Figura 55
Caracterización del crecimiento E. Coli con NP-SiO2 en SEM.
Fuente: Reporte TESCAN MIRA3.
La figura 55, muestran nanopartículas de sílice aglomeradas en cúmulos alrededor de 100 nm de diámetro, las cuales se adhieren a las paredes celulares de las bacterias E.
Coli que presentan un tamaño promedio de 3 micrómetros. La aglomeración de las nanopartículas se manifiesta debido al potencia Z de las mismas, que generan fuerzas de atracción entre las partículas. Así también, la aglomeración se ve relacionada al proceso de sonicación previo al análisis SEM. Para este estudio, se utilizó un sonicador de tipo baño maría a 24kHz; mientras que la literatura recomienda un sonicador de brazo con una frecuencia de sonicación superior a 60kHz. Esto podría ser la causa de la formación de cúmulos. No obstante, la utilización de surfactantes en la solución de nanopartículas, el tiempo de metalización de la muestra y el secado de punto crítico antes del análisis SEM también podría ocasionar este fenómeno.
84 CONCLUSIONES
La cuantificación de bacterias E. Coli presentes en las aguas residuales municipales provenientes de la PTAR – Sicaya, mostraron 400 NMP/mL de coliformes fecales, 500 NMP/mL de coliformes totales, 8,0 × 102 UFC/ml de bacterias “E. Coli.” por el método de recuento en placa y 6,4 × 102 UFC/mL por el método de membranas. Estos datos están dentro de los parámetros regulatorios de la “OMS” y aplicables a estudios de investigación, siendo posible la utilización de un tratamiento de nanopartículas de Sílice en plantas de tratamiento con una baja carga orgánica, con el fin de estimular el crecimiento bacteriano en la etapa secundaria del proceso.
La caracterización de las nanopartículas de sílice “MKnano”, a través de la técnica DLS, determinó un diámetro hidrodinámico de 17,9 nm. El cual es cercano al diámetro reportado por el proveedor mediante la técnica APS, de 15 nm. El potencial Z de las nanopartículas se observó en -35,37 mV a 7,3 de pH y una concentración de 1mg/L. Esto demostraría una semejanza entre ambas técnicas y permite una validación técnica de los diámetros reportados por los laboratorios fabricantes. La utilización de nanopartículas de Silice de mayor diámetro, no ha sido estudiada.
Sin embargo, podría influir en un descenso en la superficie que interactúa con las bacterias E.
Coli, reduciendo la capacidad para estimular el crecimiento.
La variación de la concentración de carga orgánica tuvo poca influencia en el crecimiento bacteriano, observándose una mayor actividad bacteriana a una concentración de 40 mg/L de Carbono Orgánico Total. Esta diferencia en el crecimiento estaría ocasionada por el aumento en la carga orgánica, lo que supone un ligero incremento en los micronutrientes y macronutrientes necesarios para la vida bacteriana. Una mayor concentración de carga orgánica podría ocasionar una sobresaturación de alimento bacteriano, que influiría también en una promoción del crecimiento.
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La concentración de nanopartículas de sílice influyó de manera directa en la promoción del crecimiento bacteriano, observándose el pico más alto a una concentración de 10 mg/L para los tres grupos de concentración de carga orgánica. Así también, se registró una relación directamente proporcional a la inhibición del crecimiento bacteriano a partir de concentraciones superiores e iguales a 20 mg/Len los tres grupos de estudio. Determinándose la concentración mínima inhibitoria a los 30 mg/L. Esta promoción del crecimiento podría ser ocasionada por la trasmisión de genes resistivos de las bacterias a las futuras generaciones, e influenciado por la alta frecuencia de mutaciones de las bacterias E. Coli. Así también, las dosis subletales de nanopartículas afectarían en un nivel tolerable para la viabilidad de estos microrganismos, lo que estimularía la capacidad resistiva de las bacterias, como si se tratase de una intoxicación controlada.
El crecimiento de bacterias E. Coli ATCC 25922 en presencia de 20 mg/L, 30 mg/L y 40 mg/L de Carbono Orgánico Total, mostró una ligera promoción al ser tratadas con nanopartículas de sílice a concentraciones menores a 10 mg/L; mientras que, a concentraciones superiores a ésta, se observó una inhibición proporcional a la concentración de nanopartículas.
Esta interacción bacteria - nanopartícula, indicaría de las bacterias E. Coli desarrollan inmunidad ante nuevos tratamientos con en cortos periodos de tiempo. Siendo necesaria mas investigaciones a fin de encontrar soluciones para afrontar la capacidad bacteriana acelerada de mutar a cepas multirresistentes.
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RECOMENDACIONES
• Evaluar el crecimiento de bacterias E. Coli utilizando composiciones distintas de agua residual municipal, utilizando concentraciones de Carbono Orgánico Total superiores a 40 mg/L. Para evaluar el comportamiento de estas bacterias en condiciones de mayor contaminación bacteriana.
• Evaluar el tratamiento de nanopartículas de óxido de silicio en la promoción o inhibición de otras bacterias comúnmente encontradas en aguas residuales. Debido a que en las aguas residuales se encuentran diferentes tipos de patógenos que podrían inactivar el tratamiento con NPs-SiO2.
• Evaluar el crecimiento de bacterias E. Coli tratadas con nanopartículas de sílice a través de otras técnicas como la Densidad Óptica, Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM) o Espectroscopia infrarroja de Transformada de Fourier (F- TIR). A fin de verificar los datos reportados por estas técnicas.
• Evaluar el crecimiento de bacterias E. Coli con otro tipo de nanopartículas como Magnesio, Zinc, Plomo, Titanio o Plata en busca de una promoción en su crecimiento. Para evaluar cual sería el tipo de nanopartícula que brinde mayor promoción en el crecimiento bacteriano de E. Coli.
• Evaluar el crecimiento de bacterias E. Coli con concentraciones de nanopartículas de silicio inferiores a 5 ppm y superiores a 40 ppm.
• Evaluar el crecimiento de bacterias E. Coli con nanopartículas de silicio a temperaturas de incubación inferiores a 37 ºC y por periodos de incubación superiores a 24 horas. Con el objetivo de ampliar el conocimiento sobre el crecimiento bacteriano de estas bacterias en otras condiciones climáticas.
• Caracterizar nanopartículas de óxido de silicio por DLS a diferentes tiempos de
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sonicación, con la adicción de surfactantes y a diferentes niveles de pH. Verificando así, si estas nanopartículas mantienen sus propiedades fisicoquímicas bajo otras condiciones de caracterización.
• Caracterizar nanopartículas de óxido de silicio por otras técnicas como APS, TEM o SEM. Para obtener no solo un análisis hidrodinámico de sus dimensiones, sino también de su morfología interna.
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ANEXOS
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ANEXO 1. PROCEDIMIENTO DEL MÉTODO
“CEROS DE POISON”
A. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO a) Preparación de medios de cultivo
• Preparación el Caldo Bilis Verde Brillante:
✓ Medir 360 mL de agua destilada (con probeta de 500 mL).
✓ Pesar 14,4 g de Caldo Bilis Verde Brillante en una balanza.
✓ Mezclar en un balón de fondo plano (de 1000 mL) hasta disolución total del colorante verde.
✓ Repartir 10 mL a cada tubo de 15x150 mm (con una pipeta de 10 mL) y colocar la campana Durham invertida haciendo que se llene de caldo en su interior.
✓ Tapar cada tubo con algodón, forrar con papel y atar con pabilo.
✓ Colocar todos los tubos repartidos en dos tarros de lata grandes.
b) Esterilizar en autoclave (121°C a 15 psi. por 15 minutos)
• 6 tubos (15x150 mm) con 9 mL c/u de agua destilada (en un tarro de lata).
• 36 tubos (15x150 mm) con 10 mL c/u de Caldo Brila más campana Durham (en dos tarros de lata).
• 2 matraces (500 mL) con 150 mL c/u de Agar MacConkey.
B. DILUCIÓN DE MUESTRAS
• De una muestra de agua residual 1 mL a un tubo con 9 mL de agua destilada estéril y agitar vigorosamente; con esto se consigue una dilución 10-1. Rotular adecuadamente.
• Transferir 1 mL de la dilución 10-1 a uno de los tubos con 9 mL de agua destilada
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estéril y homogenizar bien; con esto se consigue una dilución 10-2. Rotular adecuadamente.
• Finalmente, transferir 1 mL de la dilución 10-2 a otro de los tubos con 9 mL de agua destilada estéril y homogenizar bien; con esto se consigue una dilución 10-3. Rotular adecuadamente.
• Repetir lo mismo para la otra muestra de agua residual.
C. SIEMBRA DE LA MUESTRA EN LOS MEDIOS DE CULTIVO (Trabajar con las debidas condiciones de asepsia y desinfección)
a) Colimetría total
• Con la misma pipeta con la que se hicieron las diluciones sembrar 1 mL de cada dilución -empezando por la menor (10-3)- a una serie de tres tubos (15x150 mm) que contienen caldo Brila más campana Durham, homogenizar cuidadosamente.
• Repetir lo mismo para el resto de diluciones y tubos con caldo.
• Rotular y llevar a incubación en baño maría a 37°C por 24 horas.
b) Colimetría fecal
• Con una pipeta sembrar 1 mL de cada tubo con caldo Brila (incubado previamente) hacia su correspondiente juego de tubos, empezando por la menor (10-3) y repetir lo mismo para el resto de tubos.
• Rotular y llevar a incubación en baño maría a 37°C por 24 horas.
D. LECTURA E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Transcurrido el tiempo de incubación se realizó la lectura de placas de la siguiente manera:
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• Verificar presencia de gas en las series de tubos incubados en baño maría para Colimetría total y fecal según su dilución.
• Anotar los resultados en una Ficha de Recolección de datos.
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ANEXO 2. PROCEDIMIENTO DEL MÉTODO
“RECUENTO EN PLACA”.
A. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO a) Esterilizar en el Horno (160°C por 30 minutos)
• 4 pipetas de 1mL (debidamente envueltas en papel Kraft).
• 18 placas Petri (debidamente envueltas en papel Kraft).
b) Preparación del Agar MacConkey:
✓ Medir 150 mL de agua destilada (con probeta de 250 mL).
✓ Pesar 7,5 g de Agar MacConkey en una balanza.
✓ Mezclar en un matraz (de 500 mL) y calentar en hornilla eléctrica hasta inicio de ebullición (evitar que se derrame).
✓ Tapar el matraz con algodón, forrar con papel y atar con pabilo.
✓ Repetir lo mismo con otro matraz.
B. SIEMBRA DE LA MUESTRA EN LOS MEDIOS DE CULTIVO (Trabajar con las debidas condiciones de asepsia y desinfección)
a) Recuento de E. Coli
• Realizar diluciones de la muestra de agua residual para obtener concentraciones 10-1 , 10-2 y 10-3 . Con la misma pipeta con la que se hicieron las diluciones sembrar 1 mL de cada dilución -empezando por la menor (10-3) a tres placas estériles pero vacías.
• Repetir lo mismo para el resto de diluciones; luego incorporar el Agar MacConkey líquido del matraz a una temperatura aproximada de 45–50°C.
• Homogenizar en forma de “8” sobre la mesa hasta que se mezcle la dilución con el agar licuado.
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• Esperar a que solidifique. Rotular debidamente, envolverlas y llevar a incubación –posición invertida- en estufa a 37°C por 48 horas.
C. LECTURA E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Transcurrido el tiempo de incubación realizar la lectura de placas de la siguiente manera:
• Contar el total de colonias de color rojo/rosado de cada placa con Agar MacConkey.
Tener en cuenta la dilución en cada caso.
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ANEXO 3. PROCEDIMIENTO DEL MÉTODO RECUENTO POR
“MEMBRANAS”.
A. PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO a) Esterilizar en el Horno (160°C por 30 minutos)
• 3 pipetas de 10mL (debidamente envueltas en papel Kraft).
• 6 placas Petri (debidamente envueltas en papel Kraft).
• 2 frascos para colección de muestra de agua.
• 1 pinza
b) Preparación de medios de cultivo
• Preparar el Agar MacConkey de la siguiente manera:
✓ Medir 150 mL de agua destilada (con probeta de 250 mL).
✓ Pesar 7,5 g de Agar MacConkey en una balanza.
✓ Mezclar en un matraz (de 500 mL) y calentar en hornilla eléctrica hasta inicio de ebullición (evitar que se derrame).
✓ Tapar el matraz con algodón, forrar con papel y atar con pabilo.
✓ Repetir lo mismo con otro matraz.
c) Esterilizar en autoclave (121°C a 15psi o 103421.39 Pa, por 15 minutos)
• 6 fiolas (100 ml) con 90 mL c/u de agua destilada.
• 2 matraces (500 mL) con 150 mL c/u de Agar MacConkey.
100 B. DILUCIÓN DE MUESTRAS
• De una muestra de agua residual 10 mL a una fiola con 90 mL de agua destilada estéril y agitar vigorosamente; con esto se consigue una dilución 10-1. Rotular adecuadamente.
• Transferir 10 mL de la dilución 10-1 a uno de las fiolas con 90 mL de agua destilada estéril y homogenizar bien; con esto se consigue una dilución 10-2. Rotular adecuadamente.
• Finalmente, transferir 10 mL de la dilución 10-2 a otro de las fiolas con 90 mL de agua destilada estéril y homogenizar bien; con esto se consigue una dilución 10-3.
Rotular adecuadamente.
• Repetir lo mismo para la otra muestra de agua residual.
C. FILTRACION AL VACION POR MEMBRANA (Trabajar con las debidas condiciones de asepsia y desinfección)
• Con una pinza estéril retirar del empaque una membrana y colocarla adecuadamente en el equipo de filtración la vacío.
• Encender la bomba y filtrar cada dilución preparada, posteriormente colocar cada membrana en una placa Petri con Agar MacConkey.
• Eliminar con la pinza cualquier bolsa de aire presente al interior de la membrana.
• Esperar a que solidifique. Rotular debidamente, envolverlas y llevar a incubación – posición invertida- en estufa a 37°C por 48 horas.
D. LECTURA E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Transcurrido el tiempo de incubación realizar la lectura de placas de la siguiente
101 manera:
• Contar el total de colonias de color rojo/rosado de cada placa con Agar MacConkey.
Tener en cuenta el factor de dilución en cada caso.
• Anotar los resultados en una Ficha de Recolección de datos.
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ANEXO 4. REPORTE DE ANALISIS DLS – DIAMETRO HIDRODINAMICO NANOPARTICULAS SIO2
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ANEXO 5. REPORTE DE ANALISIS DLS – POTENCIAL Z - NANOPARTICULAS SIO2
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ANEXO 6. REPORTE DE ANALISIS TOC – AGUA SINTETICA –COT 20, COT 30 Y COT 40
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ANEXO 7. PROCEDIMIENTO PARA LA EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO (COMPARACIÓN POR RECUENTO EN PLACA) a) Inoculación de viales con bacterias E. Coli
• En condiciones de asepsia y con ayuda de un asa bacteriológica se tomaron las colonias morfológicamente más representativas de un cultivo previamente aislado.
• En un vaso de precipitación de 250 mL se agregó 100 mL de agua sintética municipal preparada.
• Se realiza la siembra con el asa esterilizada por la flama del mechero Bunsen sobre las paredes del recipiente inclinado 45º con respecto a la vertical, dibujando estrías sobre la superficie.
• La mezcla se agita con una pastilla magnética a 800 rpm, durante 10 minutos.
• En diez viales de 15 mL se vierte 10 mL de la solución bacteriana.
• Se llevan los viales a un agitador Vortex durante 10 minutos para homogenizar las muestras.
• Se toma 1 mL de la solución bacteriana de cada vial y se inocula sobre una placa Petri conteniendo Agar MacConkey (preparado según el procedimiento detallado en la sección 2.2.1.1, subsección b).
• Se pone en incubación la placa Petri tratada durante 48 horas a 37 ºC.
• Se repite el procedimiento para los diferentes niveles de COT del agua sintética municipal preparada.
• Las muestras del grupo de control al que no se le aplica el tratamiento, se realizan por triplicado para cada concentración de NPs – SiO2 y nivel de COT.