UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
ESCUELA DE POSGRADO
UNIDAD DE POSGRADO DE LA FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
TESIS
PRESENTADA POR:
EDGAR RAFAEL ACOSTA LÓPEZ
PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE:
DOCTOR EN INGENIERÍA QUÍMICA Y AMBIENTAL
HUANCAYO - PERÚ 2020
EFECTO DE LA PRESIÓN, TEMPERATURA Y CONCENTRACIÓN DE CO-SOLVENTE EN LA EXTRACCIÓN DE POLIFENOLES DE
BRÁCTEAS DE ALCACHOFA (Cynara scolymus L.) CON CO
2SUPERCRÍTICO
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
UNIDAD DE POSGRADO
ACTA DE SUSTENTACIÓN DE TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORADO EN INGENIERÍA QUÍMICA Y AMBIENTAL MAESTRO: ACOSTA LOPEZ, EDGAR RAFAEL.
Siendo las once horas del día sábado veintiuno del mes de noviembre del año dos mil veinte, en la sala virtual de la plataforma G SUITE de la Unidad de Posgrado de la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Nacional del Centro del Perú; con la presencia del jurado de Sustentación de Tesis, conformado por los catedráticos:
PRESIDENTE : Dr. Pascual V. GUEVARA YANQUI.
SECRETARIO : Dr. Orlando A. VILCA MORENO.
ASESOR : Dr. Salvador T. ORE VIDALÓN.
VOCAL (01) : Dr. Salvador T. ORE VIDALÓN.
VOCAL (02) : Dr. Iván L. OSORIO LÓPEZ.
VOCAL (03) : Dr. Elías A. SANABRIA PÉREZ.
Se reunieron para la sustentación virtual, oral y pública de la Tesis para optar el grado Académico de Doctor en Ingeniería Química y Ambiental, del Maestro ACOSTA LOPEZ, EDGAR RAFAEL.
Después de darse lectura al Expediente N° 22347, en el que consta el cumplimiento de todas las disposiciones reglamentarias, los señores miembros del jurado, recepcionaron la Tesis titulada:
“Efecto de la presión, temperatura y concentración de cosolvente en la extracción de polifenoles de brácteas de alcachofa (Cynara scolymus L.) con CO2 supercrítico”
Y formuladas las preguntas, estas fueron defendidas y absueltas por el graduando.
Acto seguido el jurado procedió a la votación, el que dio como resultado el siguiente calificativo:
Vocal (01) :.
18.15 (Muy Bueno)
...Vocal (02) :
18.00 (Muy Bueno)
...Vocal (03) :
18.00 (Muy Bueno)
...PROMEDIO:
18.05 (Muy Bueno)
....Siendo las.
12.15
.horas, se dio por concluido el acto de sustentación, firmando al pie los presentes.Dr. Pascual V. GUEVARA YANQUI Presidente
Dr. Orlando Alfredo VILCA MORENO Dr. Salvador T. ORE VIDALÓN Secretario (Vocal 1)
Dr. Iván L. OSORIO LÓPEZ Dr. Elías A. SANABRIA PÉREZ.
(Vocal 2) (Vocal 3)
iii
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
ESCUELA DE POSGRADO
UNIDAD DE POSGRADO DE LA FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
TESIS
PRESENTADA POR:
EDGAR RAFAEL ACOSTA LÓPEZ PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE:
DOCTOR EN INGENIERÍA QUÍMICA Y AMBIENTAL
APROBADO POR EL JURADO SIGUIENTE:
PRESIDENTE: _____________________________
Dr. Pascual V. Guevara Yanqui
SECRETARIO: _____________________________
Dr. Orlando Alfredo Vilca Moreno
PRIMER MIEMBRO: _____________________________
Dr. Salvador T.Oré Vidalón
SEGUNDO MIEMBRO: _____________________________
Dr. Iván Luis Osorio López
TERCER MIEMBRO: _____________________________
Dr. Elías Adrián Sanabria Pérez
ASESOR DE TESIS: _____________________________
Dr. Salvador T.Oré Vidalón
Huancayo, 21 de noviembre del 2020
EFECTO DE LA PRESIÓN, TEMPERATURA Y CONCENTRACIÓN DE CO-SOLVENTE EN LA EXTRACCIÓN DE POLIFENOLES DE BRÁCTEAS DE ALCACHOFA (Cynara scolymus L.) CON CO
2SUPERCRÍTICO
iv
DEDICATORIA
A la memoria de mis queridos padres quienes me enseñaron que todo se logra con perseverancia y dedicación.
A mi esposa Angélica Castro Garay y mi hijo el Dr. Henry Rafael Acosta Castro por su apoyo y comprensión
v
AGRADECIMIENTO
Al Dr. Salvador Teódulo Óre Vidalón por su asesoría y apoyo en la ejecución y logro de la Tesis Doctoral.
Al Dr. Miguel Ángel Quispe Solano, coordinador del proyecto de investigación financiado con Fondos del Canon, Sobrecanon y regalías mineras.
A la Ingeniera Yesenia Ugarte Meléndez Jefe del laboratorio de Control de Calidad de La Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias.
A la plana docente del Doctorado de la Facultad de Ingeniería Química.
vi
ÍNDICE GENERAL
Carátula i
Acta de sustentación de tesis ii
Hoja de firmas iii
Dedicatoria iv
Agradecimiento v
Índice general vi
Índice de Tablas x
Índice de figuras xii
Resumen xiv
Abstract xv
Resumo xvi
INTRODUCCIÓN 17
CAPÍTULO I 19
MARCO TEÓRICO 19
1.1. Antecedentes 19
1.2. Bases teóricas y conceptuales 23
1.2.1. Alcachofa (Cynara scolymus L.) 23
a. Generalidades 23
b. Variedades 24
c. Composición química 25
d. Residuos del procesamiento de alcachofa 26
1.2.2. Tecnología de los solventes verdes 26
1.2.3. Extracción (sólido-líquido) o lixiviación 28 1.2.4. Extracción con fluidos supercríticos (SFE) 29
a. Fundamentos 29
b. Propiedades físicas 31
c. Curvas de extracción con fluidos supercríticos 32
d. Parámetros que afectan la extracción 33
1.2.5. Antioxidantes 35
a. Química de radicales libres y antioxidantes 36
vii
b. Antioxidantes naturales 36
c. Métodos para medir la actividad antioxidante 37
1.2.6. Compuestos fenólicos 38
a. Métodos o procedimientos de extracción de fenoles 39
b. Fenoles en la Cynara scolymus 40
1.2.7. Metodología de superficie de respuesta (MSR) 41
1.3. Definición de términos básicos 43
1.3.1. Brácteas de alcachofa 43
1.3.2. Temperatura y presión supercrítica 43
1.3.3. Co-solvente 43
1.3.4. Polifenoles totales 43
1.3.5. Capacidad antioxidante 44
1.4. Hipótesis de la investigación 44
1.4.1. Hipótesis general 44
1.4.2. Hipótesis específicas 44
1.5. Operacionalización de variables 44
CAPÍTULO II 46
DISEÑO METODOLÓGICO 46
2.1. Tipo y nivel de investigación 46
2.2.1. Tipo de investigación 46
2.2.2. Nivel de investigación 46
2.2. Métodos de investigación 46
2.3. Diseño de investigación 46
2.4. Población y muestra 47
2.4.1 Población 47
2.4.2 Muestra 47
2.4.3 Muestreo 47
2.5. Lugar de ejecución 47
2.6. Técnicas e instrumentos para la recolección de datos 48
2.6.1 Técnica 48
2.6.2. Instrumentos 48
viii
a. Equipos de laboratorio 48
b. Métodos 49
Obtención de harina de brácteas de alcachofa criolla 49
Extracción de polifenoles totales con CO2 supercrítico 49
Preparación del extracto 50
Determinación de polifenoles totales 50
Determinación de capacidad antioxidante (Método DPPH) 50
Determinación de capacidad antioxidante (Método ABTS●+)
50
Identificación de compuestos polifenólicos por HPLC- DAD.
51
2.7. Técnicas de procesamiento de datos 51
2.7.1. Efecto de las variables de extracción en los polifenoles por fluidos supercrítico
51
2.7.2. Optimización de los parámetros de extracción 53 2.7.3. Relación entre la capacidad antioxidante (Métodos DPPH y
ABTS con polifenoles totales
53
CAPÍTULO III 54
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 54
3.1. RESULTADOS 54
3.1.1. Contenido de humedad de brácteas de alcachofa criolla (Cynara scolymus L.)
54
3.1.2. Diámetro de partículas de harina de brácteas de alcachofa criolla
54
3.1.3. Polifenoles totales extraído con CO2 supercrítico a partir de brácteas de alcachofa criolla
55
a. Adecuación del modelo 55
b. Coeficientes estimados de la ecuación polinómica de segundo grado y análisis de varianza (ANOVA).
56
3.1.4. Capacidad antioxidante de brácteas de alcachofa criolla extraído con CO2 supercrítico
60
ix
a. Adecuación del modelo 60
b. Coeficientes estimados de la ecuación polinómica de segundo grado y análisis de varianza (ANOVA).
61
3.1.5. Relación entre polifenoles totales y capacidad antioxidante de brácteas de alcachofa criolla extraído con CO2 supercrítico
66
3.1.6. Identificación de compuestos polifenólicos de brácteas de alcachofa criolla (Cynara scolymus L.) a través de cromatografía líquida de alta perfomance
67
3.2. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 71
3.2.1. Efecto de las interacciones de las variables en los polifenoles totales de brácteas de alcachofa criolla extraído con CO2
supercrítico
72
a. Adecuación del modelo 74
b. Coeficientes estimados de la ecuación polinómica de segundo grado y Análisis de varianza (ANOVA).
74
c. Ajuste de la ecuación polinómica de segundo grado 75 3.2.2. Capacidad antioxidante por los métodos DPPH y ABTS 77 3.2.3. Condiciones óptimas de extracción de polifenoles totales con
CO2 supercrítico
80
3.2.4. Análisis de la relación entre polifenoles totales y capacidad antioxidante por los métodos DPPH y ABTS.
81
3.2.5. Compuestos polifenólicos de brácteas de alcachofa criolla (Cynara scolymus L.) identificados a través de cromatografía líquida de alta perfomance
82
CONCLUSIONES 86
RECOMENDACIONES 88
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 89
ANEXOS 103
x
ÍNDICE DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Análisis químico proximal de brácteas de alcachofa criolla (Cynara scolymus)
25
Tabla 2. Propiedades criticas de fluidos supercríticos (reproducido con permiso de (Herrero et al. 2006)
31
Tabla 3. Densidad, difusividad y viscosidad de un gas, un líquido y un fluido supercrítico
32
Tabla 4. Ensayos de capacidad antioxidante in vitro 38
Tabla 5. Operacionalización de variables 45
Tabla 6. Factores independientes y niveles correspondientes 47
Tabla 7. Tratamientos experimentales 52
Tabla 8. Humedad de brácteas de alcachofa criolla con espinas 54 Tabla 9. Diámetro de partículas de harina de brácteas de alcachofa
criolla
54
Tabla 10. Polifenoles totales extraído con CO2 supercrítico de brácteas de alcachofa criolla
55
Tabla 11. Modelo secuencial de (SC) para la adecuación de polifenoles totales extraídos con CO2 supercrítico
56
Tabla 12. Resumen de las estadísticas del modelo para extracción de polifenoles totales
56
Tabla 13. Coeficientes estimados y ANOVA para polifenoles totales extraídos con CO2 supercrítico
57
Tabla 14. Capacidad antioxidante de brácteas de alcachofa criolla extraído con CO2 supercrítico
60
Tabla 15. Modelo secuencial (SC) para la capacidad antioxidante por los métodos DPPH y ABTS
61
Tabla 16. Resumen de las estadísticas del modelo para la capacidad antioxidante métodos DPPH y ABTS
61
Tabla 17. Coeficientes estimados y ANOVA para el método de DPPH 62 Tabla 18. Coeficientes estimados y ANOVA para el método de ABTS 62
xi
Tabla 19. Concentración de compuestos polifenólicos detectados en brácteas de alcachofa criolla extraído con CO2 supercrítico.
69
Tabla 20. Cuantificación de compuestos polifenólicos detectados en brácteas de alcachofa criolla extraído con Metanol
71
Tabla 21. Concentraciones de ácido gálico y absorbancias para la curva estándar de ácido gálico
105
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Alcachofa criolla (Cynara scolymus L.) con espinas 24 Figura 2. Períodos de extracción con fluidos supercríticos 33 Figura 3 Esquema del equipo de extracción con CO2 supercrítico 49 Figura 4. Diagnóstico de valores predichos y experimentales de
polifenoles totales
57
Figura 5. Residuos estandarizados versus orden de observación para polifenoles totales
58
Figura 6. Probabilidad normal de residuos studentizados para polifenoles totales
58
Figura 7. Gráficos de interacción y superficie de respuesta de polifenoles totales (a1 y a2) presión vs temperatura, (b1 y b2) temperatura vs co-solvente y (c1 y c2) presión vs co-solvente
59
Figura 8. Diagnóstico de valores predichos y experimentales por los métodos DPPH (a) y ABTS (b)
63
Figura 9. Residuos estandarizados versus orden de observación de los métodos DPPH (a) y ABTS (b)
63
Figura 10. Probabilidad normal de residuos de la capacidad antioxidante para los métodos DPPH (a) y ABTS (b)
63
Figura 11. Gráficos de interacción y superficie de respuesta de capacidad antioxidante método DPPH (a1 y a2) presión vs temperatura, (b1 y b2) temperatura vs co-solvente y (c1 y c2) presión vs co-solvente
64
Figura 12. Gráficos de interacción y superficie de respuesta de capacidad antioxidante método ABTS (a1 y a2) presión y temperatura, (b1 y b2) temperatura vs co-solvente y (c1 y c2) presión vs co-solvente
65
Figura 13. Dispersión de la capacidad antioxidante DPPH y polifenoles totales de brácteas de alcachofa criolla
66
xiii
Figura 14. Dispersión de la capacidad antioxidante ABTS y polifenoles totales de brácteas de alcachofa criolla
66
Figura 15. Cromatograma HPLC-DAD de compuestos polifenólicos del extracto de Brácteas de alcachofa criolla extraído con CO2
supercrítico
68
Figura 16. Cromatograma HPLC-DAD de compuestos polifenólicos del extracto de Brácteas de alcachofa criolla extraído con Metanol
70
Figura 17. Flujograma del secado de brácteas de alcachofa criolla 104
Figura 18. Curva estándar de ácido gálico 106
Figura 19. Variación de color en la reacción de ácido gálico 106
Figura 20. Curva estándar Trolox radical DPPH 107
Figura 21. Variación de color en la reacción de DPPH 107
Figura 22. Curva estándar Trolox radical ABTS+ 108
Figura 23. Variación de color en la reacción de ABTS 108 Figura 24. Gráfica de contornos de interacciones (presión-temperatura),
(presión – co-solvente) y (temperatura – co- solvente) de polifenoles totales
114
Figura 25. Gráfica de contornos de interacciones (presión - temperatura), (presión – co-solvente) y (temperatura – co- solvente) de la capacidad antioxidante método DPPH
115
Figura 26. Gráfica de contornos de interacciones (presión - temperatura), (presión – co-solvente) y (temperatura – co- solvente) de la capacidad antioxidante método ABTS
116
Figura 27 Rampas de optimización de las variables de extracción y polifenoles totales, DPPH y ABTS
117
xiv RESUMEN
El objetivo fue evaluar el efecto de la presión, temperatura y co-solvente en la extracción de polifenoles de brácteas de alcachofa (Cynara scolymus L.) con CO2
supercrítico. Para medir los polifenoles totales (FT) y la capacidad antioxidante del extracto se utilizó el método de Folin-Ciocalteu y los ensayos de radicales libres DPPH y ABTS respectivamente. Para optimizar los parámetros de extracción de (FT) se utilizó la metodología de superficie de respuesta (MSR) diseño central compuesto; con tres factores y tres niveles, los resultados experimentales se ajustaron a un modelo polinomial de segundo grado, las variables independientes lineales presión y temperatura; los términos de segundo grado presión, temperatura y co-solvente, las interacciones entre la presión y temperatura; la presión y co- solvente, así como la temperatura y co-solvente presentaron efectos significativos en los polifenoles totales y en la capacidad antioxidante. Los parámetros óptimos de extracción fueron presión 321,731 bar, temperatura 44,377 °C y co-solvente etanol 2,067 mL/min, el contenido de (FT) fue de 15,510 mg EAG/g ms, capacidad antioxidante 7,241 mg ET/g ms; 9,695 mg ET/g ms para los métodos DPPH y ABTS, valores predichos que se aproximan a los experimentales que demuestran la confiabilidad del modelo. La capacidad antioxidante obtenida por los ensayos DPPH y ABTS presentaron correlación positiva con los (FT), en la cuantificación de polifenoles por HPLC-DAD, se identificaron derivados de ácido hidroxicinámico, ácido clorogénico y ácido 4,5 di-cafeoilquínico, derivados de flavanol, derivados de ácido hidroxibenzoico y derivados de flavona.
Palabras clave: Brácteas, supercrítico, fenoles, antioxidantes
xv ABSTRACT
The objective was to evaluate the effect of pressure, temperature and co-solvent in the extraction of polyphenols from artichoke bracts (Cynara scolymus L.) with supercritical CO2. To measure the total polyphenols (FT) and the antioxidant capacity of the extract, the Folin-Ciocalteu method and the DPPH and ABTS free radical tests respectively were used. To optimize the extraction parameters of (FT), the response surface methodology (MSR) was used central composite design; With three factors and three levels, the experimental results were adjusted to a second degree polynomial model, the linear independent variables pressure and temperature; the second degree terms of pressure, temperature and co-solvent, the interactions between pressure and temperature; pressure and co-solvent, as well as temperature and co-solvent showed significant effects on total polyphenols and antioxidant capacity. The optimal extraction parameters were pressure 321,731 bar, temperature 44,377 ° C and ethanol co-solvent 2,067 mL / min, the content of (FT) was 15,510 mg EAG / g ms, antioxidant capacity 7,241 mg TE / g ms; 9,695 mg ET/
g ms for the DPPH and ABTS methods, predicted values that are close to the experimental ones that show the reliability of the model. The antioxidant capacity obtained by the DPPH and ABTS tests showed a positive correlation with the (FT), in the quantification of polyphenols by HPLC-DAD, derivatives of hydroxycinnamic acid, chlorogenic acid and 4,5 di-caffeoylquinic acid, derivatives of flavanol were identified , hydroxybenzoic acid derivatives and flavone derivatives.
Key words: Bracts, supercritical, phenols, antioxidants
xvi RESUMO
O objetivo foi avaliar o efeito da pressão, temperatura e co-solvente na extração de polifenóis de brácteas de alcachofra (Cynara scolymus L.) com CO2 supercrítico.
Para medir os polifenóis totais (FT) e a capacidade antioxidante do extrato, foram utilizados o método de Folin-Ciocalteu e os testes DPPH e ABTS de radicais livres, respectivamente. Para otimizar os parâmetros de extração de (FT), a metodologia de superfície de resposta (MSR) foi usado projeto composto central; Com três fatores e três níveis, os resultados experimentais foram ajustados a um modelo polinomial de segundo grau, as variáveis lineares independentes pressão e temperatura; o segundo grau expressa pressão, temperatura e co-solvente, as interações entre pressão e temperatura; a pressão e o co-solvente, assim como a temperatura e o co-solvente apresentaram efeitos significativos sobre os polifenóis totais e a capacidade antioxidante. Os parâmetros de extração ideais foram pressão 321,731 bar, temperatura 44,377 ° C e co-solvente etanol 2,067 mL/min, o conteúdo de (FT) foi 15,510 mg EAG /g ms, capacidade antioxidante 7,241 mg TE/g ms; 9,695 mg ET/g ms para os métodos DPPH e ABTS, valores previstos próximos aos experimentais que demonstram a confiabilidade do modelo. A capacidade antioxidante obtida pelos testes DPPH e ABTS apresentou correlação positiva com o (FT), na quantificação de polifenóis por HPLC-DAD, derivados do ácido hidroxicinâmico, ácido clorogênico e ácido 4,5 di-cafeoilquínico, foram identificados derivados do flavanol , derivados do ácido hidroxibenzóico e derivados de flavona.
Palavras-chave: Brácteas, supercríticas, fenóis, antioxidantes
17
INTRODUCCIÓN
La alcachofa (Cynara scolymus L.) se consumen frescas y procesadas, los fondos y corazones son el producto principal que es la parte interna de la cabeza de la planta (parte interna de la flor) (Kollia, Markaki, Zoumpoulakis, & Proestos, 2017).
Los subproductos (brácteas, tallos y hojas) del procesamiento industrial representan el 70% del peso de la flor y no son aptas para el consumo humano (López-Molina et al., 2005), los cuales son destinados para alimentación animal o desechado en vertederos, que se acumulan en grandes cantidades generando contaminación ambiental (Frutos, Ruiz-Cano, Valero-Cases, Zamora, & Pérez-Llamas, 2018), es un alimento muy apreciado por sus propiedades medicinales y efectos beneficiosos para la salud posee compuestos bioactivos, principalmente polifenoles, inulina y fibra dietética (Frutos et al., 2018; Nermien, Thabet, Markeb, Sayed, & El-Maali, 2019), fuente natural de ácidos fenólicos (cinarina y clorogénico), derivados flavonoides (luteolina y apigenina) y xantofilas (zeaxantina) (Gouveia & Castilho, 2012; Pandino, Courts, Lombardo, Mauromicale, & Williamson, 2010), el receptáculo, las brácteas internas, intermedias, externas y hojas representan una buena fuente de polifenoles (Fratianni, Tucci, Palma, Pepe, & Nazzaro, 2007), nutricionalmente los niveles de polifenoles bioactivos (ácidos cafeoilquínicos y flavonoides) en las brácteas internas y receptáculo representan un valor agregado para la alcachofa (Ceccarelli et al., 2010), los antioxidantes tiene múltiples acciones farmacológicas relacionadas con la composición fenólica, presentan actividad antitóxica, reduce el colesterol, anticancerígeno, antigenotóxico, hepatoprotector, expulsor de bilis, diurético, antiinflamatorio, anti-VIH, antifúngico y antibacteriano (Nermien et al., 2019).
En la búsqueda de información científica, no se ha encontrado evidencias de extracción de polifenoles con CO2 supercrítico de brácteas de alcachofa criolla con espinas, existen evidencias de extracción utilizando otros métodos. El método tradicional para la extracción de bioactivos es utilizando solventes tóxicos y volátiles como acetona, etanol, metanol y otros, los solventes solubilizan la esencia y permiten obtener un extracto impuro con sustancias que provocan contaminación ambiental. La extracción de bioactivos con fluidos supercríticos (CO2), es una
18
tecnología limpia, que extrae componentes selectivos en tiempos cortos, mejora el rendimiento, calidad del extracto y es utilizado en la extracción de sustancias termolábiles como los fenoles.
Existe la necesidad de cuantificar e identificar los compuestos polifenólicos a través de la cromatografía liquida de alta perfomance (HPLC), en brácteas de alcachofa criolla y en el futuro conocer la estructura y relacionar los posibles efectos biológicos con fines científicos y económicos.
Objetivo general
Evaluar el efecto de la presión, temperatura y concentración de co-solvente en la extracción de polifenoles de brácteas de alcachofa (Cynara scolymus L.) con CO2
supercrítico.
Objetivos específicos
Optimizar la presión, temperatura y concentración de co-solvente para la extracción de polifenoles totales de brácteas de alcachofa criolla (Cynara scolymus L.) utilizando la Metodología de superficie de Respuesta.
Determinar la relación existente entre polifenoles totales y capacidad antioxidante por los métodos DPPH y ABTS de brácteas de alcachofa criolla (Cynara scolymus L.).
Identificar los compuestos polifenólicos de brácteas de alcachofa criolla (Cynara scolymus L.) a través de cromatografía líquida de alta perfomance.
19 CAPÍTULO I MARCO TEÓRICO 1.1. Antecedentes
Týskiewicz, Konkol, & Rój (2018) menciona que la extracción de compuestos fenólicos con fluidos supercríticos ha sido estudiada durante las últimas dos décadas, los cuales se evidencian en publicaciones y artículos científicos. La extracción con fluidos supercríticos (EFS), por sus siglas en inglés, es un método efectivo para separar compuestos fenólicos, con un enfoque beneficioso para materiales de desecho de plantas y reducción de cargas Silva Ch. (2012) realizo la optimización de parámetros de extracción con CO2
supercrítico de fenoles de vaina de tara, a temperaturas de 35ºC a 70ºC, presiones de 450 bar a 550 bar y porcentaje de co-solvente de etanol de 5% a 10%, acondicionó las vainas de tara con NaOH al 0,75%, con un tamaño de partículas de 173 µm, en el procesamiento de datos utilizó la metodología de superficie de respuesta con dos puntos centrales. Los parámetros óptimos fueron: 550 bar, 70ºC y 10% de etanol en la cual presentó 3937 μg equivalente de ácido gálico (EAG)/g.
Farías-Campomanes, Rostagno, & Meireles (2013) evaluaron la viabilidad económica a gran escala en plantas supercríticas la obtención de fenoles totales de bagazo de uva. La extracción supercrítica se realizó con CO2 y co- solvente etanol al 10% (p/p) a 40°C, a las presiones de 20 y 35 MPa, los extractos obtenidos presentaron mayor contenido de fenoles en comparación a otras técnicas tradicionales. Mencionan que es viable económicamente la instalación de una planta supercrítica.
Azila y Aida (2013) utilizaron CO2 supercrítico para extraer compuestos aromáticos de granos de cacao para la formulación de un perfume natural.
Evaluaron la influencia de la presión y el tiempo en el rendimiento de extracción (5-metil-2-fenil-2-hexenal), ácido graso (ácido hexadecanoico) y compuestos alcaloides (cafeína) a 35 ± 2°C, el experimento se realizó con un diseño factorial multinivel. Ambos factores influyen significativamente; la presión
20
influye significativamente en la cantidad del compuesto aromático extraído. El extracto con mayor cantidad de compuesto aromático (24,5 mg/g de extracto) se obtuvo a 200 bar y 45 minutos.
Massias, Boisard, Baccaunaud, Leal Calderon, & Subra-Paternault (2015) utilizaron cascara de manzana variedad Golden delicious secas y molidas para extraer antioxidantes utilizando CO2 supercrítico a 25 MPa, 50°C y etanol 96%
en una proporción de 75:25 moles. Identificaron nueve compuestos fenólicos incluidos los derivados de quercetina y floridcina. La capacidad antioxidante se determinó por el método de actividad antirradical (ABTS), la identificación de polifenoles realizaron por separación cromatográfica HPLC y matriz de fotodiodos o espectrofotometría de masas.
De Andrade Lima, Charalampopoulos, & Chatzifragkou (2018) realizaron la optimización y modelado de extracción de carotenoides de cáscara de zanahoria con CO2 supercrítico, las variables evaluadas fueron temperatura, presión y concentración de co-solvente (etanol). En el modelo validado, las condiciones óptimas para el rendimiento en masa fueron: 58,5 °C, 306 bar y 14,3% de etanol; 59,0 °C, 349 bar y 15,5% de etanol para carotenoides con una recuperación de (86,1%). Las variables de extracción influyen directamente en la extracción de carotenoides, que permitió el modelado estadístico y cinético, y la evaluación de su potencial de escalabilidad y caracterización del extracto.
Escobedo-Flores, Chavez-Flores, Salmeron, Molina-Guerrero, & Perez-Vega (2018) optimizaron la extracción de polifenoles y su actividad antioxidante de avena (Avena sativa l.) con CO2 supercrítico, la investigación exploró los efectos de la presión y la temperatura, utilizaron como codisolvente etanol (80% v/v); utilizaron la metodología de superficie de respuesta, obteniendo rendimientos más altos a 38 MPa y 55 °C, los modelos cuadráticos se ajustaron y se predijo el contenido máximo de polifenoles de 1437,57 µg/g, encontraron correlaciones positivas entre polifenoles y capacidad antioxidante, especialmente con el método ORAC. Las presiones entre 30 a 40 MPa y
21
temperaturas entre 50 a 60 °C fueron las más eficientes para la extracción de polifenoles.
Kollia, Markaki, Zoumpoulakis, & Proestos (2017) Compararon extractos de diferentes partes (cabezas, brácteas y tallos) de Cynara cardunculus L. (cardo) y Cynara scolymus L. (alcachofa globo), obtenidos por ultrasonido (EAU) y extracción clásica (CE) fueron examinados y comparados por su contenido fenólico total (TPC) y la actividad antioxidante. Los resultados demostraron que el extracto de cabeza de la variedad cardo obtenido por (EAU) presentó los valores más altos de (TPC) 1,57 mg equivalentes de ácido gálico (EAG) g−1 peso fresco (FW), DPPH más alto actividad de captación de residuos (IC50;
0,91 mg ml−1) y la mayor capacidad de eliminación de radicales ABTS•+ (2,08 mg equivalentes de Trolox (TE) g−1 FW) en comparación con los otros extractos y concluye que la técnica por (EAU) es la más apropiada y efectiva para la extracción de compuestos antirradicales y fenólicos.
Zuorro, Maffei, & Lavecchia (2016) investigaron desechos de alcachofa (brácteas externas y tallos) como fuente de compuestos fenólicos y bioenergéticas, la extracción se realizó con etanol acuoso al 50% (v/v) como solvente respetuoso con el ambiente, evaluaron el efecto de la temperatura (T), tiempo de extracción (E) y relación líquido-sólido (R) en el rendimiento de la extracción fenólica, para optimizar utilizó la metodología de superficie de respuesta con diseño central compuesto. Los parámetros optimizados fueron 53,3°C; 110,4 min y una relación liquido-solido 3,3 ml/g, se recuperó más del 90% de los compuestos fenólicos 32,2 mg EAG/g peso seco (DW). Los tres factores principales fueron estadísticamente significativos. Los desechos presentaron un alto valor calorífico (HHV) y un bajo contenido de cenizas, después de la extracción fenólica, el (HHV) aumentó ligeramente y el contenido de cenizas disminuye. Los resultados indican que los desechos de alcachofa permiten la obtención de compuestos fenólicos y la producción de bioenergía renovable.
22
Abu-Reidah, Arraez-Roman, Segura-Carretero, & Fernandez-Gutierrez (2013) identificaron compuestos fenólicos de corazones de alcachofa (variedad Blanca de Tudela) utilizaron HPLC acoplado a DAD-ESI-QTOF-MS. Lograron caracterizar 61 compuestos fenólicos y otros compuestos polares, de los cuales 34 compuestos fenólicos con sus isómeros se reportaron por primera vez: 3 ácidos hidroxibenzoicos, 17 ácidos hidroxicinámicos, 4 lignanos, 7 flavonas, 2 flavonoles y 1 derivado de fenol. Se detectaron además 28 isómeros de compuestos fenólicos previamente descritos y concluyeron que la alcachofa en estudio podría considerarse como un alimento bioactivo funcional y fuente prometedora de antioxidantes de compuestos fenólicos.
Fratianni, Tucci, Palma, Pepe, & Nazzaro (2007) Analizaron los polifenoles totales en diferentes partes de alcachofa globo (Cynara cardunculus L. var.
Scolymus (L.) Fiori) en el receptáculo, brácteas internas, brácteas intermedias, brácteas externas y hojas de cinco cultivares provenientes de la región de Campania (Italia) (Cardoon, Aquara, Bianco di Pertosa, Violet de Provence, Tondo di Paestum y una accesión C3), los polifenoles totales se determinaron por Folin-Ciocalteu. Los resultados indican que el receptáculo, brácteas internas e intermedias son una buena fuente de polifenóles, las variedades Aquara y Tondo di Paestum presentaron mayor contenido en el receptáculo ambos 3,09 mM/g; en brácteas internas la variedad aquara 7,61 mM/g y la accesión C3 8,03 mM/g, en brácteas intermedias Aquara y C3 con 1,54 y 1,74 mM/g respectivamente y en brácteas externas Cardoon y la accesión C3; 0,81 y 1,79 mM/g.
Béjar C. (2017) evaluó el ácido caféico (AC) con (HPLC), la actividad antioxidante por el método DPPH y polifenoles totales por Folin Ciocalteu de brácteas secas de alcachofa (Cynara scolymus L.), fueron deshidratadas con tamaños de partícula (<50 μm y entre 50-350 μm), la extracción de polifenoles se realizó por maceración y soxhlet, siendo este último método el que presento mayor rendimiento ácido cafeíco, polifenoles totales y capacidad antioxidante.
23
Martínez (2016) en su investigación, optimizo la extracción de compuestos fenólicos de alcachofa, con solvente hidroalcohólico, a través de la metodología de superficie de respuesta. Las variables utilizadas fueron:
relación materia prima/solvente, solvente y tiempo. El extracto pre-purificado se aplicó como antioxidante en aceite crudo de soya y mediante HPLC-DAD identificó que el ácido clorogénico y ácido cafeíco son los componentes mayoritarios en el extracto de alcachofa.
1.2. Bases teóricas y conceptuales
1.2.1. Alcachofa (Cynara scolymus L.) a. Generalidades
Es un cultivo del Mediterráneo y del Noroeste de África, reconocida por su valor nutricional y propiedades terapéuticas debido a la presencia de componentes bioactivos: polifenoles, fibra dietaria, inulina, vitaminas y minerales (Gaafar, AlGaafar, A. A., & Salama, 2013). Las cabezas de menor tamaño son inadecuadas para el mercado y se pueden utilizar para la obtención de bioactivos como polifenoles (D’Antuono et al., 2018). Los cultivos en las regiones del Mediterráneo, representan el 85% de la producción mundial, en América del sur la producción se ha incrementado por ser un alimento saludable por los componentes nutritivos y fotoquímicos que posee, contiene proteínas, minerales, baja cantidad de lípidos, altos niveles de fenólicos (Fratianni et al., 2007), las propiedades nutricionales y farmacéuticas de las brácteas y corazón presentan altos niveles de polifenoles e inulina (Lattanzio et al. 2009) citado por (Gaafar, AlGaafar, A. A., & Salama, 2013), planta perenne, con aspecto de cardo, de flores comestibles, que salen del tallo principal y de los laterales, que se asemeja al cono de un pino, de color verde intenso, redondo algo alargado hacia el ápice, las brácteas se pliegan alrededor de una flor morado azulada. La base de cada bráctea y el centro carnoso es la porción comestible (López-Molina et al., 2005).
24 b. Variedades
En Italia, España y Francia existen más de 286 variedades cultivadas algunas de ellas llevan el nombre del lugar donde son cultivadas, pero aún existen genotipos sin identificar. Se diferencian por la forma, color, precocidad y tamaño. Las principales variedades son: Green Globe, Imperial star, Blanca de tudela, Catanese o Violetto di Sicilia, Romanesco, Spinoso Sardo, Violeta de Provenza, Camus de Bretagne, Calicó, Salambo y Tema (Martinez Garcia, 2014).
En el Perú las principales regiones donde se cultiva la alcachofa son:
Cajamarca, La Libertad, Ancash, Junín, Huancavelica, Lima, Ayacucho, Ica y Arequipa. Clasificadas en variedades con espina y sin espina. La alcachofa criolla se encuentra en las con espinas, apreciado por los fondos en conserva (Calderón et al., 2001) citado por (Martínez Tapia, 2016). Las variedades sin espinas, tienen brácteas externas redondeadas de color verde, corazones de sabor suave, sin fibra, las que destacan son Green Globe, Blanca de Tudela, Imperial star y Lorca (MINAG, 2008) mencionado (Martínez Tapia, 2016).
Figura 1. Alcachofa criolla (Cynara scolimus L.) con espinas
25 c. Composición química
La alcachofa en la parte comestible (inflorescencia) presenta la siguiente composición: agua 86,5 g, proteína 2,8 g, grasa 0,2 g, carbohidratos 9,9 g, cenizas 1,8 g, fibra 3,4 g, colesterol 0 g, calcio 51 mg, fósforo 69 mg, hierro 1,1 mg, sodio 30 mg, potasio 310 mg, magnesio 10 g, vitamina A 150 mg, vitamina C de 8 mg, vitamina B 0,07 mg, vitamina B2 0,04 mg y niacina 0,85 mg para cada porción de 100 g (Reolon-Costa, Grando, & Cravero, 2017), fibra dietética, fenoles, flavonoides e inulina (Ceccarelli et al., 2010).
El capítulo de alcachofa contiene de 80% a 85% de agua, 6.8% de carbohidratos y 2.9% de compuestos de nitrógeno, de bajo valor calórico y alto contenido de fibra. Fuente de algunos minerales como potasio, calcio y sodio, además de magnesio, fósforo, hierro, cobre y manganeso. Fuente de vitamina C, folatos y vitaminas del complejo B (biotina, niacina y piridoxina) (Moreiras et al., 2011) citado (Frutos et al., 2018).
La tabla 1, muestra el análisis químico proximal de brácteas de alcachofa criolla.
Tabla 1. Análisis químico proximal de brácteas de alcachofa criolla (Cynara scolymus)
Componentes Muestra
seca
Muestra fresca
Humedad (g/%) - 71,84
Cenizas (g/%) 4,82 1,36
Grasas (g/%) 1,57 0,44
Proteínas totales (g/%) 13,75 3,87
Fibra cruda (g/%) 34,06 9,59
Carbohidratos (g/%) - 12,90
Azúcares reductores directos (g/%
glucosa)
12,15 3,42 Azúcares reductores totales (g/%
glucosa)
13,25 3,70 Fuente: Cárdenas T. (2016)
26
d. Residuos del procesamiento de alcachofa
El procesamiento de alcachofas (Cynara scolymus L.), genera desechos que representa alrededor del 80 – 85% de la biomasa total de la planta (hojas, tallos, brácteas) que no son aptos para el consumo humano, los cuales pueden ser utilizados en la obtención de fenoles, inulina, aditivos alimentarios y nutraceuticos (Gaafar, AlGaafar, A. A., & Salama, 2013), (Zuorro et al., 2016). El 70% de la flor de alcachofa son desechos que no son aptas para la alimentación humana, estos desechos se utilizan para ensilaje (alimentación animal) de los cuales se obtiene inulina (López- Molina et al., 2005).
Los desechos que provienen del procesamiento de la alcachofa, es una fuente de bioactivos para la industria funcional, posee fibra dietética, baja cantidad de grasas, en productos de panadería mejora las propiedades funcionales (Ruiz-Cano et al., 2014), los tallos son más ricos en polifenoles que las brácteas y la concentración depende de la parte de la planta, genotipo, condiciones del proceso (Pandino et al., 2010).
1.2.2. Tecnología de los solventes verdes
La extracción verde de productos naturales, reduce o elimina la generación de sustancias peligrosas, disminuyen el consumo de energía, utiliza solventes alternativos y se obtienen extractos de calidad que garantizan seguridad. Se han identificado tres aspectos que permitirán la extracción verde: diseñar un proceso de extracción ecológica a nivel industrial y de laboratorio, consumo óptimo de materias primas, solventes alternativos y energía (Chemat, Vian, &
Cravotto, 2012).
La implementación del proceso de extracción verde consta de tres niveles: optimización de parámetros de extracción, materias primas, energía y solventes. La implementación comprende la innovación y
27
modificación de protocolos y tecnologías existentes: (i) mejoras con un diseño innovador y asegurar el cumplimiento de estrategias de optimización, (ii) uso de equipos, y (iii) alternativas a los solventes convencionales durante el diseño de procesos innovadores. La aplicación de técnicas modernas de extracción verde: extracción con fluido supercrítico (EFS), por ultrasonido (EAU), asistida por microondas (MAE). ), con líquidos presurizados (PLE), y a presión de agua caliente (PHWE), como alternativas a los métodos de extracción convencionales: soxhlet, percolación y maceración (Ameer, Shahbaz, &
Kwon, 2017)
La (EFS) es una tecnología verde, tiene características especiales que superan a las convencionales, la principal ventaja es el uso de solventes reconocidos como seguros (GRAS), menor tiempo de extracción, mayor eficiencia. La técnica es selectiva, no requiere limpieza adicional y la extracción se realiza con pequeñas cantidades de muestra, el extracto obtenido es aplicado al medioambiente, química, alimentación, agricultura, industrias farmacéuticas y nutracéuticas (Pimentel-Moral et al., 2019), tiene menor impacto al ambiente, los análitos obtenidos son concentrados, los residuos no son tóxicos y se reciclan fácilmente, el exceso se puede eliminar por despresurización (Velásquez Valderrama, 2008).
La tecnología de (EFS) es una buena opción para los extractos naturales, destinados para alimentación y productos farmacéuticos. El dióxido de carbono supercrítico es el fluido más común usado debido a su compatibilidad fisiológica, no toxico, no inflamable, bajo costo, parámetros críticos convenientes y respetuoso con la naturaleza ventajas significativas con la extracción tradicional soxhlet (Verma, Hartonen, & Riekkola, 2008).
Los métodos de extracción tradicional utilizan solventes orgánicos tóxicos, costosos, nocivos para la salud y el medioambiente, requieren
28
temperaturas altas, que degradan los componentes y forman impurezas. Actualmente se promueven investigaciones de extracción con tecnologías amigables con el medio ambiente, que no representen ningún riesgo para la salud y garanticen un producto de buena calidad entre estas tecnologías esta la extracción utilizando fluidos supercríticos, que utiliza como disolvente alternativo el dióxido de carbono supercrítico, tecnología de impacto ambiental nulo, limpio en términos ecológicos que responden a la demanda de productos naturales (Velásquez Valderrama, 2008).
1.2.3. Extracción (sólido-líquido) o Lixiviación
Es una operación con transferencia de masa en donde los solutos de la matriz sólida, migran al disolvente en contacto. La transferencia de masa mejora con los cambios en los gradientes de concentración, coeficientes de difusión o capa límite (Ignat, Volf, & Popa, 2011), el mecanismo de extracción consiste en que el disolvente se transfiere a la superficie sólida, cubre y envuelve a la matriz y penetra por difusión, el soluto se disuelve hasta una concentración limitada por la naturaleza del sólido y el tratamiento previo al que fue sometido, la mezcla de soluto y solvente forma una solución muy diluida; por lo tanto, el equilibrio verdadero nunca se alcanza en ninguna aplicación práctica.
La solución que contiene el soluto se difunde a la superficie mediante una difusión efectiva (Takeuchi & Pereira, 2009). El rendimiento de extracción está influenciada por la velocidad de transferencia de masa, los parámetros críticos que influyen son la temperatura, relación disolvente/solido, tiempo, naturaleza del disolvente. Las técnicas de extracción convencionales para fenoles utilizan diversos disolventes y sus mezclas (Dueñas, Alcivar, Sacon, & Villanueva, 2016).
Para extraer la mayor cantidad de compuestos bioactivos, requieren de métodos de extracción efectivos: maceración, extracción soxhlet, destilación, por ultrasonido, líquidos a alta presión, microondas y
29
extracción con fluidos supercríticos, estos procesos extraen el componente a través de la lixiviación o extracción sólido-líquido.
(Jurinjak Tušek et al., 2016)
1.2.4. Extracción con fluidos supercríticos (EFS) a. Fundamentos
La (EFS) tiene ventajas sobre los métodos de extracción tradicional, presentan buenas propiedades de transporte, se difunden fácilmente a través de materiales sólidos, ofreciendo altas tasas de extracción. El CO2 no es explosivo, no es tóxico y de bajo costo, la temperatura crítica es baja que evita la degradación de sustancias termolábiles, el solvente puede ser completamente eliminado (Dias et al., 2019), es un método rápido, eficiente y "limpio" para la extracción de productos naturales de matrices de biomasa, como frutas y verduras, la extracción es similar a los solventes convencionales. El CO2 en estado supercrítico tiene propiedades de difusión, viscosidad y tensión superficial similares a los gases, así como densidades y potencial de solvatación similares a los líquidos, al combinar estas propiedades es ideal para extraer compuestos en un tiempo corto con rendimientos más altos, en comparación con los solventes líquidos convencionales, los extractos obtenidos son de alta pureza, sin residuos tóxicos, sin degradación de componentes (De Andrade Lima, Charalampopoulos, &
Chatzifragkou, 2018), los fluidos supercríticos extraen sustancias a temperatura y presión por encima de su punto crítico, que se difunden fácilmente en un sólido como un gas, disuelven materiales como un líquido y cambian de densidad con pequeños cambios de temperatura y presión que los convierten en un sustituto de solventes orgánicos en la extracción (Velasco, Villada, & Carrera, 2007).
El dióxido de carbono supercrítico (CO2 sc) es un disolvente útil para la extracción de productos naturales, inerte, no tóxico y respetuoso
30
con el medio ambiente. La temperatura y presión crítica son 304,2
°K y 7,4 MPa respectivamente, suficientemente bajas para permitir la extracción a bajas temperaturas y presiones, que disminuyen la desnaturalización térmica del extracto. Debido a su alta difusividad y baja densidad, viscosidad y tensión superficial en comparación con el CO2 líquido. La densidad de (CO2 sc) cambia con la temperatura y presión, que altera la solubilidad de los compuestos.
Se disuelve en compuestos lipofílicos por ser un solvente no polar, la adición de un arrastrador polar, como metanol, etanol o agua, permiten la extracción de componentes polares que son difíciles de disolver en (CO2 sc) puro (Sato, Fukuda, Nihei, & Itoh, 2017).
La (EFS), está fundamentada en la utilización de un fluido en condiciones supercríticas, para extraer compuestos puros, de baja volatilidad y termolábiles. Se promueve el uso de fluidos supercríticos por existir limitaciones legales en el uso de disolventes convencionales para destinos alimenticios y farmacéuticos. Las propiedades fisicoquímicas del (CO2 sc) facilitan la transferencia de masa y es respetuoso con el medio ambiente (Díaz-Reinoso, Moure, Domínguez, & Parajó, 2006)
La lixiviación, es una operación multicomponente que implica la transferencia no estacionaria de solutos de un sólido a un fluido.
Los materiales vegetales contienen diferentes solutos que pueden extraerse simultáneamente a diferentes ritmos; dependiendo de su ubicación (superficie exterior, poros, vacuolas, etc.) y los coeficientes de partición. La extracción utilizando (sc-CO2) implica:
(i) transporte de CO2 hacia la superficie del sólido, (ii) ingreso y difusión del CO2, (iii) solubilización de los componentes, (iv) movimiento del soluto desde la superficie del solido al exterior (transferencia de masa externa). Las tasas de extracción de solutos a partir de matrices vegetales dependen de la transferencia de
31
masa externa, coeficiente de difusión, solubilidad y unión del soluto al sólido (Díaz-Reinoso et al., 2006).
Las condiciones óptimas de (EFS) están influenciadas, por la temperatura y presión de operación, aunque otros parámetros como el tamaño de partícula de la muestra, el caudal de disolvente, tiempo de extracción y el modo de operación tienen algunos efectos. La temperatura y la presión cambian la densidad y la viscosidad del disolvente. Al mantener la temperatura de extracción y variar la presión, o viceversa, se logra diversas densidades de extracción de solvente (CO2) y se pueden extraer varios componentes, incluyendo grasa, compuestos aromáticos y alcaloides (Azila & Aida (2013).
El uso de CO2 en la (EFS) es una reutilización de este subproducto industrial, una de las ventajas es que es un gas en condiciones ambientales, después del proceso de extracción, cuando disminuye la presión, se evapora automáticamente dejando un extracto libre de solventes (Mendiola, Herrero, Castro-Puyana, & Ibáñez, 2013).
b. Propiedades físicas
En la tabla 2, se presenta las propiedades críticas de fluidos supercríticos más utilizados.
Tabla 2. Propiedades criticas de fluidos supercríticos (reproducido con permiso de (Herrero et al. 2006)
Solvente
Propiedades criticas Temperatura
(°C)
Presión (atm)
Densidad ρSCF (g/mL)
Solubilidad (cal-1/2 cm-3/2) Dióxido de
carbono
31,2 72,9 0,470 7,5
Etano 32,4 48,2 0,200 5,8
Eteno 10,1 50,5 0,200 5,8
Metanol -34,4 79,9 0,272 8,9
Óxido nitroso 36,7 71,7 0,460 7,2
n-Butano -139,9 36,0 0,221 5,2
n-pentano -76,5 33,3 0,237 5,1
Agua 101.1 217,6 0,322 13,5
Fuente: Pourmortazavi, Saghafi, Ehsani, & Yousefi (2018)
32
La tabla 3, presenta las propiedades físicas de un gas, un líquido y un fluido supercrítico
Tabla 3. Densidad, difusividad y viscosidad de un gas, un líquido y un fluido supercrítico.
Estado Densidad
(g/cm3)
Difusividad (cm2/s)
Viscosidad (g/cm-s) Gas
P =1atm, T= 15-30°C
(0,6 – 2,0)x10-3 0,1 – 0,4 (0,6 – 2,0) x10-4 Liquido
P =1atm, T= 15-30°C
0,6 – 1,6 (0,2 – 2,0)x10-5 (0,2- 3,0) x10-2 Fluido supercrítico
P=Pc, T=Tc 0,2 – 0,5 0,7 x 10-3 (1 – 3) x10-4 P=4Pc, T=Tc 0,4 – 0,9 0,2 x 10-3 (3 – 9) x10-4 Fuente: Mendiola, Herrero, Castro-Puyana, & Ibáñez (2013) y
Brunner (2005)
c. Curvas de extracción con fluidos supercríticos
Según (Da Silva, Rocha-Santos, & Duarte, 2016) la (SFE) tiene tres periodos controlados por la transferencia de masa (TM):
Primer período: velocidad de extracción constante (CER), la superficie del sólido está cubierta con soluto, predomina la (TM) por convección.
Segundo período: caída de la velocidad de extracción (FER), donde el soluto de la superficie disminuye y comienza la difusión de la parte interna combinado con convección.
Tercer periodo: baja tasa de extracción (LER) o controlado por difusión (DC), donde el soluto de la superficie desaparece y la (TM) es por difusión dentro de las partículas.
33
Figura 2. Períodos de extracción con fluidos supercríticos Fuente: Da Silva, Rocha-Santos, & Duarte (2016) d. Parámetros que afectan la extracción
La elección del solvente supercrítico es el más influyente en la extracción, pero existen otros parámetros que afectan significativamente la resistencia del solvente y la transferencia de masa durante la extracción (Mendiola et al., 2013)
- Materia prima
El estado físico de las muestras (sólidas o líquidas) tiene influencia en la extracción, el tamaño de partícula y la porosidad influyen en la transferencia de masa al aumentar el contacto superficial, la humedad puede dificultar el proceso de extracción, el uso de muestras secas permite mejores resultados, tamaños de muestra muy pequeños no son adecuados por la formación de canales preferenciales dentro de la celda de extracción (Mendiola et al., 2013), tamaños de partícula en el rango de 500 μm -1000 μm recomienda (Fornari et al., 2012).
- Solubilidad
Los parámetros más influyentes en la solubilidad de una sustancia son la presión y la temperatura de extracción. Se
34
obtiene mayor densidad del fluido supercrítico cuando la presión aumenta, que mejora la solubilidad de los componentes. El aumento en la temperatura disminuye la densidad (para una presión dada), promueve la transferencia de solutos de la muestra al fluido supercrítico al incrementarse la presión de vapor. La elección de la temperatura y presión en la extracción es de acuerdo al proceso y el compuesto objetivo (Mendiola et al., 2013) y (Pourmortazavi et al., 2018)
- Polaridad y uso de modificadores
El CO2 supercrítico es el más utilizado, pero su baja polaridad limita la extracción de compuestos polares, para mejorar la extracción se utilizan modificadores que son disolventes orgánicos como el metanol, etanol o agua en concentraciones inferiores al 10% relacionadas con el CO2 aumentan la solubilidad de los componentes con mayor polaridad (Mendiola et al., 2013), se disuelve en compuestos lipofílicos por ser un solvente no polar, la adición de un arrastrador polar, permiten la extracción de componentes polares que son difíciles de disolver (Sato et al., 2017), aumentan la solvatación y expande el rango de extracción para incluir analitos polares, reducen la interacción analito-matriz mejorando la extracción (Herrero, Mendiola, Cifuentes, & Ibáñez, 2010), presenta volatilidad intermedia que aumenta la solubilidad del soluto en la fase supercrítica, lográndose separaciones efectivas, forman puentes de hidrogeno o fuertes interacciones dipolo-dipolo (Espinosa, 2001).
- Relación solvente/alimentación
Es importante estudiar el efecto de la relación disolvente/alimentación o la influencia del caudal de CO2. El caudal debe ser lo suficientemente alto para maximizar el
35
rendimiento de extracción, pero también lo suficientemente bajo como para permitir un buen contacto con la muestra a fin de minimizar la cantidad de CO2, que influyen en costos operativos y tiempo de contacto (Mendiola et al., 2013).
1.2.5. Antioxidantes
Son sustancias que inhiben la oxidación, reconocidos como "carroñeros gratuitos de radicales", porque forman especies reactivas menores a través de radicales (Neha, Haider, Pathak, & Yar, 2019), retrasan la oxidación de lípidos u otras moléculas y la propagación de reacciones oxidantes en cadena (Zheng & Wang, 2001), inhibe o retarda la oxidación de sustratos inclusive en concentraciones menores (Matkowski, 2008).
Los antioxidantes se clasifican por su origen en exógenos y endógenos (Neha et al., 2019), en sistemas enzimáticos y no enzimáticos, preventivos o de reparación, endógenos y exógenos, primarios y secundarios, hidrosolubles y liposolubles, natural o sintético (Pisoschi &
Pop, 2015). Los antioxidantes primarios son rompedores de cadena capaces de eliminar radicales mediante la donación de hidrógeno, los secundarios son extintores de oxígeno, descomponedores de peróxidos, quelantes de metales, inhibidores de enzimas oxidativas o radiación UV absorbentes (Pisoschi & Pop, 2015).
Los tocoferoles, ácido ascórbico, carotenoides, flavonoides, aminoácidos, fosfolípidos y esteroles son antioxidantes naturales en los alimentos que inhiben la oxidación al eliminar radicales libres, quelar metales pro-oxidativos, apagar el oxígeno singlete y fotosensibilizadores e inactivación de la lipoxigenasa (Choe & Min, 2009), los compuestos fenólicos naturales presentes en los vegetales son responsables para la actividad antioxidante, la cual ha sido confirmada en numerosos estudios in vivo e in vitro, tienen además otras actividades biológicas importantes (Amarowicz & Pegg, 2019).
36
a. Química de radicales libres y antioxidantes
La química de los radicales libres y los antioxidantes se basa en un equilibrio entre ambos. Los radicales libres son compuestos reactivos que capturan electrones de forma estable (Carocho, Morales, &
Ferreira, 2018), en condiciones patológicas la sobreproducción de radicales libres es por la presencia de compuestos pro-oxidantes y/u otros factores de riesgo, que originan el estrés oxidativo que tiene tres pasos; la iniciación (formación de radicales), la propagación (reacción con otras moléculas), y la terminación (cuando se transforman en otro producto) (Ferreira, Barros, & Abreu, 2009).
Los radicales reactivos principales son: de oxígeno (ROS), de nitrógeno (RNS) y de azufre (RSS), el incremento de la actividad oxidativa, produce de manera exógena y endógena radicales reactivos superóxido (O2-), hidroxilo (OH-), óxido nitroso (NO), alquiloxi (RO), (H2O2) y oxígeno atómico (Carocho et al., 2018).
Las ROS y RNS, suministran energía, la desintoxicación, la señalización química y la función inmune, se producen continuamente en el organismo y son controlados por enzimas endógenas (superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa, catalasa), cuando hay una sobreproducción o exposición a sustancias oxidantes externas o falla en los mecanismos de defensa, ocurren daños biomoleculares (ADN, lípidos, proteínas) que están asociados con el riesgo de contraer enfermedades crónicas diversas (Aruoma, 1998) citado (Dimitrios, 2006).
b. Antioxidantes naturales
Los antioxidantes naturales de origen vegetal pueden ser la perspectiva de la salud humana, en términos de promover la salud y el bienestar (Amarowicz & Pegg, 2019), cada vez es mayor la importancia a los compuestos antioxidantes naturales que se encuentran en plantas especialmente los compuestos fenólicos
37
(Olszowy, 2019), provienen de frutas y otros vegetales, conocidas como antioxidantes exógenos, que neutralizan especies radicalarias (Avello & Suwalsky, 2006), aumentan la resistencia a los daños oxidativos y tienen un impacto sustancial en la salud humana (Dimitrios, 2006), los antioxidantes naturales se clasifican como compuestos fenólicos como flavonoides y ácido fenólico, vitaminas y compuestos volátiles que se encuentran en diferentes frutas, plantas, hierbas y especias (Ahmad, Gokulakrishnan, Giriprasad, & Yatoo, 2015), en las plantas, los compuestos polifenólicos populares contienen dos o más grupos hidroxilos en su estructura (Olszowy, 2019).
c. Métodos para medir la actividad antioxidante
La actividad antioxidante es la capacidad de proteger un sistema biológico contra el efecto dañino de procesos o reacciones que causan oxidación excesiva, involucrando especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (Arnao, 2001), la principal característica que presentan es la capacidad de atrapar y estabilizar radicales libres (Prakash, 2001) citado por (Ningsih, Zulaikhah, Hidayat, & Kuswandi, 2016), en los fenoles, las propiedades redox, tienen acciones importantes en la absorción y neutralización de radicales libres, extinción del oxígeno singlete y triplete, o en la descomposición de peróxidos (Panovska, Kulevanova, & Stefova, 2005).
Los métodos para medir la actividad antioxidante se dividen en:
ensayos que transfieren hidrógeno (HAT); a través del cual logran extinguir los radicales libres y ensayos que transfieren electrones (ET) que reducen compuestos que podrían ser metales, carbonilos y radicales (Plaza et al., 2014). La tabla 4, muestra algunos ensayos de actividad antioxidante in vitro (Huang, Boxin, & Prior, 2005).
38
Tabla 4. Ensayos de capacidad antioxidante in vitro Ensayos
Ensayos (HAT)
ORAC (capacidad de absorbancia de radicales de oxígeno)
TRAP (parámetro antioxidante de captura de radicales totales)
Ensayo de blanqueo de crocina
IOU (inhibición del consumo de oxígeno) inhibición de la oxidación (linoleico, LDL) Ensayos (ET)
ABTS (capacidad antioxidante equivalente de Trolox)
FRAP (reductor de iones férricos
DPPH (ensayo radical 2,2-difenil-1- picryhidrazilo)
Otros ensayos
TOSC (eliminación de oxidantes) Briggs-Rauscher
Quimioluminiscencia Electroquimioluminiscencia Fuente: Huang, Boxin, & Prior (2005) p 1842
Los métodos para medir la actividad antioxidante son los ensayos (ORAC), (ABTS), (DPPH), (FRAP), reductor de voltametría cíclica (CV), capacidad reductora de Folin-Ciocalteu (FC), capacidad antioxidante reductora cúprica (CUPRAC) y captura de radicales totales (TRAP) (Plaza et al., 2014), los ensayos (DPPH) y (ABTS) utilizan cromógenos para simular los radicales reactivos, y son utilizados por su sensibilidad y de excelente estabilidad (Arnao, 2001), el método DPPH es rápido, simple y económico, mientras que el ensayo de decoloración ABTS se aplica en antioxidantes hidrófilos y lipófilos (Alam, Bristi, & Rafiquzzaman, 2013).
1.2.6. Compuestos fenólicos
Son metabolitos secundarios conocidos como fitofenoles, provienen de plantas, tienen características benéficas como antioxidantes potenciales que rompen la cadena de radicales libres donando un átomo de hidrogeno (Ruales, Rojas González, & Cardona Alzate, 2017), se encuentran en alimentos, como frutas, verduras, legumbres, vino tinto y té verde. Existen aproximadamente más de 8000 compuestos
39
polifenólicos que han sido identificados y caracterizados en diferentes especies de plantas, por sus beneficios en la salud, que incluyen actividades antiinflamatorias y antioxidantes y prevención de enfermedades cardiovasculares (Deng, Yang, Capanoglu, Cao, & Xiao, 2018), los fenoles son sintetizados en el desarrollo fisiológico de las plantas en respuesta al estrés, que incluyen fenoles simples, ácidos fenólicos (ácido benzoico, acido cinámico), derivados cumarinas, flavonoides, estilbenos, hidrolizables y taninos condensados, lignanos y ligninas (Naczk & Shahidi, 2004).
Se utilizan métodos químicos para la determinación del contenido total de fenólicos, los análisis espectrométricos y cromatográficos, se emplean para la identificación y cuantificación de los compuestos individuales presentes (Naczk & Shahidi, 2004).
a. Métodos o procedimientos de extracción de fenoles
La diversidad de la composición de fuentes naturales de polifenoles, la estructura y las propiedades fisicoquímicas de estos compuestos conducen a la no existencia de un protocolo de extracción universal, los procesos de extracción deben ser diseñados y optimizados para cada fuente fenólica. La co-extracción de compuestos indeseables como azúcares, grasas, terpenos o pigmentos debe evitarse y debe tenerse en cuenta durante la optimización del proceso (E. M. Silva, Rogez, & Larondelle, 2007).
Los compuestos fenólicos de vegetales se pueden extraer por técnicas de extracción convencional y no convencional. La mayoría se fundamentan en el poder de extracción de diferentes solventes, aplicación de calor y/o mezcla. Entre las técnicas convencionales tenemos: la extracción Soxhlet, maceración y la hidrodestilación (Azmir et al., 2013), estas técnicas presentan algunas limitaciones, requieren tiempos de extracción largos, solventes costosos de alta pureza, baja selectividad en la extracción y degradación térmica de
40
compuestos (Luque de Castro & García-Ayuso, 1998), entre los métodos de extracción de polifenoles no tradicionales tenemos: la extracción asistida por: ultrasonido, enzimas y microondas, extracción con pulsos eléctricos, extracción con fluidos supercrítico y extracción con líquido presurizado, algunas de ellas son consideradas "ecológicas". Siendo las más prometedora la extracción por ultrasonido, las técnicas presentan el uso de solventes seguros, reducción de la degradación, bajas temperaturas, tiempos cortos, extracción selectiva, eficiencia energética y otros (Azmir et al., 2013).
El rendimiento de extracción depende de la elección de solvente, polarida
