PO151 - Tafenoquina, una 8-aminoquinolina que inhibe el complejo III de la cadena respiratoria de Leishmania
Luis Carvalho, Juan Román Luque-Ortega, José Ignacio Manzano, Santiago Castanys, Luis Rivas, Francisco Gamarro Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid.
La tafenoquina (TFQ) es una 8-aminoquinolina con actividad leishmanicida in vivo que además está en fase clínica IIb/III para el tratamiento y prevención de la malaria. En este trabajo hemos estudiado el mecanismo de acción de la TFQ frente al protozoo parásito Leishmania, demostrando que afecta su metabolismo energético. La TFQ causa una caída rápida de los niveles intracelulares de ATP sin producir una alteración significativa de la permeabilidad de la membrana plasmática. La TFQ provoca una disfunción mitocondrial a través de la inhibición de la actividad citocromo c reductasa (complejo III de la cadena respiratoria), acompañada de una disminución de la tasa de consumo de oxigeno y una despolarización del potencial de membrana mitocondrial. Además, la TFQ induce la producción de especies reactivas de oxígeno, un incremento del Ca+2 libre intracelular, y una posterior fragmentación del ADN nuclear.
Concluimos que la mitocondria es un blanco de acción de la TFQ en Leishmania y que la acción del fármaco produce la muerte del parásito mediante un mecanismo similar a la apoptosis.
SAF2006-02093 (F.G.), ISCIII-Red de Investigación Cooperativa en Enfermedades Tropicales (RICET)-FEDER RD06/0021/0002 (FG), RD 06/0021/0006 (LR) European Union (HEALTH -2007- 223414) (LR), FIS PS09-01928 (LR).
Pósteres
PO153 - Identificación de una señal de localización nuclear en la subunidad de 36 kDa de la ADN topisomrasa de Leishmania
Christopher Fernández Prada, Estefania Calvo Álvarez, Celia Fernández Rubio, Rafael Balaña Fouce, Rosa María Reguera Torres, Raquel Álvarez Velilla, Yolanda Pérez Pertejo
Departamento de Ciencias Biomédicas. Facultad de Veterinaria.
Universidad de León
Las ADN topoisomerasas son enzimas de localización nuclear y en algunos casos mitocondrial encargadas de resolver problemas topológicos originados en los procesos de replicación transcripción y recombinación del ADN. Los protozoos parásitos del género Leishmania son responsables del grupo de enfermedades conocido con el nombre de leisnmaniosis. La ADN topoisomerasa tipo I de Leishmania es heterodimérica, siendo esta una particularidad que sólo comparte con la enzima de tripanosoma y que la convierte en una potencial diana terapéutica. Está formada por dos subunidades de 73 y 36 kDa; en la subunidad de 36 kDa se encuentra el centro activo y en la secuencia de la subunidad grande, mediante programas de predicción de motivos, encontramos potenciales señales de localización nuclear (NLS) que no se observan en la subunidad pequeña y por lo que podríamos pensar que las dos subunidades se ensamblan en el citoplasma y son conducidas al núcleo mediante las NLS predichas. Hemos fusionado las dos subunidades a la proteína verde fluorescente (GFP) observando que las dos poseen NLS y que podrían dirigirse al núcleo de manera independiente. En este trabajo construimos distintas quimeras fusionadas a la GFP y mostramos que la subunidad de 36 kDa posee una señal de localización nuclear no canónica entre los aminoácidos 87 y 96.
Trabajo subvencionado con los proyectos: PS09/00448 (ISCIII) y LE002A08 (JCyL).
Instituto de Salud Carlos III, proyecto PS09/00448 y Junta de Castilla y León, proyecto LE002A08.
PO154 - Generación de cepas de Leishmania major y Leishmania infantum que sobreexpresan genes fluorescentes y luminiscentes
Estafania Calvo Álvarez, Christopher Fernández Prada, Celia Fernández Rubio, Rafael Balaña Fouce, Yolanda Pérez Pertejo, Rosa María Reguera Torres
Departamento de Ciencias Biomédicas. Facultad de Veterinaria.
Universidad de León
Los protozoos del género Leishmania son parásitos intracelulares responsables de las enfermedades conocidas como leishmaniosis, las cuales son endémicas en países tropicales y subtropicales. Hemos generado cepas estables recombinantes de Leishmania major Lv39c5 y Leishmania infantum JPC que expresan heterólogamente genes fluorescentes (mCherry, citrine y ECFP) y luminiscentes (luc2 y hRluc). Las diferentes cepas fueron transfectadas con el vector de expresión pLEXSY- Hyg2 (Gena Bioscience, Germany) que permitió la integración de los distintos reporteros en el rRNA 18S del cromosoma 27 de los parásitos por recombinación homóloga. Los sitios de integración de los marcadores fueron determinados por PCR y por Southern blot. Los diferentes clones fueron seleccionados con higromicina manteniendo altos niveles de expresión de las proteínas fluorescentes y luminiscentes. La selección de los clones fluorescentes se realizó mediante citometría de flujo.
Una vez seleccionados se analizó por fluorimetría la relación nº parásitos/fluorescencia y la emisión de la fluorescencia durante la curva de crecimiento. Estos resultados muestran la gran utilidad de estos parásitos permitiendo la monitorización a tiempo real del curso de la infección en animales de laboratorio (ratones BALB/c), además del establecimiento de un modelo ‘’in vitro’’
empleando macrófagos peritoneales infectados con los parásitos para determinar de un modo rápido la actividad leishmanicida de diferentes fármacos.
Agradecimientos: Llopis J. (Facultad de Medicina, Universidad de Castilla-La Mancha); trabajo financiado por los proyectos
Póster-Grupo Parasitología Molecular
PO151 - Tafenoquina, una 8-aminoquinolina que inhibe el complejo III de la cadena respiratoria de Leishmania
Luis Carvalho, Juan Román Luque-Ortega, José Ignacio Manzano, Santiago Castanys, Luis Rivas, Francisco Gamarro Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid.
La tafenoquina (TFQ) es una 8-aminoquinolina con actividad leishmanicida in vivo que además está en fase clínica IIb/III para el tratamiento y prevención de la malaria. En este trabajo hemos estudiado el mecanismo de acción de la TFQ frente al protozoo parásito Leishmania, demostrando que afecta su metabolismo energético. La TFQ causa una caída rápida de los niveles intracelulares de ATP sin producir una alteración significativa de la permeabilidad de la membrana plasmática. La TFQ provoca una disfunción mitocondrial a través de la inhibición de la actividad citocromo c reductasa (complejo III de la cadena respiratoria), acompañada de una disminución de la tasa de consumo de oxigeno y una despolarización del potencial de membrana mitocondrial. Además, la TFQ induce la producción de especies reactivas de oxígeno, un incremento del Ca+2 libre intracelular, y una posterior fragmentación del ADN nuclear.
Concluimos que la mitocondria es un blanco de acción de la TFQ en Leishmania y que la acción del fármaco produce la muerte del parásito mediante un mecanismo similar a la apoptosis.
SAF2006-02093 (F.G.), ISCIII-Red de Investigación Cooperativa en Enfermedades Tropicales (RICET)-FEDER RD06/0021/0002 (FG), RD 06/0021/0006 (LR) European Union (HEALTH -2007- 223414) (LR), FIS PS09-01928 (LR).
PO155 - Análisis proteómico de la diferenciación de los promastigotes de Leishmania infantum en cultivo axénico Pedro José Alcolea, Ana Alonso, Vicente Larraga
Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Madrid.
El proceso de diferenciación de los promastigotes a amastigotes ha sido estudiado en Leishmania major, L. donovani y L. infantum mediante aproximaciones transcriptómicas y proteómicas.
Sin embargo, la diferenciación de los promastigotes no se ha analizado en profundidad, ya que sólo se han realizado tres estudios transcriptómicos parciales en L. major y uno en L.
braziliensis y no se han empleado para ello técnicas de proteómica.
Para indagar en este proceso de diferenciación, en nuestro laboratorio se desarrolló el estudio transcriptómico comparativo de los promastigotes en fase logarítmica y estacionaria de cultivo axénico y de las subpoblaciones de promastigotes procíclicos y metacíclicos de la población en fase estacionaria mediante microarrays de ADN que representan el genoma completo de L. infantum. Para realizar una aproximación parcial al proteoma, se compararon extractos proteicos totales de los promastigotes en fase logarítmica y estacionaria mediante electroforesis bidimensional e identificación de las proteínas diferencialmente expresadas por espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF. De este modo, se halló la sobre-expresión de la subunidad alfa del factor traduccional de elongación 1, la ciclofilina, la flavoproteína de transferencia de electrones, una chaperona DnaJ y la hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT) en promastigotes en fase estacionaria y la sobre-expresión del factor de replicación A y la manosa-1-fosfato guanililtransferasa en promastigotes en fase logarítmica. Con este análisis proteómico se han detectado perfiles de expresión coincidentes y/o complementarios con los datos obtenidos por aproximaciones transcriptómicas.
PO157 - Polimerasa theta: localización y perfil de expresión en Leishmania infantum
Abel Fernández Orgiler, Ana Alonso Ayala, Pedro José Alcolea Alcolea, Vicente Larraga Rodríguez de Vera
Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC)
Leishmania infantum es el agente etiológico de la leishmaniasis visceral en la cuenca mediterránea, y el perro su principal reservorio. El ciclo biológico de Leishmania es dimórfico y digenético, diferenciándose el estadío promastigote dentro del tubo digestivo del insecto vector de la subfamilia Phlebotominae y el estadío amastigote en el interior de las células fagocíticas del hospedador mamífero. La polimerasa theta es una ADN polimerasa de baja fidelidad perteneciente a la familia A que contiene una subunidad helicasa N-terminal y una subunidad polimerasa C-terminal. Pol theta participa en la tolerancia al daño no solo mediante la incoporación de un nucleótido opuesto a tiamina-glicol o a un sitio abásico, sino también mediante la elongación de la cadena polinucleotídica a partir de la base opuesta a la lesión. En un análisis transcriptómico llevado a cabo en el laboratorio, se detectó la sobre-expresión del gen de la subunidad catalítica de la polimerasa theta (Polqc) en promastigotes metacíclicos de L. infantum. La sobre-expresión se confirmó mediante RT-PCR cuantitativa relativa. El gen Polqc se clonó en el vector pRSET C y se expresó en la cepa BL21 (DE3) pLys S de E.coli. La proteína en este hospedador se degrada. No obstante, mediante electroelución de la forma completa a partir de geles SDS-PAGE pudimos generar un anticuerpo policlonal, que permitió determinar que los niveles de la proteína son constitutivos en la diferenciación de los promastigotes, a diferencia de los del tránscrito. Los ensayos de inmunofluorescencia indican que Polqc se localiza en el kinetoplasto, por lo que posiblemente participa en la reparación del ADN mitocondrial.
PO156 - Desarrollo de un método de detección de microorganismos patógenos y cianobacterias potencialmente tóxicas en amebas de vida libre
Irene Gregorio Sánchez, Tais Mayumi Kuniyoshi, Alicia García Berna, Pilar Goñi Cepero, Antonio Clavel Parrilla, María Luisa Peleato Sánchez, María Francisca Fillat Castejón
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular.
Facultad de ciencias e Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos. Universidad de Zaragoza
La presencia de microorganismos patógenos como Legionella o Vibrio spp., así como de ciertas cianobacterias potencialmente tóxicas es habitual en habitas acuáticos. Las amebas de vida libre (AVL) comparten con ellos su nicho ecológico. En ocasiones, estos microorganismos son fagocitados por las amebas y son capaces de sobrevivir y multiplicarse en su interior. De esta forma, las amebas actúan como barreras en los procedimientos de tratamiento de agua facilitando su supervivencia, lo que conlleva importantes repercusiones sanitarias y medioambientales. Los métodos clásicos de detección de patógenos están basados en técnicas de cultivo, o detección de la cianotoxina, en el caso de cianobacterias. En este trabajo se ha puesto a punto una PCR multiplex acoplada a una PCR anidada para la identificación de Vibrio cholerae, Legionella spp y cianobacterias potencialmente tóxicas. Para detectar cianobacterias, se amplificó una región del gen mcyD componente del operón mcy implicado en la síntesis de microcistina. La identificación de Legionella spp se basó en la amplificación del gen 16s rRNA, un gen muy conservado y comúnmente utilizado en protocolos de tipificación. En el caso de Vibrio cholerae el gen utilizado como diana fue ompU, que codifica una proteína de la membrana externa asociada con la enteropatogenicidad. Esta combinación de cebadores ha proporcionado una alta especificidad al método. Además, presenta una gran sensibilidad gracias a la técnica de PCR anidada. Todas estas características hacen que este método sea específico, sensible y rápido para la detección de estos microorganismos patógenos en aguas y en el interior de AVL
Diputacion General de Aragón. Obra Social LaCaixa. ZEU Inmunotec
PO158 - Relevancia de la enzima Indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO) en la patogenia de la enfermedad de Chagas
Laura Corvo Villén, María Luisa González Rubio, Manuel Soto Álvarez, Pedro Bonay Miarons
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa. Madrid
Trypanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas, dolencia crónica e incurable en la mayoría de los casos, endémica en toda Latinoamérica y de creciente incidencia en España. La enfermedad presenta una fase aguda caracterizada por una fuerte inmunosupresión y una fase crónica que puede presentar diversas manifestaciones clínicas. Uno de los mecanismos desarrollados en la respuesta a infecciones por patógenos para limitar el daño tisular causado por la liberación de citoquinas proinflamatorias es la inducción de la enzima Indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO), que regula los niveles de triptófano (trp) en tejidos inmunocompetentes. Hay discrepancia en la literatura acerca de la implicación de IDO en la enfermedad de Chagas. El objetivo del presente estudio es explorar la participación del parásito en modular los efectos de posibles cambios de expresión de IDO. En el presente trabajo se reporta la inducción de la expresión de la enzima IDO en corazón, bazo y timo en ratones en respuesta a la infección por T. cruzi. Así mismo, se reporta la identificación y caracterización bioquímica de dos sistemas de transporte de triptófano en epimastigotes de T. cruzi. Uno de baja capacidad y relativa alta afinidad, y el otro de baja afinidad pero alta capacidad. También se presenta evidencia de la capacidad de T. cruzi de incorporar y procesar metabólicamente kinurenina (kin), el principal metabolito de IDO, siguiendo una ruta no descrita previamente en Kinetoplastida. Se discutirá la relevancia de estos hallazgos en el contexto de los niveles sistémicos de trp/kin.
Proyecto del FIS, Fondo de Investigaciones Sanitarias del MInisterio de Sanidad, RED RICET, y Patrocinadoras, el NIH con el Functional Glycomiucs Consortium
Pósteres
PO159 - Identificación de las secuencias del promotor Pr77 de Trypanosoma cruzi implicadas en transcripción. Unión de factores nucleares del parásito a dichas secuencias Francisco Macias, Manuel C. López, M. Carmen Thomas IPBLN-CSIC. Granada
Pr77 es un promotor interno localizado en el extremo 5´ del elemento LINE L1Tc de Trypanosoma cruzi. Pr77 es dependiente de RNApol II, y genera una elevada tasa de transcripción. Los mRNAs derivados de Pr77, si bien carecen de spliced leader por no ser procesados por trans-splicing, son traducibles. Nuestro interés se centró en determinar las secuencias implicadas en la actividad promotora de Pr77. Estudios bioinformáticos han mostrado la existencia en Pr77 de secuencias conservadas con promotores de retrotransposones y genes implicados en desarrollo de insectos. Estas secuencias se localizan en promotores no-TATA o con TATA no funcional. Para determinar la implicación de las diferentes regiones de Pr77 en la actividad transcripcional generamos 20 construcciones en las que Pr77, clonado corriente arriba de un gen reportero, portaba mutaciones puntuales. La tasa de transcripción del gen reportero se determinó en cada transfectante estable de T. cruzi mediante northern-blot.
Así hemos determinado regiones esenciales implicadas en la capacidad transcripcional de este promotor. Los resultados obtenidos también muestran que mutaciones en regiones que alteran la estructura de esta secuencia, predicha previamente in silico, inhiben la transcripción. Se comprobó mediante RT-PCR que los tránscritos detectados que derivan de los mutantes de Pr77 no presentan spliced leader.
Ensayos de retardo en gel realizados con Pr77 y las secuencias Pr77 mutadas muestran que proteínas nucleares de T. cruzi se unen específicamente a la secuencia Pr77, y con mayor afinidad a las regiones de Pr77 que están implicadas en la capacidad de transcripción de este promotor.
Proyecto de Excelencia de la Junta de Andalucía CVI 1227, Plan Nacional I+D+i BFU2007-65095, Red de Enfermedades Tropicales RETIC RD06/0021-0014
PO1513 - Localización del complejo Arp2/3 del citoesqueleto de actina en Trypanosoma brucei
José Maceira-Pena, Maria Teresa del Castillo Santaella, Juan Diego Unciti Broceta, Derek Nolan, Joyce Rubotham, Jose Antonio Garcia Salcedo
FIBAO. Granada
Los tripanosomátidos, causantes de enfermedades son protozoos parásitos, cuyas formas infectivas dependen obligatoriamente de la toma de nutrientes procedentes de su hospedador. Para ello han desarrollado una maquinaria de endocitosis muy eficiente que la convierte en un objetivo claro de intervención contra estos organismos. Los procesos de endocitosis y exocitosis de los tripanosomas se caracterizan por estar muy polarizados, restringiéndose solo a una pequeña invaginación de la membrana plasmática, justo en la base del flagelo, conocida como la bolsa flagelar. Con anterioridad hemos visto que en Trypanosoma brucei, la actina desempeña un importante papel en endocitosis y en el transporte vesicular intracelular. Como continuación de ese trabajo, estamos caracterizando al complejo Arp2/3, único factor universal responsable del inicio de la formación de los filamentos de actina. En concreto, hemos amplificado, clonado y expresado, como proteína recombinante fusionada a GST, la proteína Arp2 de T. brucei. Tras purificarla, se obtuvieron anticuerpos policlonales, y se purificaron por cromatografía de afinidad. En las formas sanguíneas, los ensayos de inmunoblot mostraban una única banda, correspondiente a Arp2, y mediante microscopía de fluorescencia, colocalizaba en la vía de endocitosis, desde el bolsillo flagelar hasta el lisosoma. Adicionalmente, se observó un marcado en estructuras circulares en la región anterior de la célula, que están en proceso de caracterización.
Agradecemos la colaboración técnica del Dr. Miguel Soriano.
PO1510 - Técnica para el diagnóstico de la Tripanosomiasis Africana
Teresa del Castillo Santaella, Jose Maceira-Pena, Jose Antonio Garcia-Salcedo
HUSC, FIBAO. IPBLN, CSIC.
Actualmente no existe una técnica de diagnóstico rápido, vacuna o tratamiento efectivo para la Tripanosomiasis o enfermedad del sueño, la cual produce 5000 muertes al año, tiene 60 millones de personas en riesgo de padecer la enfermedad en 36 países de África y que además afecta tanto al hombre como al ganado.
El parásito extracelular que produce ésta enfermedad es Trypanosoma brucei. Éste tiene un ciclo de vida complejo, en el que la mosca tse-tsé del género Glossina transmite la enfermedad mediante una picadura al hospedador mamífero. El parásito es capaz de evadir la respuesta inmune del hospedador mamífero y desarrollar la enfermedad en dos etapas; en la primera el parásito se encuentra en el torrente sanguíneo y en la segunda llega al sistema nervioso central dando lugar a alteraciones del sueño.
Las tripanosomiasis humana y animal están implicadas en el subdesarrollo del continente africano y son consideradas uno de los principales obstáculos en el establecimiento de una agricultura que proporcione alimentos de forma segura y conduzca al crecimiento económico sostenible de la zona.
Se necesita un método rápido de diagnóstico de la enfermedad para evitar el riesgo de la re-infección debido a la existencia de un reservorio incontrolable del parásito en la población y en la fauna africana. Hemos desarrollado una técnica muy sencilla, económica y rápida para diagnosticar la enfermedad que nos permite visualizar mediante microscopía, los parásitos en sangre después de fijarlos con paraformaldehído al 4% y teñirlos con berenil® a concentraciones bajas.
Proyecto europeo FP7-HEALTH-2007-2.3.4-1 NANOTRYP”.
Contratación FIBAO.
PO1518 - Polimorfismo genético de especies de género Leishmania utilizando el gen de la hsp83
María Antonieta Quispe Ricalde, María Silvina Lo Presti, Cristina Pou Barreto, Enrique Martínez
Carretero, Patricia Paglini Oliva, Basilio Valladares Hernández Instituto Universitario de EnfermedadesTropicales y Salud Pública de Canarias. Universidad de La Laguna
Las proteínas de choque térmico (HSP) tienen antecedentes de ser capaces de diferenciar especies del sub-género Viannia.
En el presente estudio se utiliza un fragmento del gen de la proteína de choque térmico de 83 kDa (HSP83) y en base a los resultados se realizan estudios de polimorfismo genético dentro de la especie. Se utilizaron cepas patrones mundiales (ATCC) y también aislamientos de pacientes con la enfermedad. Estas últimas muestras provienen de diversas zonas endémicas que corresponden al Departamento de Cuzco, Perú. El estudio consistió en la amplificación tanto del gen completo de la Hsp83 (2131 pb) y de fragmentos del mismo. Se aborda el estudio utilizando dos herramientas, RFLP con distintas enzimas de restricción y secuenciación de los fragmentos amplificados. Los resultados nos muestran la capacidad del gen de agrupar a las especies en los complejos correspondientes y grupos, estos últimos sobretodo nos otorgan datos del polimorfismo que existe dentro del género.
AECID