2.6.1. Fórmula considerada para el recojo de datos
El diseño completamente aleatorizado con arreglo factorial de 3 x 3, fue utilizado para la conducción de la investigación, donde las variables respuesta identificadas fueron el cambio producido en el contenido de fenólicos totales, betalaínas y capacidad antioxidante de semillas de quinua al ser sometidos a los tratamientos planificados. El índice de cambio producido se midió haciendo uso de la fórmula I.
Proporción de cambio = ((Cf – Ci)/Ci)*100 ( I ) Donde:
Ci: Contenido inicial Cf: Contenido final
Las variables independientes utilizadas fueron el color de los granos de quinua: quinua blanca (variedad Huancayo), quinua roja (variedad Pasankalla) y quinua negra (variedad Negra Collana) y el tipo de cocción a los que fueron sometidos estas semillas (extrusión, expansión, torrefacción o tostado, cocción en agua a presión atmosférica y a presión elevada).
2.6.2. Diseño experimental utilizado en la investigación
Acorde con el diseño de la investigación, el modelo aditivo lineal que explica el diseño experimental correspondiente es el que se presenta en la ecuación II
Yijk = µ + Ai+ Bj + (AB)ij+ Eijk (II) Donde:
Yijk = Variable respuesta (contenido de betalaínas, polifenoles y actividad antioxidante de los granos de quinua).
µ = Media general
Ai = Color de quinua (blanca, roja y negra variedad Huancayo, Pasankalla y Negra Collana respectivamente, medido en la escala Cielab). (i = 1, 2, 3)
Bj = Tipos de cocción al que fueron sometidos los granos de quinua:
extruido, expandido, torrefactado, cocción en agua a presión atmosférica y a presión elevada (j = 1, 2, 3, 4, 5).
(AB)ij = Interacción del color de quinua y los tipos de cocción (i =1, 2, 3) y (j = 1, 2, …, 5)
Eijk = Error experimental
En función de la sugerencia de Galili y Hoyay (2014), para determinar el contenido de fenólicos totales (polifenoles), betalaínas y la capacidad antioxidante de las semillas de quinua, se establecieron tres pasos: preparación de muestras, extracción de los componentes bioactivos y cuantificación de los mismos.
2.6.3. Preparación de muestras
Se tomó 2 a 4 g de semillas de quinua entera, escarificada o sometida a cocción y se sometió a triturado por un tiempo de 30 s. La muestra preparada fue utilizada inmediatamente para las operaciones posteriores.
2.6.4. Preparación del extracto o extracción de componentes bioactivos
Cada metodología utilizada demandó el uso específico de pasos para la preparación del extracto y fueron los siguientes:
a. Compuestos fenólicos totales. Se procedió al pesado de 0,5 g de la muestra triturada, en un tubo falcon, al que se incorporó 6 mL de metanol al 80%, y luego se mezcló a 120 rpm usando un agitador vórtex por el tiempo de un minuto, para después someter a almacenamiento a temperatura de 3° C por tiempo de 24 horas, en total oscuridad. Después de este tiempo se procedió con el centrifugado a 4500 rpm por tiempo de 15 min a 3° C, para luego separar el sobrenadante, al que se inyectó nitrógeno por 2 minutos y se almacenó en oscuridad a 3° C hasta el momento de análisis.
b. Betalaínas. Se procedió a pesado de 0,5 g de la muestra previamente triturada, al que se incorporó 6 mL de buffer fosfato a pH 6,5; y luego se mezcló a 120 rpm haciendo uso de un agitador vórtex por el tiempo de un minuto, para después someter a almacenamiento
a temperatura de 3° C por tiempo de 24 horas. Después de este tiempo se procedió a centrifugado a 4500 RPM por 30 min a 3° C, para luego proceder a la separación del sobrenadante que fue utilizado en la operación de determinación.
c. Capacidad antioxidante DPPH. Se procedió a pesado de 2 g de muestra triturada en un tubo falcon, al que se incorporó 6 mL de metanol al 80%, y luego se mezcló a 120 rpm haciendo uso de un agitador vortex, por el tiempo de un minuto, para después someter a almacenamiento en oscuridad completa y a temperatura de 3° C por tiempo de 24 horas. Después de este tiempo se procedió a centrifugar a 4500 RPM por 15 min a 3° C, para luego proceder a la separación del sobrenadante, al que se inyectó nitrógeno por 2 minutos y llevó a almacenamiento en oscuridad a 3° C hasta el momento del análisis.
d. Capacidad antioxidante ABTS. Extracto hidrofílico: se pesó 3 g de muestra triturada, al que se incorporó 6 mL de metanol al 80%, luego se mezcló a 120 rpm por un minuto haciendo uso de un agitador vortex, para después someter a almacenamiento en oscuridad completa a 3° C por el tiempo de 24 horas. Después de este tiempo se procedió a centrifugado a 4500 RPM por 15 min a 3°
C, para luego proceder a la separación del sobrenadante, al que se inyectó nitrógeno por 2 minutos y se llevó a almacenamiento en oscuridad a 3° C hasta el momento del análisis. Extracto lipofílico:
A la parte del precipitado de extracto hidrofílico se le incorporó 6 mL de alcohol isopropílico, y luego se mezcló haciendo uso de un agitador vortex por el tiempo de un minuto a la velocidad de 120 rpm, para después someter a almacenamiento en oscuridad completa a 3
° C por el tiempo de 24 horas. Transcurrido este tiempo la mezcla fue centrifugada a velocidad de 4500 RPM por tiempo de 15 min a 3° C, después se procedió con la separación del sobrenadante, al que se le inyectó nitrógeno por 2 minutos y se llevó a almacenamiento en oscuridad y a 3°C hasta el momento del análisis.
2.6.5. Técnicas utilizadas para la cuantificación de variables respuesta
Las técnicas utilizadas para el recojo de datos y/o variables respuesta, fueron las siguientes:
a. Contenido de compuestos fenólicos totales
El procedimiento Folín-Ciocalteu con modificaciones incorporadas por (Singleton & Rossi, 1965 y Li et al., 2012) fue utilizado para la determinación de fenoles totales en quinua. Para este efecto, se tomó 200 µL de extracto por triplicado, y a cada uno se incorporó 200 µL de reactivo Folín Ciocalteu 1N, 2 mL de carbonato de sodio al 7 % y 2,6 mL de agua destilada. Luego se mezcló haciendo uso de un agitador vortex por el tiempo de un minuto a velocidad de 80 rpm, para luego dejarlo en reposo por el tiempo de una hora, en oscuridad y a temperatura ambiente (17 ± 2º C). Pasado este tiempo se procedió con la medición de la absorbancia a 750 nm, utilizando agua destilada como blanco. El TPC (contenido de polifenoles totales) obtenido como dato final, se expresó en miligramos de ácido gálico equivalente por gramo de semilla de quinua (mg GAE/100 g m.s.).
b. Contenido de betalaínas
El método espectrofotométrico de componentes múltiples de Nilsson (1970), fue utilizado para la determinación de betalaínas, como la suma de los pigmentos de betaxantina y betacianina. Con este fin el sobrenadante del extracto obtenido fue sometido a medición de absorbancia a 538 nm y luego a 476 nm, utilizando para ambos casos agua destilada como blanco. Efectuado los cálculos correspondientes, los resultados fueron expresados como mg de betaxantinas o betacianina por 100 gramos de materia seca y la suma de las mismas como mg de betalaínas/100 g m.s.
c. Actividad antioxidante DPPH
El método DPPH (2,2-diphenil-1-picrylhydrazyl), propuesto por Dini, et al., 2010, para quinua, fue utilizado para la determinación de la actividad antioxidante de las semillas. Para este efecto, se midió 100 µL del extracto por triplicado, al que se incorporó 2900 µL del radical DPPH, que fue preparado previamente con 3,9 mg de DPPH que fue disuelto en 100 mL de metanol al 80 %. Se procedió al mezclado haciendo uso de un agitador vortex a 120 rpm, por el tiempo de un minuto, para luego dejarlo en reposo en oscuridad, a temperatura ambiente (17º ± 2º C), por el tiempo de 30 minutos, Procediéndose finalmente con la lectura espectrofotométrica de absorbancia a 517 nm utilizando metanol al 80 % como blanco. Efectuado los cálculos correspondientes, los resultados fueron expresados como mg equivalente Trólox (TEAC, Trólox equivalent antioxidant capacity/100 g m.s.)
d. Actividad antioxidante ABTS
El método ABTS (2,2'- azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato), fue utilizado para la determinación de la actividad antioxidante de las semillas de quinua. Con este fin, se procedió a la preparación de la solución madre: mezclando partes iguales de los reactivos A y B, para después dejarlos reaccionar por 12 horas a temperatura ambiente. Reactivo A: fue preparado pesando 78,4 mg de ABTS, que fueron vertidos en una fiola y luego enrasado con agua destilada a 10 mL. El producto fue almacenado en oscuridad y a temperatura de 3° C por tiempo máximo de 5 días. Reactivo B: fue preparado con 13,2 mg de persulfato de potasio que fue vertido en una fiola y luego enrasado a 10 mL. El producto fue almacenado en oscuridad a temperatura de 3°C por tiempo máximo de 5 días.
Pasado el tiempo de reacción de 12 horas de la solución madre, se procedió con la preparación de la solución diluida de ABTS, para lo
que se tomó 1 ml de la solución madre al que se adicionó 60 mL de metanol puro. Luego se leyó la absorbancia utilizando metanol puro como blanco, La lectura exigida fue de 1,1 ± 0,02 a 734 nm. En los casos en que la lectura no fue la indicada, se corrigió adicionando solución madre para concentrar o solvente para diluir, según cada caso, hasta obtener la absorbancia indicada.
La determinación final: se realizó tomando 100 µL del extracto hidrofílico o lipofílico, al que se incorporó 1900 µL de la solución diluida de ABTS, procediéndose luego al mezclado haciendo uso de un agitador vortex a velocidad de 120 rpm por el tiempo de 30 segundos. La mezcla obtenida fue luego almacenada en oscuridad y a temperatura ambiente por el tiempo de 5 minutos para después someter a la lectura de absorbancia a 734 nm de longitud de onda, utilizando solvente puro como blanco según el extracto empleado.
Efectuado los cálculos los resultados fueron expresados como mg TE/100 g m.s., tanto para los extractos hidrofílicos como para los lipofílicos o para el total que es la suma de estos dos.
e. Determinación de color de los granos de quinua
Las semillas enteras de quinua antes y después del escarificado fueron sometidas a medición de color utilizando el espacio de color CIELAB determinándose las siguientes coordenadas de color L*
(luminosidad), a* (entre rojo y verde) y b* (entre amarillo y azul). Cada muestra se midió por triplicado usando un colorímetro CR-400 (Konica Minolta Inc., Japón) previamente calibrado, procedimiento sugerido por Macavilca y Hoyos (2020); Fernández, et al., (2019);
Ballester, Fernández y Haros (2019); Anton, Fulcher, y Arntfield (2019).
2.6.6. Instrumentos de proceso y de recopilación de datos
Los instrumentos utilizados para la preparación de muestras y lectura de los datos relacionados con las variables respuesta fueron:
Agitador magnético marca VEL SCIENTIFICA
Agitador vortex mixer VEL SCIENTIFICA.
Balanza analítica marca OHAUS –PA224
Colorímetro CR-400 (Konica Minolta Inc., Japón)
Estufa de secado MEMMERT – UN75
Centrífuga refrigerada marca CENTURION SCIENTIFIC PRO- ANALYT.CR4000R.
Licuadora marca Oster Profesional BP5-T02-B00-053
Cañón de expansión de 1,0 kg de capacidad, con cuerpo de acero y tapa de teflón.
Escarificador de quinua con rotor vertical y pared de lija, equipado con motor de 1,0 HP
Espectrofotómetro UV-VIS, marca Shimadzzu UV 2600
Equipo de cocción a presión atmosférica de acero inoxidable
Equipo de cocción a presión elevada de acero inoxidable
Equipo de trituración marca Oster
Extrusor de tornillos de 20 kg/h de capacidad, equipado con motor de 10 HP y cortador con motor de 0,5 HP
pH-metro marca OHAUS – ST3 100
Tamiz No 50-48 MESH-300 micrometer marca W.S.TYLER.
Torrefactor abierto a presión atmosférica
2.6.7. Reactivos y materiales usados para la preparación de muestras y recojo de datos
a. Reactivos
Los reactivos e insumos que se utilizaron para la preparación de muestras y durante las lecturas espectrofotométricas fueron las siguientes:
Ácido gálico
Acido oxálico
Agua destilada
ABTS 2,2 Azino-bis(3ethylbenzothializone-6-sulfonic acid)
Carbonato de sodio
2,2-difenil-1-picrilhydrazyl (DPPH), marca: Sigma - Aldrich
Folín Ciocalteu 1N, marca: Sigma- Aldrich
Fosfato de potasio dibásico
Fosfato de potasio monobásico
Metanol
Trólox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil croman-2-ácido carboxílico)
Persulfato de potasio
Alcohol isopropílico
b. Materiales
Los materiales de vidrio que se usaron durante la etapa de preparación de muestras y para las lecturas espectrofotométricas fueron:
Buretas de 1,0; 5,0 y 10,0 mL.
Celdas espectrofotométricas de vidrio de cuarzo de 1 cm x 1 cm
Embudos de vidrio
Espátulas de metal Frascos de color ámbar de 50 mL
Fiolas de 10 y 25 mL
Matraces de Erlenmeyer de 50 y 100 mL
Gradillas de metal para tubos
Placas Petri de 9 cm de diámetro y 1,5 cm de altura
Matraces de Erlenmeyer de 50 y 100 mL
Micro pipetas de100 y 1000 µL: HW Kessel S.A (Orgenics)
Pipetas graduadas de 0,5; 1,0; 5,0 y 10 mL
Probetas de 10; 25 y 50 mL
Vasos de precipitación de 50; 100; y 250 mL
Tubos de ensayo de 150 mm de altura y 15 mm de diámetro
Campana desecadora