Este trabajo de tesis se realizó en las instalaciones del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C, bajo la dirección del Dr. de linfocitos T CD8+ de placas de Peyer de ratones infectados con G.
Histogramas representativos de la población de linfocitos B CD21/35+ de placas de Peyer de ratones infectados con G. Se observó un aumento en la población de linfocitos CD35/21+ en el grupo de control el día 6 después de la infección (p<0,05). , con un comportamiento similar entre ambos grupos a lo largo del resto de la infección. Se encontró un aumento en la producción total de IgA en el grupo CLA durante la infección, coincidiendo la concentración máxima el día 21 post-infección con la fase de eliminación del parásito.
En conclusión, CLA modula la respuesta adaptativa de ratones infectados con Giardia lamblia, aumentando la producción de IgA e IFNγ, que participan en el control de la infección.
Introducción
Antecedentes y justificación
- Ácido Linoleico Conjugado
- Origen y Síntesis
- Propiedades Fisiológicas
- Efecto del Ácido Linoleico Conjugado en la Respuesta Inmune Adaptativa
- Respuesta Humoral Sistémica
- Respuesta Humoral en Mucosas
- Respuesta Celular
- Inmunidad en Mucosas
- Producción de Citocinas
- Activación de Linfocitos
- Generación de IgA en Mucosas
- Importancia de la Respuesta Inmune en Mucosas
- Giardia lamblia
- Morfología
- Variabilidad Antigénica
- Patogenia
- Respuesta Inmune Contra Giardia lamblia
La primera propiedad biológica reconocida del CLA fue anticancerígena en ratones (Pariza et al., 1985). Consiste principalmente en la eliminación de las células infectadas por los linfocitos T citotóxicos (CD8+), mientras que las células T colaboradoras (CD4+) funcionan como recurso para otras células efectoras (Murphy et al., 2009). Este efecto se mantuvo incluso al final de la lactancia (Ramírez-Santana et al., 2009).
Este aumento de anticuerpos también fue observado por Ramírez-Santana et al. 2009), quienes evaluaron los efectos de la suplementación con CLA en ratas Wistar durante el embarazo y la lactancia. Sugano et al. 1998) no observaron ningún efecto sobre la proporción de linfocitos CD4+/CD8+ en ratas. Por el contrario, Kelley et al. 2002) no encontraron ningún efecto del CLA, suplementado durante 56 días, sobre la proliferación de linfocitos esplénicos estimulados con Con-A y LPS.
También se ha descubierto que la IL-6 promueve la diferenciación terminal de los linfocitos B en células plasmáticas secretoras de IgA (Kurashima et al., 2014). Además, se observó producción de IL-8 en la lámina propia, lo que se asoció con procesos inflamatorios (Abbas et al., 2012). Esto puede deberse al hecho de que las células dendríticas son estimuladas por antígenos de la flora comensal (Mcpherson et al., 2004).
Estas interacciones inducen proliferación, cambio de isotipo, hipermutación somática y maduración de afinidad en los linfocitos B para producir IgA específica (Suzuki et al., 2007). Indicando la migración de linfocitos B IgA+ desde otros sitios hacia la mucosa intestinal (Suzuki et al., 2007). También se asocia con mala absorción de nutrientes, debido al daño del tejido epitelial y la consiguiente desnutrición (Sullivan et al., 1991).
Lo que sugiere que el mecanismo de variación antigénica está relacionado con procesos de diferenciación (Carranza et al., 2002). In vitro se ha demostrado que el parásito puede inducir apoptosis y degradación de las uniones de las monocapas intestinales (Chin et al., 2002). También se ha descubierto que el óxido nítrico producido por las células epiteliales intestinales inhibe la proliferación y diferenciación de los trofozoítos (Eckmann et al., 2000).
Aunque también se han encontrado mecanismos independientes de las células B que actúan en la etapa temprana de la infección (Li et al., 2004, Singer et al., 2000).
Objetivo General
Objetivos Específicos
Materiales y Métodos
- Animales
- Tratamientos
- Cultivo de Giardia lamblia
- Peso de los Ratones
- Infección Experimental
- Colecta de Muestras Biológicas
- Conteo de Trofozoítos
- Obtención de Extracto Antigénico de Giardia lamblia (EAGL)
- Extracto Fecal para la Determinación de Inmunoglobulinas
- Obtención de Linfocitos de Placas de Peyer
- Inmunofenotipificación de Poblaciones Linfocíticas de Placas de Peyer
- Producción de Citocinas ex vivo
- Cuantificación de Inmunoglobulinas Totales y Citocinas por ELISA
- Inmunoglobulina A Giardia-Específica
- Análisis Estadístico
Para activar la cepa se tomó un vial que contenía 2x106 trofozoitos, se descongeló a temperatura ambiente y se agitó 2 veces por inversión. El contenido del vial se transfirió a un tubo de vidrio de 10 ml, que contenía 5 ml de medio TYI-S-33 frío suplementado, y luego se llevó hasta el volumen total del tubo con dicho medio. Se incubó durante unos 2 – 3 días a 37ºC, hasta observar una monocapa de trofozoítos en todo el tubo.
Para realizar la expansión de la cepa, el tubo de activación se colocó en agua helada durante 15 minutos para disociar los trofozoítos, después de dividir en alícuotas el contenido del tubo en tubos de 20 ml con TYI-S-33. La sección duodenal extirpada (aproximadamente 10 cm) se resuspendió en 1,5 ml de PBS estéril frío y se incubó durante 1 hora a 4 ° C en rotación semihorizontal. La carga parasitaria también se evaluó en el resto de los bioensayos el día 0 de la infección, 6, 21 y 40 post infección.
Se lavaron 50 x 10 trofozoítos tres veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), se agregaron 100 µl de mezcla inhibidora de proteasa (SIGMA) y se llevaron a un volumen final de 500 µl con PBS, se congelaron en nitrógeno líquido y se descongelaron a temperatura ambiente. temperatura tres veces. Se recogieron muestras fecales en el momento del sacrificio y se colocaron en 0,6 ml de PBS + albúmina al 0,1% (PBA) con antibióticos en presencia de 100 µl de inhibidores de proteasa (SIGMA), luego se incubaron durante 1 hora a 4°C. El sobrenadante se conservó y almacenó a -80°C hasta su uso para la cuantificación de anticuerpos (Jiménez et al., 2004).
El sedimento celular se resuspendió en 2 ml de RPM+SFB a 37°C y se almacenó a 4°C hasta su uso. Se realizó la identificación de las poblaciones de linfocitos PP obtenidas el día preinfección (tiempo 0) y los días 40 y 40 postinfección. Se cultivaron 2x105 células con 50 µg/ml de EAGL, 20 µg/ml de miristatoacetato de forbol (PMA) e ionomicina (Life Technologies) o 20 µg/ml de fitohemaglutinina (PHA).
Las diluciones de las muestras para la determinación de IgA total fueron 1:1000 y para citoquinas fueron 1:5. Para ello, se fijó extracto antigénico de Giardia lamblia (50 μg/mL en un volumen de 100 μL por pocillo) en una placa de 96 pocillos de alta adherencia (ThermoScientific) y se incubó durante la noche a 4°C.
Resultados y Discusiones
- Animales
- Conteo de Trofozoítos
- Inmunofenotipificación de Poblaciones Linfocítifcas de Placas de Peyer . 32
- Cuantificación de Inmunoglobulinas tipo IgA Total e IgA Giardia-específica
Mientras que Franco et al., (2013), encontraron una carga parasitaria similar a la de nuestro grupo, 2,8x104 trofozoítos, el día 7 post-infección en ratones C57B1/6. Respecto a los linfocitos T CD4 en PP, se observó que al inicio de la infección el grupo control y el grupo CLA mostraron porcentajes similares, los cuales disminuyeron al día 6 después de la infección (p < 0,05) (Figura 3). Esta disminución de la población T CD4+ al día 6 post-infección difiere de lo encontrado en otros estudios en ratones donde se observó un aumento de estas células en la fase aguda de la infección (Abdul-Wahid et al., 2008; Franco. et al. al., 2013).
Este aumento inicial en la población CD8+ concuerda con lo encontrado por Yamasaki et al. Sin embargo, este aumento temprano no se observó en el grupo CLA, que no mostró cambios significativos desde el inicio de la infección hasta el día 21 postinfección (p < 0,05). Asimismo, se observó un aumento de linfocitos B en el grupo control y en el grupo CLA los días 21 y 40 después de la infección (p < 0,05), lo que concuerda con lo encontrado por el grupo de Abdul-Wahid et al., 2008).
En el grupo CLA, se observó un aumento en la producción de IFNγ en células estimuladas con PHA el día 6 post-infección, así como una mayor producción en respuesta a la estimulación con extracto antigénico G. Esto concuerda con lo observado por Abdul- Wahid et al., (2008) quienes observaron un aumento en el número de células productoras de IFNγ expuestas al extracto de trofozoitos de G. Además, Jiménez et al., (2014) también encontraron un aumento en la producción de IFNγ el día 7 post- Infección en respuesta a antígenos G.
Se observó una mayor producción de IL-17A en las células estimuladas con PMA + ionomicina en el grupo CLA, independientemente del tiempo de infección (p < 0,05). La producción de anticuerpos IgA totales en el extracto fecal se evaluó durante la infección y se encontró una mayor producción en el grupo CLA que en el control al inicio de la infección (p < 0,05). La concentración más alta de IgA total en el grupo control y en el grupo CLA se encontró el día 21 después de la infección (p < 0,05).
Esto último concuerda con otros estudios, como Amorim et al., (2010) quienes encontraron mayor producción de IgA total el día 21 post-infección en jerbos inoculados con G. 2005) observaron un aumento de IgA en la segunda semana de infección. en ratones C3H/HeJ infectados con un inóculo similar al nuestro. Jiménez et al., (2004) por su parte encontraron un pequeño aumento en la producción de IgA a partir de la segunda semana de la infección, que se volvió significativo hacia la tercera semana después de la infección en ratones BALB/c. Se observó un mayor nivel de anticuerpos en el grupo CLA correspondiente al día 6 (p < 0,05) en comparación con el grupo control.
El grupo de Abdul-Wahid et al., (2008), encontró a su vez un ligero aumento de IgA específica en la fase aguda de la infección, en las primeras semanas, que aumentó significativamente hacia la fase de eliminación (día 40 después de la infección). .
Conclusión
Simultaneous expression of different variant-specific surface proteins in individual trophozoites of Giardia lamblia during encystation. Strain-dependent induction of enterocyte apoptosis by Giardia lamblia disrupts epithelial barrier function in a caspase-3-dependent manner. Conjugated linoleic acid is a growth factor for rats, as shown by increased weight gain and improved feed efficiency.
Effect of supplementation with conjugated linoleic acid and omega-3 fatty acids on inflammatory and oxidative stress markers in atherosclerotic patients. Dietary conjugated linoleic acid influences the immune response of young and old C57BL/6NCrlBR mice. Dietary conjugated linoleic acid normalizes impaired glucose tolerance in the Zucker diabetic fatty fa/fa rat.
Conjugated linoleic acid isomers in partially hydrogenated soybean oil obtained during nonselective and selective hydrogenation processes. Modulation of body composition and immune cell functions by conjugated linoleic acid in humans and animal models: benefits versus effects of milk supplementation with conjugated linoleic acid on weight control and body composition in healthy overweight humans.
Antigenic conversion of TSA 417, a trophozoite variable surface protein, after completion of the life cycle of Giardia lamblia. Conjugated linoleic acid (CLA) prevents body fat accumulation and weight gain in an animal model. Enhancement of antibody synthesis in rats by feeding cis-9,trans-11 conjugated linoleic acid during early life.
Effect of a mixture of conjugated linoleic acid isomers on growth performance and antibody production in broilers. Immunoglobulin and cytokine production from splenic lymphocytes is modulated by dietary cis-9, trans-11 and trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid in C57BL/6J mice.
