcadores codominantes, con lo que ya se podrán diferenciar heterocigotos. Algunos ejemplos de la técnica SCAR se encuentran en especies de plantas (ej. Das et al. 2005), y de peces y moluscos de interés comercial (Rego et al. 2002; Zhang y Cai 2006)

Otro tipo de marcadores son los microsatélites. También conocidos como repeticiones de secuencias simples (Simple Sequence Repeats, SSRs), son pequeños motivos de 1-8 pb repetidos en tándem un número variable de veces. Están presentes en todos los genomas estu- diados, tanto procariotas como eucariotas, y localizados en cualquier región, tanto codificante como no codificante, si bien son más abun- dantes en estas últimas. El análisis de los microsatélites consiste en la amplificación de la región microsatélite empleando cebadores que se anclan en las regiones flanqueantes. El producto de la amplificación se visualiza en un gel de poliacrilamida o en un secuenciador automá- tico, y se analiza la variación en el tamaño de los alelos amplificados.

Los microsatélites presentan tasas de mutación superiores a las de las mutaciones puntuales, y esta inestabilidad es la que los hace muy útiles como marcadores moleculares, pero, si bien han sido empleados en algunos estudios para la identificación de especies (ej. Morgan y Rogers 2001; Huvet et al. 2004), el hecho de que las amplificaciones interespecíficas presenten probabilidades de éxito relativamente bajas (Glenn y Schable 2005) reduce la utilización de los microsatélites para la identificación de especies.

3. ESTUDIOS DE IDENTIFICACIÓN