A mi familia, por seguirme y apoyarme durante el proceso, porque sin su apoyo y amor incondicional esto no hubiera sido posible. A mi pareja, por ser un gran apoyo en el proceso, por toda la experiencia acumulada, por su amor, paciencia y comprensión en este proceso, incluso en los momentos difíciles.
Resumen
Introducción
Marco teórico
Células troncales e Historia sobre el estudio de la pluripotencia
- Reprogramación celular
Estas células, al igual que las CE, se cultivaron sobre una capa nodriza de MEF y se descubrió que tenían capacidad de formación de teratocarcinoma, proliferación extensa y capacidad de diferenciación in vitro (Thomson et al., 1995). Otro tipo de células madre pluripotentes son las células germinales embrionarias (EGC).
Línea celular hESC H9
A lo largo de los años, estudios exhaustivos de los mecanismos de reprogramación celular han llevado al desarrollo de varios métodos para la generación de líneas iPSC, incluido el uso de plásmidos, transposones, adenovirus, virus Sendai y ARNm, entre otros (Gomes et al., 2017). ) ). En particular, la línea H9 se caracteriza por tener un cariotipo normal (46XX) (Thomson et al., 1998).
Línea celular Amicqui-1
Una vez establecidas las supuestas colonias de hESC, se realizaron pruebas de caracterización, incluida la prueba de fosfatasa alcalina, el análisis de la expresión de marcadores de pluripotencia específicos cuantitativa y cualitativamente (RT-PCR e inmunocitoquímica, respectivamente), el análisis de las especificidades de superficie de los marcadores mediante inmunocitoquímica. y su capacidad de diferenciación hacia las tres capas germinales mediante métodos in vitro e in vivo (formación de cuerpos embrioides e inducción de teratomas). Así se estableció la primera línea hESC registrada en México, Amicqui-1 (Ávila et al., 2015).
Factores de pluripotencia
La expresión de Oct3/4 comienza en la etapa cigótica y posteriormente se restringe a las células ICM en el blastocisto. Un análisis cuantitativo de la expresión del 3/4 de octubre determinó que niveles precisos de este factor de transcripción pueden mediar en el destino de las células madre embrionarias. Un aumento doble en la expresión de Oct3/4 induce la diferenciación de ESC hacia endodermo y mesodermo primitivos, ascendentes.
29 expresión de marcadores de mesodermo y endodermo (Brachyury y Gata4, respectivamente), por el contrario, si se reduce la expresión de Oct3/4, las células pierden pluripotencia, aumentando los niveles de expresión de los marcadores Hand1 y Cdx2 (características del trofectodermo) y las células se diferencian hacia extraembrionarias. linajes, por lo tanto se requieren valores correctos del 3/4 de octubre para que las células ESC o iPSC puedan mantener su capacidad de autorrenovación y diferenciación (Figura 4) (Niwa et al., 2000). Relación entre los niveles de expresión del 3/4 de octubre y el destino de las células madre.
Caracterización de células troncales pluripotentes
- Técnicas de evaluación de pluripotencia
La expresión de los factores fundamentales de pluripotencia se puede utilizar para determinar el estado de pluripotencia de las células madre. La presencia de expresión del vector informador se evaluó cualitativamente mediante microscopía de fluorescencia (Figura 9 A). A continuación, los análisis cuantitativos de citometría de flujo de la expresión de GFP celular (porcentaje) mostraron una diferencia estadísticamente significativa entre los tres grupos analizados (control, H9 y Amicqui-1) [(F p<.0001)] como se muestra en la Figura 9B.
Porcentaje celular de expresión de GFP, se observan diferencias significativas entre los grupos analizados. Inicialmente, la presencia de expresión de GFP se detectó cualitativamente mediante microscopía de fluorescencia en células hESC (Figura 9), y se observó una marcada diferencia en el número de células que expresan GFP entre las dos líneas de hESC.
Clonación molecular
Vectores recombinantes
- Vectores reporteros con GFP
Planteamiento del problema
Las células madre embrionarias humanas (hESC) son de gran importancia para la investigación por su capacidad de diferenciación, hacia cualquier linaje de las tres capas germinales y de autorrenovación, tanto para comprender los procesos de desarrollo humano como para generar sistemas de cultivo. in vitro para estudiar enfermedades humanas, perfiles genéticos y descubrir dianas terapéuticas y fármacos. La pluripotencia en las hESC es un factor determinante y limitante para su posterior aplicación, por lo que es fundamental monitorear el estado celular pluripotente e identificar células que presentan características indeseables como deficiencia en la diferenciación, baja tasa de crecimiento y morfología anormal (Kato et al. al. ., 2014). Sin embargo, los métodos in vitro actuales tienen desventajas como un alto requerimiento de tiempo, dificultad en la estandarización, baja escalabilidad y alteración o daño celular que imposibilita el uso de las células analizadas en análisis posteriores (Cota-Coronado et al., 2019).
Los primeros resultados indican que los métodos utilizados funcionan y que las células hESC siguen siendo una alternativa muy prometedora para el tratamiento de enfermedades crónicas-degenerativas y genéticas. Las células ES son esenciales hoy en día para comprender mejor la biología del desarrollo y mejorar el uso médico de cualquier célula pluripotente; sin embargo, se deben considerar algunos factores críticos antes de su uso, como la selección, mantenimiento y evaluación. de pluripotencia en estas líneas celulares, para lo cual se deben utilizar métodos moleculares, ya que las células en cultivo in vitro muchas veces pueden mantener una morfología similar a las células hESC y carecen de propiedades moleculares y funcionales comparables.
Hipótesis
Objetivos
General
Específicos
Métodos experimentales
- Diseño experimental
- Tipo de estudio
- Criterios de inclusión/exclusión
- Grupos de estudio
- Análisis estadístico
Como se muestra en la Tabla 1, se considera un grupo de control y un grupo de prueba para cada línea celular incluida en este trabajo.
Materiales y métodos
Primera fase experimental: Desarrollo del reportero pAAV-POU5F1-IRES-
- Diseño y preparación de vector
El mapeo de restricción del vector pAAV-POU5F1-IRES-GFP se realizó utilizando el software SnapGene. Se utilizó el kit de enzimas de alta fidelidad Phusion de New England Biolabs (Cat. M0530S) para amplificar los promotores según lo especificado por el proveedor, como se muestra en la Tabla 4, en las condiciones de amplificación presentadas en la tabla. 35 ciclos. Luego del aislamiento de la secuencia promotora, ésta fue digerida en las mismas condiciones y con enzimas de restricción utilizadas previamente para el vector.
51 La amplificación de la secuencia promotora y la linealización del vector se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Se realizó una PCR de colonias para identificar y seleccionar aquellas colonias bacterianas que presentaban la secuencia insertada de interés utilizando los oligos previamente diseñados según las instrucciones del proveedor del kit DreamTaq PCR Master Mix 2X (Thermo Fisher Scientific cat. K1071). Las proporciones utilizadas se enumeran en la Tabla 7, esta PCR de colonias se realizó en las condiciones indicadas previamente en la Tabla 5, durante 35 ciclos.
Segunda fase experimental: Transfección y evaluación de funcionalidad del
- Cultivo celular y transfección
- Citometría de flujo
- Selección de células positivas GFP
- Cinética de proliferación celular
- Análisis de perfil pluripotente
Las células transfectadas se analizaron mediante citometría de flujo para determinar el porcentaje de expresión de GFP en las líneas celulares transfectadas. Para esto, las células se lavaron dos veces con PBS previamente sazonado 1X (0,01 M) y se separaron añadiendo 200 µl/pocillo de tripsina (0,025 % v/v) y se incubaron durante tres minutos a 37 °C y 5 % de CO2. Se apagó añadiendo 400 µL de medio de mantenimiento hESC. Las células en las que se detectó la expresión de GFP se eliminaron del cultivo manualmente con la ayuda de un raspador celular y se recuperaron en medio de mantenimiento hESC.
En los días de conteo, las células se lavaron dos veces con PBS 1X previamente templado y se separaron aplicando 50 µL de tripsina por pocillo para su posterior incubación durante 4 minutos a 37°C. A continuación, las células se permeabilizaron y bloquearon incubándolas durante una hora a temperatura ambiente en 100 µl de solución 1 (10 % de suero normal de caballo y 0,3 % de TritonX100 en 1X PBS/1 % BSA).
Resultados
- Desarrollo del vector reportero pAAV-pou5f1-IRES-GFP
- Evaluación de expresión de GFP
- Evaluación de la proliferación celular
- Evaluación de la expresión de marcadores de pluripotencia
La línea celular H9 presentó un mayor número de células positivas para expresión de GFP (79,48%) en comparación con la población de células de Amicqui, como se ilustra en la Figura 9 C. Evaluación de la expresión del reportero GFP en las líneas celulares transfectadas. Se observaron diferencias no significativas (p>0,578) entre el porcentaje de expresión Oct3/4 entre los grupos control y la línea celular H9 GFP. Imágenes representativas de la expresión de marcadores de pluripotencia en la línea H9 se ilustran en la Figura 11 A. la expresión de Nanog en los grupos evaluados, los resultados del ANOVA unidireccional muestran que existen diferencias significativas en la expresión de Nanog entre los grupos (F p=0.0005).
De izquierda a derecha, tinción de núcleos con DAPI, Oct3/4 o Nanog, Sox2 y finalmente colocalización celular de la presencia de estos marcadores. En la expresión de Nanog, se observa una diferencia significativa solo entre líneas celulares que comparan los controles (H9 y Amicqui-1 control) y GFP+, H9 y Amicqui-1 GFP+ (p<0,02 y p<0023, respectivamente).
Discusión
Observamos una diferencia significativa en la tasa de proliferación de las células H9 de control en comparación con las células H9 GFP+; además, el patrón de crecimiento presentado en esta línea celular es consistente con lo reportado en la literatura. Como se esperaba, observamos una diferencia en la expresión Oct3/4 entre los grupos control y GFP+ de la línea celular H9 (82,67 y 94,75%, respectivamente), pero esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p<0,0654). Además, no se observó ninguna diferencia significativa en la expresión Oct3/4 entre las líneas celulares H9 GFP+ y Amicqui-1 GFP+.
Además, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la expresión de Nanog en los grupos evaluados. Finalmente, no se observó diferencia estadísticamente significativa en la expresión de Sox2 en los grupos de la línea celular H9 (p<0,8027), con valores medios de 86,78 y 88,47% para los grupos control y GFP+, respectivamente.
Conclusiones
Establishment of human embryonic stem cell line Amicqui-2 using poor quality embryos from the Mexican population. Human amniotic epithelial cells as a nutrient layer for obtaining and maintaining human embryonic stem cells from poor quality embryos. Stirred microcarrier culture of hES cells Successful scale-up of human embryonic stem cell production in a stirred microcarrier culture system.
Human induced pluripotent stem cells develop teratoma more efficiently and rapidly than human embryonic stem cells, regardless of injection site. Effects of Klf4 and c-myc knockdown on the maintenance of pluripotency in porcine induced pluripotent stem cells. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.
Changes in methylation status of Oct3/4, Nanog, and Sox2 promoters in stem cells during regeneration of mouse tracheal epithelium after injury.
