tesis

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA QUIMICA

PRESENTADO POR LOS BACHILLERES:

HUAMAN ALVARADO ERICK ANTHONY MANDUJANO GALARZA ORLANDO

PARA OPTAR EL TITULO PROFESIONAL DE:

INGENIERO QUÍMICO

HUANCAYO - PERÚ 2021

EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO DE BACTERIAS E. Coli SOBRE NANOPARTICULAS DE SiO2 CON CONCENTRACIÓN DE

CARGA ORGÁNICA Y NANOPARTICULAS

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ii ASESOR:

Dr. Orlando Alfredo VILCA MORENO

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iii DEDICATORIA

Erick A. Huamán Alvarado.

“Dedico esta tesis a Rosas Mandujano e Ilda Galarza, quienes a lo largo de mi vida han velado por mi bienestar y educación, depositando su entera confianza en cada reto que se me ha presentado. Es por ellos, que soy lo que soy ahora.”

Orlando Mandujano Galarza

“A Dios, a mis padres Miguel y Carmen, y a Brenda por todo”

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iv

AGRADECIMIENTOS

A Dios, por guiarnos en las metas propuestas de nuestro aprendizaje.

A nuestros padres, por el apoyo incondicional, comprensión y su buena influencia en nuestra formación profesional.

A la Universidad Nacional del Centro del Perú, por la asesoría y el financiamiento en el concurso de Tesis de Pregrado 2019, gracias al cual se logró concretar con éxito este proyecto.

A nuestro asesor, Dr. Orlando Alfredo VILCA MORENO, por todo su apoyo brindado, asesorías y consejos para encaminarnos al final de nuestro proyecto.

Al Ms. Ever Florencio INGARUCA ALVAREZ, docente de la Universidad Nacional del Centro del Perú, quien nos brindó las facilidades y consejos, para realizar la experimentación de nuestro proyecto de tesis en el laboratorio de Nanotecnología de la Facultad de Ingeniería Química.

Al Mg. Jaime WESTER CAMPOS, docente de la Universidad Peruana de los Andes, por compartir sus conocimientos y experiencia en el ámbito de la microbiología, brindarnos la presteza necesaria para desarrollar la experimentación de nuestro trabajo en el laboratorio de microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad Peruana de los Andes.

A la Ing. Vilma Reyes de la Cruz, docente de la Facultad de Industrias Alimentarias - UNCP por el apoyo en la activación bacteriana de cepas liofilizadas y por ampliar nuestros conocimientos sobre microbiología aplicada a la industria alimentaria.

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v RESUMEN

En el presente trabajo de investigación se evaluó el crecimiento de bacterias E. Coli en una agua residual sintética, variando la concentración de Carbono Orgánico Total y la concentración de nanopartículas de óxido de silicio (NP-SiO2).

Se cuantificó las bacterias E. Coli de las aguas provenientes de la planta de tratamiento de aguas residuales “Sicaya”, por el método fenotípico y las técnicas de colimetría, recuento en placa y filtración al vacío por membranas, a fin de obtener datos de comparación con respecto a las pruebas en laboratorio. Las bacterias E. Coli empleadas (ATCC 25922) se activaron con Trypto-Casein Soy Agar (TSA) para su posterior replicación, aislamiento y uso.

Se caracterizaron las nanopartículas utilizadas, en un equipo de dispersión dinámica de luz (DLS). En el estudio de la actividad microbiana, se prepararon soluciones de agua residual sintética con 20, 30 y 40 mg/L de Carbono Orgánico Total (COT), sobre las cuales se inocularon las bacterias E. Coli en un reactor batch y se suministraron soluciones de nanopartículas de óxido de silicio a 5, 10, 20, 30 y 40 mg/L. Se observaron los resultados, haciendo uso de la técnica de comparación por recuento en placa, antes y después del tratamiento, con un diseño de series cronológicas múltiples.

Se obtuvo una cuantificación de bacterias E. Coli en las aguas residuales municipales por, colimetría fecal, colimetria total, recuento en placa y filtración en membrana de: 400 número más probable por mililitro (NMP/mL), 500 NMP/mL, 8,0 x 10² unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL) y 6,4 x 10² (UFC/mL) respectivamente. En la caracterización de nanopartículas de óxido de silicio, se obtuvo un diámetro hidrodinámico de 17,9 nm por la técnica DLS y un potencial Z de -35,37 mV a una concentración de 1mg/L y

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vi

7,3 pH. El estudio del crecimiento bacteriano mostró una concentración mínima inhibitoria a 30 mg/L de nanopartículas de sílice en los tres grupos de estudio (concentraciones de carga orgánica igual a 20, 30 y 40 de COT), observándose una ligera promoción en el crecimiento bacteriano en concentraciones menores e iguales a 10 mg/L; y posteriores a ésta, una inhibición directamente proporcional a la concentración de nanopartículas de óxido de silicio.

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vii ABSTRACT

In the present research work, the growth of E. Coli bacteria in synthetic wastewater was evaluated, varying the concentration of Total Organic Carbon and the concentration of silicon oxide nanoparticles (NP-SiO2).

E. Coli bacteria were quantified from the waters coming from the “Sicaya” wastewater treatment plant, by the phenotypic method and the techniques of colimetry, plate count and membrane vacuum filtration, in order to obtain comparison data. with respect to laboratory tests. The E. Coli bacteria used (ATCC 25922) were activated with Trypto-Casein Soy Agar (TSA) for their subsequent replication, isolation and use. The nanoparticles used were characterized in a dynamic light scattering equipment (DLS). In the study of microbial activity, synthetic wastewater solutions were prepared with 20, 30 and 40 mg / L of Total Organic Carbon (TOC), on which E. Coli bacteria were inoculated in a batch reactor and solutions were supplied of silicon oxide nanoparticles at 5, 10, 20, 30 and 40 mg / L. The results were observed, using the plate count comparison technique, before and after treatment, with a multiple time series design.

A quantification of E. Coli bacteria in municipal wastewater was obtained by fecal colimetry, total colimetry, plate count and membrane filtration of: 400 most probable number per milliliter (NMP / mL), 500 NMP / mL, 8, 0 x 102 colony-forming units per milliliter (CFU / mL) and 6.4 x 102 (CFU / mL) respectively. In the characterization of silicon oxide nanoparticles, a hydrodynamic diameter of 17.9 nm was obtained by the DLS technique and a Z potential of -35.37 mV at a concentration of 1mg / L and 7.3 pH. The study of bacterial growth showed a minimum inhibitory concentration at 30 mg / L of silica nanoparticles in the

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viii

three study groups (concentrations of organic load equal to 20, 30 and 40 of TOC), observing a slight promotion in bacterial growth in concentrations less than and equal to 10 mg / L; and subsequent to this, an inhibition directly proportional to the concentration of silicon oxide nanoparticles.

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ix

INTRODUCCION

En el tratamiento de aguas residuales, la concentración de la población bacteriana es una variable difícil de controlar durante el proceso debido al crecimiento exponencial. En la etapa secundaria, los procesos biológicos de degradación que realizan las bacterias a la materia orgánica presente en el agua residual son necesarios. Sin embargo, en la etapa terciaria es imprescindible su eliminación por técnicas como la desinfección UV y ozonificación. A fin de dar nuevas soluciones a este problema, se viene tratando las aguas residuales con técnicas modernas, como la utilización de nanomateriales con propiedades antibacterianas. Pero poco se ha estudiado la interacción de estos nanomateriales con las poblaciones bacterianas en las etapa secundaria.

En respuesta a este vacío en el conocimiento, se han desarrollado estudios para establecer la relación nanomateriales – bacteria, con respecto a su crecimiento, promoción, supresión e inhibición. Algunos de estos estudios muestran una promoción del crecimiento y de propiedades resistivas en algunas bacterias en contacto con nanomateriales.

Con esta premisa, surge la presente investigación teniendo como objetivo evaluar el crecimiento de bacterias E. Coli en contacto con nanopartículas de óxido de silicio, variando la concentración de Carbono Orgánico Total, lo cual supondría diferentes escenarios de interacción nanomateriales - bacteria en una planta de tratamiento de aguas residuales (PTAR).

Conocida la propiedad antibacterial de las nanopartículas de sílice, se variará la concentración de nanopartículas para obtener una concentración mínima inhibitoria. Obteniendo así, datos relevantes de la interacción entre el nanomaterial y los microorganismos, aportando mayor información a este rubro dentro de las aplicaciones de los nanomateriales.

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x OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL

Evaluar el crecimiento de bacterias E. Coli variando la concentración de Carbono Orgánico Total y la concentración de nanopartículas de SiO2 (NPs – SiO2)en un agua residual sintética.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Cuantificar las bacterias E. Coli presente en las aguas residuales municipales

• Evaluar la variación de la concentración de materia orgánica en la formación y el crecimiento de las bacterias E. Coli sobre nano partículas de SiO2

• Analizar la variación de la concentración de las nanopartículas de SiO2 en el crecimiento de las bacterias E. Coli.

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xi

SIMBOLOGIA UTILIZADA

SIMBOLO SIGNIFICADO UNIDADES

OEFA Organismo de Evaluación y Fiscalización Ambiental

ECA Estándares de Calidad Ambiental del Agua

LMP Límites Máximos Permisibles.

PTAR Planta de Tratamiento de Aguas

Residuales

MINAM Ministerio del Ambiente

E. Coli Escherichia coli

TSA Trypto-Casein Soy Agar

EPS sustancia polimérica extracelular McConkey medio de cultivo selectivo para bacterias

EMB medio ligeramente selectivo para el aislamiento y la diferenciación de bacilos

gram negativos entéricos Müller Hilton medio de cultivo microbiológico

utilizado comúnmente para realizar pruebas de susceptibilidad

ATCC 25922 microorganismos certificados por American Type Culture Collection

COT Carbono Orgánico Total

DRX difracción de rayos X

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xii

FT-IR Espectrometría infrarroja por

transformada de Fourier

TEM Microscopia electrónica de

transmisión

SEM Microscopia Electrónica de Barrido

APS Dimensionamiento de partículas

aerodinámicas

mV mili Voltios

nm Nanómetros

UFC Unidades formadoras de colonias

pH Potencial de Hidrogeno 0-14

ppm Partes por millón mg/L

NMP Números más probables

NP_S− SiO₂ Nanopartículas de óxido de silicio o sílice

P Población

°C Grados Celsius

DLS Difracción de luz dinámica

R Asignación de aleatoriedad o azar

G Grupo de experimentación (G1 = grupo 1) O Medición al grupo de experimentación

(O1 = Medición 1)

X Estímulo o tratamiento (X1 = tratamiento) 1)

─ Ausencia de estímulo o tratamiento

(13)

xiii (Grupo de control)

RG Grupo de experimentación que posee condición de aleatoriedad

G1 Muestras de bacterias E. Coli en solución de agua sintética municipal con 20 COT

mg/L

X1 NPs – SiO2 en solución acuosa ppm

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xiv

INDICE DE CONTENIDO

DEDICATORIA ... iii

AGRADECIMIENTOS ... iv

RESUMEN ... v

ABSTRACT ... vii

INTRODUCCION ... vii

OBJETIVOS ... x

OBJETIVO GENERAL ... x

OBJETIVOS ESPECIFICOS ... x

SIMBOLOGIA UTILIZADA ... xi

INDICE DE CONTENIDO ... xiv

INDICE DE TABLAS ... xx

INDICE DE FIGURAS... xxii

INDICE DE FOTOGRAFIAS ... xxvi

CAPITULO I ... 1

REVISION BIBLIOGRAFIA ... 1

1.1ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN ... 1

1.1.1Antecedentes Nacionales ... 1

1.1.2Antecedentes Internacionales ... 4

1.2BASES TEORICAS ... 10

1.2.1 Aguas Residuales Municipal ... 10

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xv

1.2.2 Límites Máximos Permisibles Para los Efluentes De PTAR ... 10

1.2.3 Parámetros (Físicos –Químicos y Microbiológicos-Parasitológicos) para Aguas Residuales Municipales (PTAR) ... 10

1.2.4 E. Coli. ... 11

1.2.5 Morfología de las Bacterias E. Coli. ... 12

1.2.6 Métodos de Identificación Bacteriana. ... 12

1.2.7 Cuantificación de Bacterias E. Coli. ... 13

1.2.8 Técnica de Diluciones en Tubo Múltiple (Número Más Probable o NMP) ... 13

1.2.9 Técnica Simplificada en Placa para Cuantificar Bacterias E. Coli. ... 14

1.2.10 Técnica de Filtración por Membrana en Agar Mac Conkey ... 17

1.2.11 Medio de Cultivo Específicos para E. Coli. ... 19

a) Agar Mac Conkey ... 19

a.1) Composición de Agar Mc Conkey ... 19

1.2.12 Cepas Bacterianas de E. Coli ATCC 25922. ... 20

a) Definición de Cepas ... 20

a.1) Activación de Cepas ... 21

1.2.13 Crecimiento Bacteriano ... 22

a) Crecimiento en Termino de Numero de Bacterias. ... 22

b) Modelo Matemático del Crecimiento Bacteriano. ... 24

1.2.14 Nanopartículas ... 25

a) Definición ... 25

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xvi

a.1) Nanopartículas de Oxido de Silicio (NPs – SiO2). ... 26

b) Caracterización de Nanopartículas ... 27

1.2.15 Dispersión de la Luz Dinámica (DLS). ... 27

a)Sonicación ... 28

b) Potencial Z ... 29

c) Surfactantes ... 30

d)Filtros de Jeringa para la Caracterización de Nanoparticulas ... 31

1.2.16 Agua Sintética ... 31

a) Composición ... 31

b) Carbono Orgánico Total (TOC) ... 32

c)Análisis de Carbono Orgánico Total (TOC) ... 32

CAPITULO II... 33

PARTE EXPERIMENTAL ... 33

2.1 MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS ... 33

2.1.1 Materiales ... 33

2.1.2 Reactivos ... 34

2.1.3 Equipos e Instrumentos ... 36

2.2 PROCEDIMIENTOS ... 38

2.2.1 Cuantificación de Bacterias E. Coli de Agua Residual Municipal y Caracterización de Nanoparticulas ... 38

a) Método de Numero Más Probable (NMP) o ceros de Posición ... 38

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xvii

b)Método de Recuento en Placa. ... 40

c) Método por Membranas ... 41

d) Caracterización de Nanopartículas de SiO2 ... 42

d.1) Dispersión de Luz Dinámica (DLS)... 42

d.1.1) Diámetro Hidrodinámico ... 42

d.1.2) Potencial Z ... 43

2.3 Evaluación de las bacterias E. Coli. ... 44

2.3.1 Evaluación del Crecimiento con Materia Orgánica ... 44

a) Preparación de Aguas Sintética Municipal ... 44

2.3.2 Bacterias E. Coli. ... 45

a)Aislamiento a Partir de Cultivos Previos ... 45

b) Cultivo a Partir de Cepas Comerciales ... 46

2.4 Evaluación del crecimiento bacteriano sobre NPs - SiO2 ... 48

2.4.1 Preparación de Solución de NPs - SiO2... 49

2.4.2 Comparación por Recuento en Placa... 50

2.5 DISEÑO EXPERIMENTAL ... 51

2.5.1 Variables Independientes ... 51

2.5.2 Variable Dependiente ... 51

CAPITULO III ... 54

TRATAMIENTO Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ... 54 3.1 CUANTIFICACION DELAS BACTERIAS E. Coli EN AGUA RESIDUAL

(18)

xviii

MUNICIPALY CARACTERIZACIÓN DE NANOPARTICULAS. ... 54

3.1.1 Métodos de Número Más Probable (NMP). ... 54

3.1.2 Método de Recuento en Placa ... 55

3.1.3 Método por Membranas ... 57

3.1.4 Caracterización de Nanoparticulas ... 58

Diámetro Hidrodinámico ... 58

Potencial Z ... 61

3.2 Evaluación de las bacterias E. Coli ... 63

3.2.1 Evaluación del Crecimiento de las Bacterias E. Coli con Materia Orgánica . 64 a) Método de Comparación por Recuento en Placa ... 64

a.1) Crecimiento de las Bacterias E. Coli con 20 mg/L de Carga Orgánica ... 64

3.2.2 Evaluación del Crecimiento de las Bacterias E. Coli con Nanoparticulas de Oxido de Silicio ... 67

a) Evaluación del Crecimiento de las Bacterias E. Coli con la Concentración de NPs – SiO2 a 5 ppm. ... 68

b) Evaluación del Crecimiento de las Bacterias E. Coli con la Concentración de NPs – SiO2 a 10 ppm. ... 70

c)Evaluación del Crecimiento de las Bacterias E. Coli con la Concentración de NPs – SiO2 a 20 ppm... 73 d)Evaluación del Crecimiento de las Bacterias E. Coli con la Concentración de NPs

(19)

xix

– SiO2 a 5 ppm... 76

e)Evaluación del Crecimiento de las Bacterias E. Coli con la Concentración de NPs – SiO2 a 40 ppm... 79

3.3 CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE LAS BACTERIAS E. Coli CON NPs EN MICROSCOPIA ELECTRONICA DE BARRIDO (SEM) ... 83

CONCLUSIONES... 84

RECOMENDACIONES ... 86

BIBLIOGRAFIA ... 88

ANEXOS ... 93

(20)

xx

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Límites Máximos Permisibles para los Efluentes de PTAR. ... 10

Tabla 2 Aguas superficiales destinadas a la producción de agua potable. ... 11

Tabla: 3 Composición de Agar Mc Conkey. ... 19

Tabla: 4 Composición de agua residual sintética. ... 31

Tabla: 5 Diseño experimental. ... 52

Tabla: 6 Cuantificación de coliformes totales por NMP de agua residual – PTAR Sicaya. .... 54

Tabla: 7 Cuantificación de E. Coli por recuento en placa de agua residual – PTAR Sicaya. . 56

Tabla: 8 Cuantificación de E. Coli por filtración al vacío de agua residual – PTAR Sicaya. . 57

Tabla: 9 Resultados de la caracterización de NP-SiO2 por Dispersión Dinámica de Luz – Diámetro Hidrodinámico. ... 59

Tabla: 10 Resultados de crecimiento bacteriano sobre NPs-SiO2 y COT 20. ... 117

Tabla: 11 Resultados de crecimiento bacteriano sobre NPs-SiO2 y COT 30. ... 117

Tabla: 12 Crecimiento bacteriano de E. Coli en el Grupo RG3 (40 COT). ... 118

Tabla: 13 Crecimiento bacteriano de E. Coli sobre 5 ppm de NPs-SiO2 . ... 118

Tabla: 14 Porcentajes de promoción o inhibición del crecimiento bacteriano de E. Coli sobre 5 ppm de NPs-SiO2. ... 118

Tabla: 15 Crecimiento bacteriano de E. Coli sobre 10 ppm de NPs-SiO2. ... 119

(21)

xxi

Tabla: 20 Porcentajes de promoción o inhibición del crecimiento bacteriano de E. Coli sobre 30 ppm de NPs-SiO2. ... 121 Tabla: 21 Crecimiento bacteriano de E. Coli sobre 40 ppm de NPs-SiO2. ... 121 Tabla: 22 Porcentajes de promoción - inhibición del crecimiento bacteriano de E. Coli sobre

40 ppm de NPs-SiO2. ... 122

(22)

xxii

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Crecimiento de E. Coli en medio de cultivo agar MacConkey ………..………12 Figura 2. Determinación de NMP de Coliformes en Agua ………..…….14 Figura 3. Esquema simplificado del proceso de dilución de muestras de agua residual……….16 Figura 4. Recuento en placa de bacterias E. Coli sobre agar MacConkey a diferentes

diluciones ……….…17 Figura 5. Técnica de Filtración por Membrana en Agar MacConkey………18 Figura 6. Cepa Bacteria E. Coli ATCC 25922……….…..………20 Figura 7. Proceso de activación, replica y preservación de cepas E. Coli ATCC 25922 ...21 Figura 8. Curva de crecimiento bacteriano típica, en términos de números de bacterias ….... 23 Figura 9. Crecimiento exponencial de organismos unicelulares ………..…… 25 Figura 10. Escala de tamaños ………..………… 26 Figura 11. Representación esquemática de una NP- SiO2 ………...………. 27 Figura 12. Diámetro Hidrodinámico de una NP por DLS ………... 28 Figura 13. Esquema de Sonicación de Soluciones ……….………. 29 Figura 14. Esquema del Potencial Z de una partícula ………..……….. 30 Figura 15. Diluciones de muestra de agua residual en medio de cultivo caldo bilis

verde brillante (Brila) ………..….. 39 Figura 16. Post – Incubación de muestras con caldo Brila en el equipo baño María

de marcar Memmert……….… 40 Figura 17. Recuento en placa de muestras con bacterias E. Coli inoculadas en medio

de cultivo agar MacConkey ……….………….40 Figura 18. Filtración demuestras en equipo de filtración al vacío sobre membranas

de 0,45 micrómetros de tamaño de poro ………...……41

(23)

xxiii

Figura 19. Caracterización de las nanopartículas de SiO2 en el Equipo DLS

“NICOMP PSS Z300” ………...………..42 Figura 20. Caracterización de las nanopartículas de SiO2 en el equipo DLS NICOMP PSS Z3000 por el método de “Z” Potencial ……….……….……….. 43 Figura 21. Preparación de agua residual sintética ……….……... 45 Figura 22. Aislamiento de bacterias E. Coli ………...………. 46 Figura 23. Activación de bacterias E. Coli ATCC 25922 ……… 47 Figura 24. Cepas comerciales de E. Coli ATCC 25922 ………..……… 47 Figura 25. Colonias Activas de Bacterias E. Coli ATCC 25922 ………...……….. 48 Figura 26. Soluciones de nanopartículas de Sílice en baño ultrasónico …………..………… 49 Figura 27. Recuento en placa de bacterias E. Coli ATCC 25922 tratas con NPs - SiO2…….. 51 Figura 28. Tubos de ensayo y campas Durham con presencia de gas para

resultados de Colimetria ………..……… 55 Figura 29. Recuento en placa de bacterias E. Coli provenientes de agua residual

Municipal ………..…….. 56 Figura 30. Recuento de Colonas E. Coli por el Método de Membranas ……….……… 57 Figura 31. Resultados de Diámetro Hidrodinámico de Nanopartículas de Sílice …………... 59 Figura 32. Diámetro Hidrodinámico de NP- SiO2 a diferentes concentraciones ………...60 Figura 33. Comparación de Diámetro NP - SiO2 ………...……….. 61 Figura 34. Resultado Potencial Z de Nanopartículas de Sílice ……… 62 Figura 35. Potencial Z de Nanopartículas de Sílice a Diferentes concentraciones

de NP - SiO2 ……….62

Figura 36. Comparación del Potencial Z de Nanopartículas de Sílice ………. 63 Figura 37. Curvas de Crecimiento de E. Coli a diferentes concentraciones de

NP - SiO2 y COT 20………...………... 64

(24)

xxiv

Figura 38. Curvas de Crecimiento de E. Coli a diferentes concentraciones de

NP - SiO2 y COT 30………...………... 65

Figura 39. Curvas de Crecimiento de E. Coli a diferentes concentraciones de

NP - SiO2 y COT 40………...……... 66

Figura 40. Curvas de crecimiento de E. Coli a diferentes concentraciones de

Carga Orgánica tratadas con NPs- SiO2 5 mg/L ……….. 68 Figura 41 Curvas de Promoción – Inhibición de E. Coli a diferentes concentraciones de Carga Orgánica tratadas con 5 mg/L de NPs- SiO2 ……….. 69 Figura 42. Curvas de Promoción – Inhibición de E. Coli ATCC 25922 con 5 mg/L a diferentes Cargas Orgánicas en Fase Estacionaria ………...……….... 70 Figura 43. Curvas de crecimiento de E. Coli a diferentes concentraciones de

Carga Orgánica tratadas con 10 mg/L de NPs- SiO2 ………..………….. 71 Figura 44. Curvas de Promoción – Inhibición de E. Coli ATCC 25922 con 10 mg/L

a diferentes Cargas Orgánicas ……….………72 Figura 45. Curvas de Promoción – Inhibición de E. Coli ATCC 25922 con 10 mg/L

a diferentes Cargas Orgánicas en Fase Estacionaria ……….…73 Figura 46. Curvas de crecimiento de E. Coli ATCC 25922 con 20 mg/L de NPs -SiO2

a diferentes Cargas Orgánicas ……….…………..……….. 74 Figura 47. Curvas de Promoción – Inhibición de E. Coli ATCC 25922 con 20 mg/L

de NPs -SiO2 a diferentes Cargas Orgánicas………75 Figura 48. Curvas de Promoción – Inhibición de E. Coli ATCC 25922 con 20 mg/L a diferentes Cargas Orgánicas en Fase Estacionaria ………..……….... 76 Figura 49. Curvas de crecimiento de E. Coli ATCC 25922 con 30 mg/L de NPs -SiO2

a diferentes Cargas Orgánicas ……….………..……….. 77 Figura 50. Curvas de Promoción – Inhibición de E. Coli ATCC 25922 con 30 mg/L

(25)

xxv

de NPs -SiO2 a diferentes Cargas Orgánicas………78 Figura 51. Curvas de Promoción – Inhibición de E. Coli ATCC 25922 con 30 mg/L a diferentes Cargas Orgánicas en Fase Estacionaria ……….………... 79 Figura 52. Curvas de crecimiento de E. Coli ATCC 25922 con 40 mg/L de NPs -SiO2

a diferentes Cargas Orgánicas ……….………..……….. 80 Figura 53. Curvas de Promoción – Inhibición de E. Coli ATCC 25922 con 40 mg/L

de NPs -SiO2 a diferentes Cargas Orgánicas…………..………. 81 Figura 54. Curvas de Promoción – Inhibición de E. Coli ATCC 25922 con 40 mg/L a diferentes Cargas Orgánicas en Fase Estacionaria ………..………... 82 Figura 55. Caracterización del crecimiento E. Coli con NP- SiO2 en SEM ……… 83

(26)

xxvi

INDICE DE FOTOGRAFIAS

Fotografía 1. Crecimiento de Bacterias E. Coli con Nanopartículas de sílice y Agua

Sintética………..………122 Fotografía 2. Aislamiento de Bacterias E. Coli ATCC 25922……….122 Fotografía 3. Cepa Comercia de E. Coli ATCC 25922 Adquirida……….123 Fotografía 4. Toma de Muestras para Análisis Bacteriológico………123 Fotografía 5. Recuento en Placa de E. coli de Agua Residual Municipal – PTAR “Sicaya”…124 Fotografía 6. Micronutrientes Empleados para la Preparación de Agua Sintética”………….124 Fotografía 7. Adición de Macronutrientes en la Preparación de Agua Sintética………….….125 Fotografía 8. Muestras Tratadas con Nanopartículas en la Incubadora”……….125 Fotografía 9. Incubando Cepas E. coli tratadas con Diferentes Concentraciones

de Nanopartículas y Carga Orgánica ………..126 Fotografía 10. Microscopio Electrónico de Barrido (SEM) Empleado ………126 Fotografía 11. Inoculación de Viales para la Preparación de Soluciones Bacterianas……...127 Fotografía 12. Preparación de Soluciones Bacterianas a Diferentes Concentraciones de Carga Orgánica……….………..127 Fotografía 13. Homogenizando Soluciones Bacterianas Tratadas con Nanopartículas……...128 Fotografía 14. Aplicando Tratamiento de Nanopartículas de Sílice………128 Fotografía 15. Lectura del Crecimiento Bacteriano a lo Largo del Tiempo………129 Fotografía 16. Lectura del Crecimiento Bacteriano a lo Largo del Tiempo………..129

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1 CAPITULO I REVISION BIBLIOGRAFIA 1.1 ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN

Desde hace algunos años atrás se vienen realizaron múltiples investigaciones en el campo de la nanotecnología con aplicaciones a la medicina, alimentos, tratamiento de aguas residuales, etc. Entre ellos, uno de los que tienen muy pocos estudios son los métodos de promoción del crecimiento bacteriano con nanopartículas de óxido de silicio.

1.1.1 Antecedentes Nacionales

(Osorio, et. al., 2018). Al caracterizar nanopartículas industriales de SiO2, reportaron datos del tamaño y la morfología de nanopartículas de sílice por la técnica de Dispersión Dinámica de Luz (DLS), mostrando un diámetro hidrodinámico promedio de 11.6 nm; mientras que, por la técnica de Microscopia Electrónica de Trasmisión (TEM), un diámetro entre 10 y 20 nm. Estos datos establecen un rango de diámetros promedio para las nanopartículas de Sílice comerciales utilizadas en la industria, mostrando que los resultados para el diámetro de estas nanopartículas a través de diferentes técnicas son cercanos.

(Cornelio & Quiñones, 2019). Al evaluar la concentración y el tiempo de contacto de las nanopartículas de óxido de silicio para la inactivación de las bacterias E. Coli en aguas residuales municipales, reportaron la caracterización de nanopartículas de sílice a través del método DLS en 11 y 11,7 nm de diámetro hidrodinámico y por Microscopia Electrónica de Barrido (SEM) nanopartículas aglomeradas formando poros de menos de 100 nm. Concluyeron que las nanopartículas de sílice en interacción con las bacterias E. Coli presentan inhibición

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2

mas no eliminación, reportando una CMI de 20 mg/L de nanopartículas. Estos datos establecen una base para la experimentación de esta investigación, partiendo de una concentración de nanopartículas igual a 20 mg/L, como concentración de referencia y variando a concentraciones superiores e inferiores. Así como, un diámetro hidrodinámico referencial de las nanopartículas de SiO2 igual a 11 nm.

(Marchena, 2020). Al determinar la concentración mínima inhibitoria y bactericida de nanopartículas de óxido de hierro sobre el crecimiento bacteriano. Empleó bacterias Escherichia coli ATCC 25922, y nanopartículas de óxido de hierro (Fe3O4), las cuales fueron sintetizadas en el laboratorio de nanotecnología de la Facultad de Física de la Universidad Nacional de Trujillo. En el crecimiento de dichas bacterias, mediante el método de microdilución, se probaron ocho concentraciones de nanopartículas Fe3O4: 1,6 mg/mL; 1,4 mg/mL; 1,2 mg/mL; 1,0 mg/mL; 0,8 mg/mL; 0,6mg/mL; 0,4 mg/mL; y 0,2mg/mL. Los resultados mostraron que las nanopartículas de óxido de Hierro sintetizadas no tienen actividad antibacteriana aparente, por lo tanto, no se determinaron las concentraciones mínimas de inhibición ni las concentraciones mínimas bactericidas. El autor postula que esto fue debido al origen, método de producción y estado de agregación de las nanopartículas como determinante de su propiedad antibacterial. Esto sugiere que las características antibacterianas de las nanopartículas están directamente relacionadas a su método de producción, y que las nanopartículas sintetizadas por métodos experimentales no son comparables a las nanopartículas comerciales en este sentido.

(Hincapié-rojas et al., 2020). Al analizar estudios sobre la obtención, funcionalización y aplicaciones biomédicas de nanopartículas de Sílice mesoporosas, encontraron estudios recientes basados en NPs-SiO2 mesoporosas donde el punto principal es la síntesis, proceso y

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3

aplicación a la biomedicina. Encontraron que los métodos más utilizados para la síntesis fueron Stöber y Sol-gel en las cuales se obtuvieron un diámetro global de 43 nm y un 12% de dispersión; 100 nm y una buena mono-dispersión respectivamente. Fueron puestas en prueba también, nanopartículas recubiertas con estroncio debido al papel crucial que desempeña este elemento en la prevención de la osteoporosis. Las principales aplicaciones usadas fueron:

liberador de fármacos controlables (Drug Delivey), liberación controlada de fármacos con efecto bactericida, fototerapia, fluorescencia y tomografías. Estos datos muestran diámetros de nanopartículas de Sílice sintetizadas de forma experimental, mayores en comparación a nanopartículas comerciales, lo que supondría una relación directa entre el método de producción y el diámetro final de las mismas.

(Silva, 2015). Al sintetizar nanoparticulas de SiO2 como potenciales vehiculos para administracion de farmacos, produjo nanoparticulas por el método Stöber modificado, variando el tipo de tensoactivo para optimizar la síntesis (diámetro de partículas <100 nm, diámetro de poro >2 nm, morfología porosa y estructura mesoporosa ordenada). Con el fin de controlar la toxicidad de las nanopartículas y facilitar la adsorción del fármaco, realizó una funcionalización de las nanopartículas regularmente con grupos amino. Realizó la caracterización por difracción de rayos X (DRX), Espectrometría infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR), Microscopia electrónica de barrido (SEM), Microscopia electrónica de transmisión (TEM), Dispersión de luz dinámica, punto isoeléctrico y potencial Z (DLS), obteniéndose un diámetro promedio de 70 nm y diámetro promedio de poro 3,1 nm. Estos datos reafirman la relación directa entre el método de síntesis de las nanopartículas y el diámetro final de las mismas. Presentando así, a las nanopartículas comerciales, como la mejor opción para ser utilizada en investigación microbiológica, debido a su diámetro más reducido y capacidad antibacteriana comprobada.

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4 1.1.2 Antecedentes Internacionales

Wang et al. (2016) estudiaron la interacción de las nanopartículas con bacterias, encontrando que las bacterias E. Coli secretan una sustancia polimérica extracelular (EPS) que despoja a las nanopartículas de óxido de Silicio (NPs-SiO2) de su capacidad antibacteriana y que las protege de su toxicidad; esto demostró la capacidad adaptativa de las bacterias y la posibilidad de reducción de la actividad bactericida especifica de las nanopartículas. Realizaron pruebas de toxicidad a las NPs-SiO2 en cepas E. Coli donde no se encontró toxicidad alguna.

También, realizaron experimentos sin manipulación de la EPS y con la eliminación de la EPS por sonicación/centrifugación mostrando que la actividad bactericida específica de las nanopartículas podría antagonizarse mediante la adhesión de estas con la sustancia polimérica extracelular producida (NP-EPS). Las tasas de supervivencia de E. Coli (sin manipulación de EPS) alcanzaron el 79% (NPs- SiO2, 500 mg L-1), mientras que las tasas de supervivencia después de la eliminación de EPS por sonicación / centrifugación fue del 63%. Los autores proponen que no se puede controlar de manera competente el crecimiento de bacterias y otros organismo que poseen esta característica adaptativa de defensa. Los datos muestran mecanismos de defensa adaptativos que poseen las bacterias E. Coli ante concentraciones relativamente altas de nanopartículas de Sílice, haciendo que su crecimiento se vea desnaturalizado y poco predecible. Para evitar este fenómeno, las concentraciones altas de nanopartículas de Sílice estarán restringidas en esta investigación.

Abdeltawab (2020) estudió la actividad antibacteriana de diferentes nanoparticulas en cepas E. Coli patogenas locales resistentes a multiples fármacos. Usó la cepa de referencia ATCC 25922 con una síntesis de nanopartículas mediante el método de sol-gel y caracterizó estas nanopartículas utilizando Difracción de rayos X y Microscopía Electrónica de

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Transmisión (método de tinción negativa). Suspendió las muestras de nanopartículas en agua desionizada y las sometió a ultrasonidos durante aproximadamente 10 minutos. Impregnó discos de papel de filtro estándar estériles (4 mm de diámetro) con suspensiones acuosas sonicadas de nanomateriales a una concentración (10, 5, 2,5, 1,25 y 0,625) mg / mL para ser colocadas en las placas inoculadas con fórceps estériles e incubadas a 37 ° C durante 24 h, seguido de la medición de la zona de inhibición alrededor de los discos. El autor concluyó que, las nanopartículas metálicas puras muestran una mayor actividad antibacteriana contra E. Coli que las nanopartículas híbridas (mezcla de nanopartículas) las cuales exhibieron menores efectos antibacterianos en bacterias resistentes a los fármacos. Esta investigación presenta la importancia que se debe dar al proceso de sonicado de las soluciones de nanopartículas y recomienda el uso de soluciones de nanopartículas de una sola especie (puras) para analizar el efecto antibacteriano.

(Chitra & Annadurai, 2015) Estudiaron el crecimiento de bacterias E. Coli junto a nanopartículas de sílice fluorescente conjugadas con anticuerpos. Estas NP de sílice fluorescente mostraron una alta fotoestabilidad y proporcionaron un proceso de modificación de superficie fácil y estéril. Se utilizaron volúmenes de nanopartículas de sílice (20 μ L, 50 μ L y 100 μ L) que fueron agregados al medio e inoculadas con cepas E. Coli para luego ser incubadas a temperatura ambiente en un agitador orbital. La densidad óptica del caldo se tomó a 620 nm para diferentes intervalos de tiempo. Los resultados mostraron una mayor inhibición del crecimiento bacteriano de las muestras tratadas con nanopartículas fluorescentes de sílice conjugadas en comparación a nanopartículas de sílice ordinarias. Esta investigación muestra la fácil interacción de las nanopartículas de Sílice con otras sustancias como los anticuerpos o al transportar fármacos. Los autores recomiendan otro tipo de análisis para el recuento bacteriano ya que la densidad óptica es solo un método indirecto de medición que no brinda información

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6

sobre la cantidad de unidades formadoras de colonias presentes.

(Esteve Gaviña, 2015). Estudió la actividad antimicrobiana de micropartículas de sílice sobre E. Coli, trabajando con E. Coli (CECT 1103) y micropartículas MCM‐41. El estudio utilizó ácido caprílico por sus elevadas propiedades antimicrobianas, como componente anclado a las nanopartículas de sílice. El objetivo fue evaluar la actividad antimicrobiana del ácido caprílico, tanto libre como anclado, sobre la viabilidad de E. Coli. Haciendo uso de la difracción de rayos X, la microscopía electrónica de transmisión, el potencial zeta y el análisis termogravimétrico. La investigación garantizó el correcto anclado del ácido caprílico sobre la superficie de las nanopartículas, sin afectar a la estructura hexagonal característica de este material y se comparó con el ácido caprílico libre sobre el microorganismo indicador, lo que produjo una reducción del crecimiento bacteriano con una concentración mínima bactericida comprendida entre 1 y 5 ppm. Confirmando este efecto mediante el uso de microscopía de fluorescencia. Sin embargo, el ácido caprílico anclado no inhibió de forma total a la bacteria en las condiciones del estudio. Estos datos muestran que algunas sustancias que son adheridas o transportadas por las nanopartículas de sílice no mejoran la capacidad antibacteriana que tiene el conjunto en comparación a la que tendrían las nanopartículas de Sílice o las sustancias antibacterianas por separado.

(Liu et al., 2013). Estudiaron el efecto de las nanopartículas de Hierro sobre el crecimiento bacteriano y la producción de biosurfactantes, encontrando que a una concentración de 1 mg/L de nanopartículas de Hierro (NP-Fe) el crecimiento de bacterias aumentó en un 57% y la producción de biosurfactantes (producto secundario de la bacteria) se incrementó en un 63%. Y al aumentar la concentración a 1g/L el crecimiento disminuyo un 77% y no hubo producción aparente de biosurfactantes. El trabajo muestra un precedente, en

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7

donde a concentraciones adecuadas se puede estimular el crecimiento de algunas bacterias mediante un tratamiento con nanopartículas.

(Khan et al., 2018). En su estudio sobre el efecto de las dosis subletales de nanopartículas en relación a la actividad antifúngica de bacterias contra hongos, evaluaron si las nanopartículas SiO2 estimulaban la actividad antifúngica de Pseudomonas protegens CHA0 contra Candida Albicans. Obtuvieron como resultados que, las nanopartículas inhibieron el crecimiento de Pseudomonas protegens CHA0 en un 25% a una concentración de 250ppm. Pero a una dosis subletal de 500ng/mL, se observó un aumento de cuatro veces (x4) en la actividad antifúngica. Este estudio abre las puertas a un uso diferente de las nanopartículas, utilizándolas ya no como bactericida sino como estimulante para promover las características bacterianas haciendo que estas sean más beneficiosas para su supervivencia.

(Simarro-Rueda, 2019). Investigó el efecto antibacteriano de nanopartículas de sílice y polietilenimida sobre cepas bacterianas causantes de peritonitis en pacientes sometidos a diálisis peritoneal. Teniendo como objetivo estudiar el efecto bactericida de las nanopartículas de sílice y polietilenimida (NPs-Si) sobre bacterias patógenas como E. Coli. Los resultados mostraron que las E. Coli presentan sensibilidad solo ante tres de seis nanopartículas de Sílice probadas, cada una proveniente de diferentes laboratorios. Reportándose un perfil de resistencia ante las nanopartículas hasta una concentración aproximada de 150 µg/mL, concentración a la cual la bacteria evidencia un descenso en su viabilidad bacteriana (porcentaje de bacterias vivas a 24 horas de incubación). Estos datos sugieren la adaptación de las bacterias E. Coli en un rango de concentraciones de nanopartículas de Sílice inferiores a 150 ppm, ya que posteriores a éste se evidenciará su inhibición.

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(Rojas-Higuera et al., 2011). Evaluaron tres métodos para la inactivación de coliformes y E. Coli presentes en agua residual doméstica empleada para riego. El agua residual fue caracterizada por medio de análisis físicos, químicos y microbiológicos. Valorando la capacidad desinfectante de cada uno de ellos para inactivar coliformes totales y E. Coli. Los resultados mostraron que el tratamiento con nanopartículas de Titanio fue significativamente superior que los demás métodos, obteniendo 100% de inactivación para coliformes y E. Coli a los 30 minutos. Demostraron que al emplear el agua tratada por TiO2 no se presentó contaminación con E. Coli y coliformes a los 30 días de proceso. Por el contrario, en las plantas regadas con agua tratada por los otros métodos, se observó un incremento en las poblaciones bacterianas generando un problema de contaminación al finalizar la prueba de laboratorio.

Concluyendo que la fotocatálisis heterogénea de óxido de titanio fue un método eficaz para la reducción de coliformes y E. Coli en aguas residuales domésticas.

(Ghaidaa, 2017). En su estudio sobre la actividad antimicrobiana de las nanopartículas de óxido de silicio contra algunas bacterias y aislamientos de hongo, utilizó bacterias E. Coli, reportando que una solución de nanopartículas de óxido de silicio preparada con ácido acético presenta actividad antifúngica y antibacteriana en concentraciones de 10 - 40 µg/mL.

Concluyendo que el óxido de sílice se relaciona con características antimicrobianas superiores.

Estos datos aportan información sobre la interacción nanopartículas-bacteria a concentraciones entre 100 y 400 ppm de NPs-SiO2, las cuales evidencian no solo actividad antibacteriana si no también antifúngica. Así también, que la conjugación de ácido acético con nanopartículas de Sílice es funcional.

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(Ibtissem & Faye, 2013). Caracterizaron nanopartículas de Sílice en interacción con bacterias E. Coli y analizaron la morfología de las bacterias E. Coli en interacción con las nanopartículas que presentaban diámetros de 10nm, 50nm y 100nm. Estas bacterias fueron inmovilizadas en películas de polielectrolito obtenidas por metalización o recubrimiento “capa por capa” (LbL). Los autores mencionaran que, la interacción de la pared celular de las bacterias, el tamaño, la forma, la superficie, composición y estado de agregación de las nanopartículas son determinantes. Los resultados con nanopartículas de 100 nm no mostraron influencia en la forma o tamaño de las bacterias, manteniéndose invariables; mientras que las nanopartículas de 10 nm si evidenciaban claramente su toxicidad. Estos datos presentan información referencial sobre los cambios morfológicos que tendrían las bacterias E. Coli en contacto con NPs-SiO2, mostrando que, a menor tamaño de nanopartículas, las bacterias son afectadas por la toxicidad de las nanopartículas deformando sus paredes celulares; mientras que a mayor tamaño la pared celular no se ve afectada.

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10 1.2 BASES TEORICAS

1.2.1 Aguas Residuales Municipal

(OEFA, 2014) establece que las aguas residuales se clasifican en aguas residuales domésticas y municipales, las aguas residuales domésticas, son aquellas de origen residencial, comercial e institucional que contienen desechos fisiológicos y otros provenientes de la actividad humana y las aguas residuales municipales son aquellas aguas residuales domésticas que puedan incluir la mezcla con aguas de drenaje pluvial o con aguas residuales de origen industrial siempre que éstas cumplan con los requisitos para ser admitidas en los sistemas de alcantarillado de tipo combinado.

1.2.2 Límites Máximos Permisibles Para los Efluentes De PTAR

Según (OEFA, 2014) y de acuerdo al decreto supremo N° 003-2010-minam que aprueba límites máximos permisibles para los efluentes de plantas de tratamiento de aguas residuales domésticas o municipales nos define los siguiente:

Tabla 1

Límites Máximos Permisibles para los Efluentes de PTAR.

PARAMETRO UNIDAD LMP

Coliformes Termo tolerantes

NMP/100mL 10 000

Demanda Bioquímica de Oxigeno

mg/L 100

Demanda Química de Oxigeno

mg/L 200

Temperatura °C <35

Fuente: (adaptado norma MINAM, 2008).

1.2.3 Parámetros (Físicos –Químicos y Microbiológicos-Parasitológicos) para Aguas Residuales Municipales (PTAR)

Según (MINAM, 2017), los parámetros Microbiológicos – Parasitológicos, se

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establecen para aguas superficiales destinadas a la producción de agua potable, los cuales se muestran a continuación.

Tabla 2

Aguas Superficiales Destinadas a la Producción de Agua Potable.

Parámetros Unidad de medida

A1 A2 A3 Aguas que pueden ser

potabilizadas con desinfección

Aguas que pueden ser potabilizadas con tratamiento

convencional

Aguas que pueden ser potabilizadas con tratamiento avanzado

MICROBIOLÓGICOS Y PARASITOLÓGICOS

Coliformes Totales NMP/100 mL 50 ** **

Coliformes

Termotolerantes NMP/100 mL 20 2 000 20 000

Formas Parasitarias N° Organismo/L 0 ** **

E. Coli NMP/100 mL 0 ** **

Vibrio cholerae Presencia/100 mL Ausencia Ausencia Ausencia

Organismos de vida libre (algas, protozoarios, copépodos, rotíferos, nemátodos, en todos sus estadios evolutivos) (f)

N° Organismo/L 0 <5x10⁶ <5x10⁶

Fuente: (Adaptado norma MINAM, 2017).

1.2.4 E. Coli.

(Rock & Rivera, 2014) definen que las (E. Coli) son bacterias Gram-negativo, y que poseen cualidades inhibitorias del crecimiento con capacidad de fermentar la lactosa en un rango de temperaturas de -2 a 35°C, con capacidad de fabricar ácido, gas y aldehído en un rango de 18 a 48 horas. Así también estas bacterias, producen oxidasa negativa, no esporógena y reduce el nitrato a nitrito. De igual forma es capaz de producir indol a partir de triptofano a una temperatura de -0,5 a 44°C en un tiempo de 3 a 21 horas. Poseen la enzima B-glucoronidasa, la cual es detectada por medios cromógenos o fluorógenos. Las bacterias E. Coli son de una medida microscópica, su crecimiento puede observarse como colonias en medios de cultivo (McConkey, EMB, Müller Hilton) en condiciones especiales. La mayoría de las bacterias E.

Coli no causan enfermedad, pero si una persona se enferma de E. Coli, el lugar de infección es

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12

el tracto gastrointestinal y los síntomas son náusea, vómito, diarrea y fiebre. La figura 1, muestra unidades formadoras de colonias de bacterias E. Coli de color rosa/violeta con halo biliar creciendo sobre medio de cultivo agar MacConkey.

Figura 1

Crecimiento de E. Coli en medio de cultivo agar McConkey.

Fuente: Propia.

1.2.5 Morfología de las Bacterias E. Coli.

(Rock & Rivera, 2014) mencionan que la morfología de las bacterias E. Coli pertenecen a los microorganismos unicelulares que se procrean por fisión binaria o bipartición. Su medida, por lo general es menor que el de una célula eucariota típica. La E. Coli presenta unas dimensiones de 0,5 × 2 µm.

1.2.6 Métodos de identificación bacteriana.

Según (Bou et al, 2011) existen tres métodos para identificar bacterias, que son:

Métodos fenotípicos; que se basan en las características (observables) de las bacterias, como su morfología, desarrollo, y propiedades bioquímicas y metabólicas, haciendo uso de algunos equipos automatizados con una alta confiabilidad como MicroScan. Métodos moleculares; se

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basan en el uso de ARN, la identificación bacteriana proporcionada por el análisis del ARN es más certera, sólida y reproducible que los análisis fenotípicos, resolviendo aproximadamente el 90% de las identificaciones. Sin embargo, se emplean también nuevas tecnologías como PCR- multiplex. Métodos basados en proteómica; las técnicas de proteómica abordan el estudio del conjunto de proteína, las más usadas se basan en la electroforesis y en la espectrometría de masas.

1.2.7 Cuantificación de Bacterias E. Coli.

Para cuantificar las bacterias E. Coli es recomendable el uso del método fenotípico ya que es el más practicado, y con mejores fuentes de comparación. Las técnicas más representativas son: número más probable (NMP) o ceros de Poison, recuento en placa y filtración por membranas.

1.2.8 Técnica de Diluciones en Tubo Múltiple (Número Más Probable o NMP) (Camacho et al., 2009) mencionan que, para la evaluación cuantificable de bacterias coliformes, coliformes fecales y E. Coli por la técnica de NMP, consta de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos en el rango de 1 – 35°C durante 48 horas, utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinación presenta dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. Durante la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. En la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a

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partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 01 – 44,5 C en un tiempo de 24 – 48 h. Finalmente, la búsqueda de E. Coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo BRILA, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas a las colonias típicas. En la Figura 2, se observa el proceso para la determinación de coliformes totales, fecales y bacterias E. Coli, en la fila superior se presenta la etapa presuntiva y en fila inferior la etapa confirmativa previa al recuento de bacterias E. Coli.

Figura 2

Determinación del NMP de Coliformes en Agua.

Nota. La figura muestra los pasos para la determinación y cuantificación de E. Coli por el método de ceros de Poison. Los tubos de ensayo con soluciones de color gris contienen caldo Láurico; los de color ámbar, mezcla de caldo Láurico y muestra a analizar; los de color verde, caldo Brila y los de color amarillo caldo Triptocaseina (TC).

Fuente: (Camacho et al., 2009).

1.2.9 Técnica simplificada en placa para cuantificar bacterias E. Coli.

Esta técnica está basada en la presunción de que una muestra se formará a simple observación, con colonias apartadas cuando son mezcladas con el agar que permita su

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crecimiento. La técnica de recuento de colonias provee una estimación del número de microorganismos viables en una muestra de acuerdo al medio empleado, el tiempo y la temperatura de incubación. Las células microbianas a menudo se encuentran como conjuntos o grupos de células, por cuanto, la muestra y las diluciones homogeneizadas pueden uniformemente distribuir los conjuntos de bacterias, ya que estos grupos no pueden ser disgregados completamente por ellos mismos. Cada colonia que aparece en las placas de Petri con agar como grupos de células libres deben ser referidas como unidades formadoras de colonias. La técnica utilizada con frecuencia para la medición de poblaciones bacterianas es el recuento en placa. Un ventaja importante de esta técnica es la medida del número de células viables. Sin embargo, la desventaja es que se requiere mucho tiempo, en lo general 24 horas a más, para la formación colonias visibles. El recuento en placa se basa en la suposición de que cada bacteria crece y se divide para producir una sola colonia. Esto no siempre es cierto porque las bacterias con frecuencia crecen unidas en cadenas o como grumos. Por lo tanto, a menudo una colonia no se produce como resultado de una única bacteria sino de segmentos cortos de una cadena o un agregado bacteriano. Este método lleva consigo el hacer un banco de diluciones seriadas que no son más que un tipo de diluciones sucesivas manteniendo constante el factor de dilución en cada paso. La Figura 2, presenta el esquema para el proceso de dilución de muestras de aguas residuales. Se diluye la muestra original, desde el factor 10^-1 hasta el factor que sea necesario (generalmente el último factor de dilución es 10^-4, en muestras poco contaminadas).

La sección B de la Figura 2, muestra placas Petri rotuladas con factores de dilución, que representan las diluciones con mejor diferenciación en el crecimiento bacteriano, ya que, los factores de dilución 10^-1,10^-2 y 10^-3 al ser inoculados en placas Petri, generalmente permiten el crecimiento de césped bacteriano (colonias de bacterias aglomeradas formando una capa densa) e impide el recuento y aislamiento de las bacterias de interés.

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Figura 3

Esquema simplificado del proceso de dilución de muestras de agua residual.

Nota. A: Tubos de ensayo rotulados por el factor de dilución 10^-1 hasta 10^-6. B: Placas Petri seriadas con el factor de dilución 10^-4, 10^-5 y 10^-6.

Fuente: Propia.

(Plate, 1997) menciona que para un mejor recuento bacteriano se debe realizar la dilución de las muestras, seguida de la difusión de 50 a 100 µl de cada dilución en medios de cultivo. Después de la incubación, se cuentan las colonias y se estiman las concentraciones bacterianas en la muestra original. Para cumplir con los criterios de precisión estadística de los números de bacterias en un espécimen dado, las muestras generalmente se colocan en placas por triplicado, y se cuentan solo de las placas que producen entre 20 y 200 colonias visibles.

Además, ya que se desconoce el número real de bacterias presentes en un espécimen al final de un experimento, las muestras se deben contar frecuentemente con diluciones que van de 10⁻¹ a 10⁻⁸ como factor de dilución. La figura 4, presenta imágenes de placas Petri durante el recuento de unidades formadoras de colonias, aplicando en fila superior la técnica de división en cuadrantes. Las placas con diluciones superiores a 10^-5 no requieren la segmentación en cuadrantes, ya que, las colonias se pueden visualizar fácilmente.

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Figura 4

Recuento en placa de bacterias E. Coli sobre agar McConkey a diferentes diluciones

Nota: (A) Placas Petri segmentadas en cuadrantes. La figura muestra los resultados de la técnica de recuento en placa desde una dilución de 10⁻³hasta10⁻⁸ sobre medio de cultivo Agar Mac Conkey, para un mejor recuento en placa donde las colonias son poco visibles se divide en cuadrantes, en el caso de las diluciones desde 10⁻⁶hasta10⁻⁸ se omite este paso ya que las colonias están más definidas.

Fuente: (Plate, 1997) .

1.2.10 Técnica de Filtración por Membrana en Agar Mac Conkey

(Navarro, 2007) comenta que, la filtración por membrana es el mecanismo mediante el cual se atrapan en la superficie de la membrana microorganismos cuyo tamaño es mayor que el tamaño del poro 0,45 µm, esto gracias a que una bomba eléctrica ejerce una presión diferencial sobre la muestra de agua haciendo que se filtre. Los contaminantes de tamaño menor que el específico del poro atraviesan la membrana o se quedan retenidos en su interior, las bacterias quedan en la superficie de la membrana y luego está es llevada a un medio de enriquecimiento selectivo, para el caso de bacterias E. Coli se utiliza el medio de cultivo Mac Conkey el cual promueve el crecimiento y la identificación. Este método es fácilmente aplicable a aguas

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18 superficiales y residuales.

(Simbron et al, 2020) mencionan también que, la prueba de filtración por membrana identifica bacterias E. Coli que son menores de 0,45 micrómetros; esta se realiza por un sistema de filtración estéril en el cual se necesita un equipo Kitasato y por un bomba al vacío, la cual aspirara la muestra y, por ende, las bacterias quedan en la parte superficial de la membrana de nylon, esta técnica también asegura un método de enjuague que elimina todo los posibles contaminantes externos que hayan estado presentes durante la filtración. La figura 5, presenta los pasos para el recuento en placa de bacterias E. Coli a través de filtración al vacío por membranas.

Figura 5.

Técnica de Filtración por Membrana en Agar Mac Conkey.

Nota: La figura presenta los pasos para realizar la cuantificación de bacterias E. Coli a través de la filtración al vacío, iniciando por la toma de muestra, la dilución de la misma, el proceso de filtración, incubación de la membrana sobre medio de cultivo, el recuento en placa y finalmente la recolección de los datos.

Fuente: Elaboración Propia.

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1.2.11 Medio de Cultivo Específicos para E. Coli.

a) Agar Mac Conkey

El agar Mac Conkey es un medio de cultivo utilizado para el aislamiento de bacilos Gram negativos, entre ellos E. Coli. Presenta dentro de su composición: peptona de carne, peptona de gelatina, triptena, lactosa, sales biliares, cloruro de sodio, rojo neutro y cristal violeta. Las peptonas aportan nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, mientras que la lactosa es el hidrato fermentable que cambia el pH activando el viraje en el indicador rojo neutro, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el crecimiento de otras bacterias no deseadas.

a.1) Composición de Agar Mc Conkey

En la tabla 3 se presenta la composición del medio de cultivo agar McConkey. El agar bacteriológico es el agente gelificante. El cristal violeta es el agente que inhibe el desarrollo de otras bacterias que puedan contaminar el aislamiento. La lactosa es componente que será fermentado por las bacterias para el cambio de pH. Las peptonas son la principal fuente de nutrientes para el desarrollo de las bacterias. Rojo neutro es el indicador de color susceptible al cambio de pH. Mientras que el cloruro de sodio funciona como estabilizante.

Tabla 3

Composición de Agar Mc Conkey.

Composición Agar McConkey (g/l)

Agar bacteriológico 15

Cristal violeta 0,001

Latosa 10

Mezcla de peptona 3

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20

Sales biliares 15

Peptona de gelatina 17

Rojo neutro 0,03

Cloruro de sodio 5

Fuente: Himedia Labs.

1.2.12 Cepas Bacterianas de E. Coli ATCC 25922.

a) Cepas ATCC

Son microorganismos certificados por la norma “American Type Culture Collection”

(ATCC), los cuales son identificados por su código y se utilizan como patrón en los análisis microbiológicos. En las investigaciones de susceptibilidad y pruebas de tratamiento la cepa E. coli más utilizada es la ATCC 25922. La figura 6, muestra la presentación de cepas E. Coli ATCC 25922 comerciales para el mercado latinoamericano, las cuales contienen células liofilizadas con capacidad de preservación de hasta 1 año, ideales para ensayos de laboratorio rápido.

Figura 6

Cepa Bacteria E. Coli ATCC 25922.

Nota. La fotografía muestra el empaque de cepas E. Coli ATCC 25922 comerciales, que contienen un vial con las bacterias liofilizadas y un aplicador tipo hisopo más conocido como “quick-stick”.

Fuente: Propia.

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21 a.1) Activación de Cepas

(Simbron et al., 2020) comentan que en la activación de cepas liofilizadas se puede recolectar menor o igual a 100 UFC/m. Resaltando que para realizar esta técnica se necesita trabajar en condiciones asépticas, una buena distribución de aire y con una presión negativa que impida la salida de los distintos microorganismos que puedan contaminar el ambiente. La finalidad de la activación de cepas es llegar a una concentración en la que se puedan llevar a cabo los distintos análisis microbiológicos sin indicio de contaminación exterior por alguna otra especie. En la figura 6, se muestra el procedimiento para la activación de las cepas E. Coli ATCC 25922 de acuerdo a las especificaciones del fabricante, la cual se realiza con ayuda de una cabina de seguridad biológica. En donde se abre el paquete estéril conteniendo la cepa a activar e inoculándola sobre una placa Petri que contiene medio nutritivo no selectivo como Triptocasa Soya Agar (TSA). Posteriormente se procede a incubar las placas por 24 horas para su replicación, aislamiento y uso, o de ser el caso, su preservación en viales conteniendo caldo nutritivo no selectivo (TSB) congelándolos a una temperatura entre -2 a -10 grados.

Figura 7

Proceso de activación, replicación y preservación de cepas E. Coli ATCC 25922.

Nota: El procedimiento corresponde a la presentación KWIK-STIK™ de la marca Microbiologics, otras presentaciones de la misma cepa bacteriana poseen una activación diferente.

Fuente: (Simbron et al., 2020).

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22 1.2.13 Crecimiento Bacteriano

(Lin et al., 2014) se refiere al crecimiento bacteriano como el aumento ordenado de todos los componentes químicos que llevan a un incremento de los constituyentes y estructuras celulares. Los nutrientes, a partir de los cuales los microorganismos sintetizan sus principales biomoléculas y obtienen su energía, están disueltos en agua, razón por la cual el crecimiento celular depende de la disponibilidad de agua.

(Metcalf and Eddy, 1995) mencionan tres principales técnicas de curvas de crecimiento las cuales son:

a) Crecimiento en términos de número de bacterias.

La forma general en que se produce el crecimiento de las bacterias en un cultivo, se da al inocular un pequeño número de organismos en un volumen determinado de un medio de cultivo y se registra el número de organismos viables en función del tiempo. El modelo de crecimiento basado en el número de células consta de cuatro fases diferenciadas:

1. Fase de Retardo. Tras la adición de un inóculo o muestra bacteriana a un medio de cultivo, la fase de retardo representa el tiempo necesario para que los organismos se aclimaten a las nuevas condiciones ambientales y comiencen a dividirse.

2. Fase de Crecimiento Exponencial. Durante esta fase, la célula se divide a una velocidad determinada por su tiempo de generación y su capacidad de procesar alimento (tasa constante de crecimiento porcentual)

3. Fase Estacionaria. En esta fase, la población permanece constante. Las razones que explican este fenómeno son: (a) las células han agotado el substrato a los nutrientes necesarios para el crecimiento (b) generación nueva se compensan con la muerte de células viejas.

4. Fase de Muerte Exponencial. Durante esta fase, la tasa de mortalidad de bacterias