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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
ESCUELA DE POSGRADO
UNIDAD DE POSGRADO DE LA FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
TESIS
PRESENTADO POR
Enrique Pablo QUISPE QUISPE
PARA OPTAR EL GRADO ACADEMICO DE:
MAESTRO EN TECNOLOGIA Y GESTION DE CALIDAD DE ALIMENTOS
HUANCAYO – PERÚ 2022
IDENTIFICACIÓN DE CONTAMINANTES MICROBIOLÓGICOS EN PRODUCTOS CÁRNICOS PROCEDENTES DE MERCADOS DE
ABASTOS
iii
iv ASESOR
Dr. Emilio Fredy Yábar Villanueva DNI 20051296
ORCID. 0000-0001-6922-0771
COASESOR
Dr. Eloy Aníbal GONZALES GUSTAVSON DNI 41630020
ORCID: 0000-0001-7328-2983
v DEDICATORIA
A mi hija S. Qillary y retoñito en camino. Motivo de superación y batalla continua por el conocimiento e investigación.
vi AGRADECIMIENTO
Proyecto “Foodborne diseases and public health governance: comparing food safety, consumer preferences and governance mechanisms in the supply of meat to urban food markets (GICCAP)”
vii INDICE GENERAL
Dedicatoria ... v
Agradecimiento ... vi
INDICE GENERAL ... vii
INDICE DE TABLAS ... ix
INDICE DE FIGURAS ... x
RESUMEN ... xii
ABSTRACT ... xiii
INTRODUCCION ... 14
CAPITULO I Marco Teórico 1.1 Antecedentes ... 16
1.2. Bases Teóricas ... 17
1.2.1. Normativas En Inocuidad y Calidad. ... 18
1.2.3. Salmonella spp ... 19
1.2.4. Escherichia coli O157:H7 ... 21
1.2.5. Campylobacter spp. ... 22
1.2.2. Principales Patógenos y Antecedentes Microbiológicos. ... 24
1.3. Definición De Términos Básicos ... 24
1.4. Hipótesis ... 26
1.4.1. Hipótesis General... 26
1.4.2. Hipótesis Especifica ... 26
1.5. Operacionalización de las variables ... 27
CAPÍTULO II Diseño Metodológico 2.1. Tipo y Nivel De Investigación. ... 28
2.2. Método. ... 28
viii
2.3. Diseño ... 28
2.4. Población, Muestra y Unidad De Muestra. ... 29
2.4.1 Población ... 29
2.4.2 Muestra y unidad de muestra. ... 29
2.4.3 Técnica De Muestreo ... 30
2.5. Técnicas e Instrumentos De Recopilación De Datos ... 30
2.5.1. Consideraciones Para La Toma De Muestra. ... 30
2.5.2. Para Aislar Y Cuantificar Aerobios Mesófilos. ... 30
2.5.3. Para Aislar y Cuantificar Salmonella spp. ... 31
2.5.4. Para Aislar y Cuantificar Campylobacter spp. ... 32
2.5.5. Para Aislar y Cuantificar Escherichia coli O157:H7 ... 33
2.5.6. Técnica Molecular ... 34
2.5.7. Purificación y Extracción De La Muestra ... 34
2.5.8. Amplificación Del ADN ... 35
2.6. Técnica De Procesamiento De Datos... 35
CAPÍTULO III Análisis Y Discusiones De Resultados 3.1. Resultados mesófilos aerobios en carnes de pollos y cerdos. ... 36
3.2. Resultados Salmonella spp. En carnes de pollos y cerdos. ... 41
3.3. Resultados Campylobacter spp. ... 52
3.4. Resultados Escherichia coli O157:H7 ... 53
Conclusiones ... 55
Recomendaciones ... 57
Referencias bibliográficas ... 58
ANEXOS ... 63
ix INDICE DE TABLAS
Tabla 1.Identificación de contaminantes microbiológicos en productos cárnicos
procedentes de mercados de abastos ... 27
Tabla 2.Presentación de la toma de muestra original. ... 29
Tabla 3. Diferencia microbiológica entre carnes de pollo P=0.009721 por mercados y resultados al test posthoc de Kruskal Wallis. ... 37
Tabla 4.Diferencia entre carnes de cerdos p=0.01629 según mercados y resultados al test poshoc de Kruskal Wallis. ... 39
Tabla 5. Presencia de mesófilos aerobios dada en porcentajes según cantidad de puestos censados. La aptitud se interpreta según normativa. ... 41
Tabla 6. Resultados cuantitativos y cualitativos, para determinar la condición de las carnes de pollos. ... 42
Tabla 7. Resumen por grupos para Salmonella spp. dada en porcentajes, métodos de cuantificación y cantidad de puestos censados. La aptitud se interpreta según normativa ... 43
Tabla 8. Combinación entre diluciones y resultados cualitativos para determinar la condición de las carnes de cerdos. ... 44
Tabla 9. Diferencia entre las carnes de pollo p= 0.0002323 por mercados y resultados al test posthoc de Kruskal Wallis. ... 45
Tabla 10.Diferencia entre carnes de cerdo p = 0.003372 por mercados y resultados posthoc al test de Kruskal-Wallis ... 46
Tabla 11.Resultados de cuantificaciones NMP/g y CG (qPCR) para Salmonella spp. ... 52
Tabla 12.Protocolo General Para la Extracción de ADN Bacteriano ... 72
Tabla 13.Sondas y cebadores para qPCR ... 77
Tabla 14.Parámetros qPCR ... 78
x INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Diferencias de medianas entre carnes de pollo y porcinos de los
diferentes mercados. ... 40
Figura 2. Box plot comparativo entre carnes de cerdo y pollo observando las medianas de Salmonella spp. por mercados. ... 47
Figura 3.Valoración en color monocromático de las carnes de pollo entre los mesófilos aerobios y Salmonella spp y contrastación a la RM 591- 2008/MINSA. ... 49
Figura 4.Valoración en color monocromático de las carnes de cerdo entre los mesófilos aerobios y Salmonella spp y contrastación a la RM 591- 2008/MINSA. ... 50
Figura 5.Estructuración de Proceso Salmonella spp. y mesófilos aerobio. ... 64
Figura 6. Reacción Salmonella spp a diferentes medios y enumeración según ISO ... 65
Figura 7.Agar R&F Salmonella. Foto “A” parecido, Foto “B” Salmonella positivo. ... 65
Figura 8. Comportamiento de Salmonella spp en el agar R&F Salmonella y XLD y sus resultados bioquímicos positivos. ... 66
Figura 9.Controles Positivos de Campylobacter spp y una Muestra Visto Por Estereoscopio. ... 66
Figura 10.Protocolo Campylobacter spp. ... 67
Figura 11.Muestras H140 Positivo a Campylobacter spp. con aceite de inmersión y a 100x ... 68
Figura 12.Agar CT-SMAC (colonias beige) y Agar R&F E.coli O157:H7 ... 68
Figura 13.Protocolo Escherichia coli O157:H7 ... 69
Figura 14.Resultados Prueba Indol y Latex ... 70
Figura 15.Contabilización de Mesófilos aerobios según formula. ... 71
Figura 16.Reporte en PDF del Termómetro Durante el Viaje Huaral – IVITA- UNMSM ... 78
Figura 17.Aplicación Para Celular Utilizado. ... 79
xi Figura 18.Principales pasos para realizar la prueba de hipótesis con 70 muestras
de carnes de pollo e identificar diferencia entre grupos con en R
commander. ... 80
xii RESUMEN
La necesidad por el consumo de proteínas de origen animal cada vez más se incrementa conforme al crecimiento demográfico. Para adquirirlos, los mercados informales a diario son visitados por ser más económicos a pesar de la baja calidad que ofrecen en perjuicio de la salud. El presente estudio tuvo como objetivo de aislar y cuantificar mesófilos aerobios, Salmonella spp, E.coli O157:H7 y Campylobacter spp. presentes en carnes de pollo, porcino y vacuno provenientes de principales mercados de abasto de Tumbes, Junín y Lima. Para ello, se utilizó los ISOs 4833-1:2013, 6579-1:2017, 6579-2:2012, 10272-2:2017 y protocolo para E.coli O157:H7. Así como, pruebas moleculares para confirmar la detección de dicho patógeno cuando fuese necesario y realizar comparaciones con los métodos tradicionales. Los resultados para mesófilos muestran que el 55%(N=38) de pollos y el 46%(N=18) de porcinos superaron los 107 UFC/g; mientras que, para Salmonella, el 80% (N=56) de pollos y el 34%(N=14) fueron positivas entre 2.68 a 1417 NMP/g. Para Campylobacter en carnes de pollo, solo uno de 22 muestras fue positivo, aunque luego sería negativa; no encontrándose Escherichia coli O157:H7 en carnes de res al menos para la región de Junín. A la prueba de Kruskal Wallis y posthoc, se encontraron diferencias entre mercados, siendo el mercado modelo de Huancayo la menos afectada respecto al mercado modelo de Tumbes: mesófilos aerobios (p=0.009721), y Salmonella (p= 0.0002323). Se concluye que todos los mercados presentan deficiencias sanitarias, a las que posiblemente las carnes provinieron de mataderos clandestinos, falta de control sanitario y desconocimiento de la normativa.
Palabras clave: mercados informales, seguridad alimentaria microbiológica, principales patógenos, normativas.
xiii ABSTRACT
The need for the consumption of proteins of animal origin increases more and more according to demographic growth. To acquire them, informal markets are visited daily because they are cheaper despite the low quality they offer to the detriment of health. The objective of this study was to isolate and quantify aerobic mesophiles, Salmonella spp, E.coli O157:H7 and Campylobacter spp. present in chicken, pork and beef from the main supply markets of Tumbes, Junín and Lima.
For this, ISOs 4833-1:2013, 6579-1:2017, 6579-2:2012, 10272-2:2017 and protocol for E.coli O157:H7 were used. As well as molecular tests to confirm the detection of said pathogen when necessary and make comparisons with traditional methods.
The results for mesophiles show that 55%(N=38) of chickens and 46%(N=18) of pigs exceeded 107 CFU/g; while for Salmonella, 80% (N=56) of chickens and 34%
(N=14) were positive between 2.68 to 1417 MPN/g. For Campylobacter in chicken meat, only one of 22 samples was positive, although it would later be negative;
Escherichia coli O157:H7 was not found in beef, at least for the Junín region. The Kruskal Wallis and posthoc tests found differences between markets, with the Huancayo model market being the least affected compared to the Tumbes model market: aerobic mesophiles (p=0.009721), and Salmonella (p= 0.0002323). It is concluded that all the markets present sanitary deficiencies, to which the meat possibly came from clandestine slaughterhouses, lack of sanitary control and ignorance of the regulations.
Keywords: informal markets, microbiological food safety, main pathogens, regulations.
14 INTRODUCCION
Las infecciones diarreicas a falta de una buena vigilancia alimentaria en el mundo, ocupan los 10 primeros lugares como problema de salud pública y afectan con mayor prevalencia a los países de bajos recursos económicos. Nuestro país inmerso también en estos resultados es parte del problema, que a pesar del tiempo de su normalización aún está en proceso de implementación por sus diversos gobiernos locales de turno. Uno de los principales problemas en nuestras regiones, es el descuido del control y vigilancia de los alimentos sin conseguir resultados satisfactorios para garantizar el consumo de productos de buena calidad. La poca costumbre de decomisar carnes contaminadas sin saber con qué microrganismo se enfrenta en el comercio informal y el no publicar a la comunidad científica sobre lo hallado; ha hecho que la venta de carnes sea vistas como un negocio y no como problema de salud pública.
Un alimento cárnico puesto en cualquier mercado de abasto, técnicamente son aptos para el consumo humano y es considerado como el principal acceso de atención primaria como base a una salud de calidad y de cobertura sanitaria universal. Su condición organoléptica aceptable, garantiza el desarrollo saludable del ser humano debido a su alto valor nutritivo, fortaleciendo su sistema inmunológico y evitando enfermedades digestivas en niños, ancianos e inmunocomprometidos. La aceptabilidad de estos productos, muchas veces son vulneradas por un comercio poco vigilado y posible inoperancia de las autoridades que las controlan. Periódicamente la fiscalía en prevención del delito de cada provincia, incauta carnes en mal estado y de dudosa procedencia teniendo como destino final la incineración o destrucción sin haber sido evaluado la condición microbiológica para su registro y consideraciones sanitarias futuras.
La Salmonella spp, Campylobacter spp, y Escherichia coli O157:H7 son patógenos con tropismo gastrointestinal que al menos el primero es clásico y los siguientes son agentes emergentes. Para aislar estos microrganismos, existen métodos tradicionales y moleculares que comúnmente son utilizados en función a la especificidad microbiana. Lo más observado, es aislar mesófilos aerobios debido al costo asequible, mientras para las patógenas específicas, casi siempre son obviadas por considerarse caras, debido al tiempo que se requiere para conseguir insumos, costo por cuantificación según ISO, personal capacitado y costo que significa adquirirlo. Sin embargo, es posible conjeturar al menos la existencia de
15 Salmonella spp. con cuantificaciones en placas de mesófilos aerobios como indicador microbiológico en un menor tiempo.
Nuestro país, presenta una limitada evaluación de patógenos en las carnes de mayor consumo expendidas en los principales mercados de abasto informales, por lo tanto, el desconocimiento de la existencia de microrganismos para una amplia comunidad vulnerable desfavorecida. Incluso, se cree que algunos mercados presentan mayor vulnerabilidad microbiana respecto a otro, la que en la actualidad aun no es clara debido a estudios cualitativos y la poca difusión científica de lo hallado. Tomando estas consideraciones, el presente estudio plantea como objetivo principal: identificar y cuantificar los indicadores de contaminación fecal- oral en productos cárnicos procedentes de mercados de abasto de diferentes regiones del Perú.
Una identificación registrada de patógenos según tipos de carnes adquiridas por mercados, permitiría a la comunidad epidemiológica realizar un seguimiento más austero con protocolos propuestos en la presente investigación. Además, hasta donde se sabe, las regiones evaluadas aparentemente nunca registraron antecedentes de Salmonella spp., Campylobacter spp., y Escherichia coli O157:H7, por lo mismo que su población desconoce la existencia de estos causantes de diversas enfermedades consideradas responsables de cuadros diarreicos, trastornos neurológicos por el síndrome de Guillain-Barré, síndrome hemolítico urémico entre muchas. La presente investigación identificó, las condiciones de inocuidad que atraviesan las carnes de pollo y cerdo en los diferentes mercados de abastos informales, utilizando para el caso de Salmonella spp. un indicador microbiológico. También, se comparó los métodos de cuantificación tradicionales según ISOs respecto al protocolo molecular qPCR. Seguidamente, se registró las concentraciones microbiológicas entre tipos de carnes por regiones e identificó la carne con mayor cantidad de microrganismos.
El contenido del presente trabajo está estructurado de la siguiente manera:
CAPITULO I. Detalla los antecedentes, bases teóricas, términos básicos, hipótesis y operacionalización de variables.
CAPITULO II. Establece el tipo, método, diseño de investigación; población, técnicas de recopilación y técnicas de procesamiento de datos.
CAPITULO III. Describe análisis y discusiones de resultados.
Finalmente, conclusiones, recomendaciones y referencias bibliográficas.
16 CAPÍTULO I
MARCO TEÓRICO 1.1 Antecedentes
En el Perú, la carne de pollo es el producto de mayor preferencia frente a las demás carnes. Su consumo per cápita fue de 49.83 kg/hab/año 2019 (Dgesep-deia, 2021), carne de vacuno 6.5 kg (MIDAGRI, 2021) y carne de cerdo de 5,5 kg (MINAGRI-DGPA, 2020). En paralelo a estos reportes, se puede sospechar que muchos patógenos como la Salmonella spp., va avanzando inadvertidamente provocando brotes de origen alimentario (Quino et al., 2020).
A fin de conocer la presencia de patógenos en carne cruda de pollo comercializadas en cinco mercados de la ciudad de Huánuco, Vásquez-Ampuero
& Tasayco-Alcántara (2020) realizó un estudio descriptivo transversal, eligiendo aleatoriamente 50 establecimientos, resultando un 62% (31 puestos) positivas a Salmonella spp. con un promedio de 35.88 UFC/g. Los resultados cuantitativos no permiten diferenciar los mercados con mayor prevalencia de este microrganismo.
Así mismo, Ruiz-Roldan (2018), en un estudio descriptivo transversal realizado en principales mercados tradicionales de Lima, concluyó haber aislado Salmonella spp. en carnes de pollo un 30% (n=18) de 64 muestras mientras que para carnes porcinas el 6% (n=2) resultaron positivas de un total de 30 muestras.
Estos resultados describen solo niveles cualitativos que cumplieron sus objetivos.
Por otro lado, la normativa Resolución Ministerial N° 591-2008 MINSA, establece criterios microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos, señalando que un alimento es considerado apto para el consumo humano si éstas están exentas de patógenos al menos en 25g de muestra. Lo mismo que para su cumplimiento describe a las autoridades competentes en la ley de inocuidad N°1062. Al parecer, las normativas vigentes aún están en transición o desconocimiento por la comunidad informal de los mercados de abasto.
17 1.2. Bases Teóricas
Uno de cada 10 personas entre niños y adultos en el mundo, mueren a consecuencia de la ingesta de alimentos contaminados haciendo unas 420000 víctimas. En este grupo de víctimas, incluyeron 125000 menores de 5 años provenientes de países pobres y en desarrollo con bajos ingresos económicos y se encuentra entre las 10 enfermedades con mayor prevalencia (OMS, 2015; WHO, 2021). Además, se producen pérdidas anuales de hasta 33 millones de años de vidas (DALYs) y ocasionan muertes, de los cuales 1/3 son niños menores de 5 años. Existen aproximadamente 31 agentes etiológicos relacionados con las ETAs, lo encabeza la Salmonella entérica no tifoidea, E. coli, Norovirus, Vibrio cholerae y Campylobacter spp. (OMS, 2015). Por otro lado, en América 77 millones de personas enferman y más de 9000 mueren al año. De éstas que enferman, 31 millones son menores de 5 años que mueren por cuadros diarreicos equivalente a más de 2000 niños al año (WHO 2015). Además, se estima que anualmente 1 de cada 4 personas sufren un episodio de ETAs donde los niños, embarazadas, inmunosuprimidos y adultos mayores, son los más vulnerables a este tipo de enfermedades (OPS / OMS 2018).
En el Perú los brotes de ETAs son reportados al sistema integrado epidemiológico - notificación de brotes, emergencias y desastres (SIEpi-Brotes). A una evaluación por regiones naturales, la mortalidad por infecciones intestinales observada en máxima y mínima para el sector costa la lidera Moquegua con 17.2%
y Tumbes con 4.8%, para el sector sierra Arequipa con 11.9% y Puno con 1.8% y para el sector selva a Ucayali 9.8% y San Martin con 2.9% (MINSA 2019), estos reportes probablemente varíen debido a que los brotes notificados no se investigan ni analizan oportunamente (MINSA-dge 2019). Durante el periodo 2008 – 2019 el SIEpi-Brotes reportó un promedio de 41 brotes al año, 1134 casos y 19 defunciones (MINSA-dge 2019). En Junín, 28 de cada 1000 niños menores de 5 años de edad, mueren por cuadros diarreicos. Actualmente se reporta un promedio de 750 casos por afecciones diarreicas a la semana (Diresa-Junín 2020).
Para cotejar estudios recientes relacionadas al presente estudio, se consiguió los resultados de los mercados tradicionales de Lima con Escherichia coli en carnes de cerdo, pollo y res en un 80%, 95.3% y 70.4% respectivamente (Ruiz- Roldán et al., 2018). Lo mismo, el aislamiento de Salmonella spp. en carnes de
18 pollo de los mercados de la ciudad de Huánuco con un 28% (Juan Marco Vásquez- Ampuero & Tasayco-Alcántara, 2020). Encontrándose, indicios para sospechar sobre la vulnerabilidad de los consumidores con carnes contaminadas con patógenos que podrían afectar la salud con mínimas cantidades de microrganismos (dosis infecciosa).
1.2.1. Normativas En Inocuidad y Calidad.
La Comisión del Codex Alimentaius es el organismo internacional más alto en materia de normas de alimentación. Es la entidad que se encarga de garantizar la buena calidad de los alimentos a 99% de la población mundial (FAO, 2013) así mismo, ayuda a los países en desarrollo a estimar la carga de ETAs, facilita capacitaciones y orientaciones para mejorar la vigilancia de las ETAs así como entrega pautas para el control de Campylobacter y Salmonella en la carne de pollo (WHO and FAO, 2016).
En el Perú, el control y vigilancia de alimentos lo realiza el Ministerio de Salud (MINSA), Servicio Nacional de Sanidad Agraria (SENASA) y las municipalidades.
En la normativa RM N° 591-2008/MINSA, especifica los criterios microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad para alimentos de la siguiente manera: tres limites antepuestas con letras “m”, “M” y una menor a “m”, donde recuento de colonias menores a “m” (105 UFC/g) indican la aceptabilidad del producto, seguidamente de valores mayores a “m” consideradas marginalmente aceptables y los mayores a ”M”
(>107 UFC/g) consideradas inaceptables. Uno de los agentes microbiológicos controlados por las autoridades sanitarias generalmente municipal y la dirección regional de salud (DIRESA) son los aerobios mesófilos. Para estos casos, la norma señala que, en una muestra de 25 gr de carne, éstas deben presentar estándares por debajo de 105 UFC/g y ser rechazado si éstas están por encima de 107 UFC/g.
Además, señala que el alimento debe estar libre de patógenos como de Salmonella spp., E.coli O157:H7, Campylobacter spp entre otros. A las que en una muestra de 25g éstas deban ser negativas (RM.N°591-MINSA, 2008).
Por otro lado, la ley de inocuidad N° 1062/2008 tiene como objetivo principal de “garantizar la inocuidad de los alimentos destinados al consumo humano…” para ello precisa en su artículo 9° que el alimento: a) no sea nocivo para la salud; b) sea calificado como apto para el consumo humano por la autoridad sanitaria
19 competente y, c) no cause daño al consumidor cuando se prepare y/o consuma de acuerdo con el uso a que se destina (Ley_N°1062, 2008). Del mismo modo, la normativa delega a la Comisión Multisectorial Permanente de Inocuidad Alimentaria (COMPIAL), Ministerio de Salud a través del DIGESA, SENASA, gobiernos regionales y locales como responsables del control y vigilancia de la inocuidad de los alimentos. Seguidamente en su artículo 20°, menciona realizar las acciones necesarias para implementar y difundir la política Nacional de inocuidad de los alimentos, así como coordinar y colaborar con las autoridades competentes de nivel Nacional para el funcionamiento del sistema de vigilancia y control (Ley_N°1062, 2008). Como también, el SENASA es el organismo que controla la condición sanitaria de los animales en pie y son las encargadas de proveer animales hasta el centro de procesamiento primario llamados “mataderos” para garantizar alimentos cárnicos de calidad. Lo mismo, que atravez de su página web, https://servicios.senasa.gob.pe/SIGIAWeb/ino_consultasmatadero.html, permite a cualquier usuario verificar el estado situacional de mataderos para su conformidad.
Finalmente, los gobiernos municipales a través de las normativas Ley N° 27972, Decreto Legislativo N° 1062-2008 y Decreto Supremo 015-2012-AG, son autorizados para mantener la vigilancia de las condiciones sanitarias de los alimentos en general.
1.2.3. Salmonella spp
a) Características Generales. Nombrada en honor al veterinario Estadounidense Daniel Elmer Salmon (Fàbrega & Vila, 2013). Son bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos, rectos, no esporulantes, móviles (con algunas pocas excepciones) y pertenecientes al género Salmonella de la familia Enterobacteriaceae (Acha PN & Szyfres B, 2003; Fàbrega & Vila, 2013; Mcsorley, 2014). Algunos estudios consideran a este microrganismo como patógeno facultativo intracelular, que mide entre 2 y 3 μm y mantiene un citoesqueleto bacteriano de forma de varilla debido a una proteína que se parece a la actina (Khan, 2014). Desarrollan a una temperatura de entre 8° a 45°C con un pH 4 a 8 y en condiciones de baja actividad de agua 0.94 (Acha PN & Szyfres B, 2003;
Rönnqvist et al., 2017). El esquema Kauffmann-White divide las salmonelas en serotipos donde en su estructura antigénica distinguen antígenos somáticos O,
20 flagelares H y capsulares VI. Hay actualmente cerca de 2200 serotipos (Acha PN
& Szyfres B, 2003).
A la prueba bioquímica, la mayoría de las Salmonellas no fermentan la lactosa. Si bien existen muchos protocolos diferentes para el aislamiento y la identificación, básicamente todos ellos cuentan con un paso de pre-enriquecimiento de la muestra en agua peptonada y posterior sembrado en agar MacConkey donde se pueden observar colonias amarillas con una reacción alcalina (roja) en el centro.
Además, si se siembran en el agar verde brillante y el medio XLD, las colonias son de color rojas con centros negros debido a la reacción del ácido sulfhídrico (H2S) sobre ellas. Las colonias características a Salmonella son seleccionadas e inoculadas en agar indicadores como el TSI y caldo de lisina descarboxilasa. Los resultados a la reacción TSI son: superficie inclinada de color rojo (alcalina), fondo de color amarillo (ácido) y reacción de H2S color negro en la zona intermedia (R/Y/H2S+). Y, por otro lado, la prueba de descarboxilación de lisina es positiva.
Sin embargo, si la reacción en agar TSI y caldo de lisina descarboxilasa son confusas, se debe realizar una prueba bioquímica adicional o usar el sistema de identificación API 20E o el empleo de métodos moleculares (Markey et al., 2013;
Vadillo et al., 2002)(Markey et al., 2013; Vadillo et al., 2002).
b) Salmonelosis En La Salud Pública. Las infecciones por Salmonella spp.
siguen siendo de preocupación mundial debido a la morbilidad humana y considerables pérdidas económicas. Estas infecciones se transmiten entre humanos y animales mediante la ruta fecal-oral así como por el consumo de alimentos o agua contaminados. Si se lograra la identificación oportuna de estos patógenos, los brotes detectados serian controlados y permitiría realizar un manejo adecuado de pacientes (WHO, 2010). Una dosis infectiva de 101 a 103 UFC/g, es suficiente para iniciar la incubación que es entre 6 a 72 horas (Greig et al., 2010).
Seguidamente, la fiebre, vómito, calambre abdominal, diarrea, dolor de cabeza y mialgia inhabilitan de toda actividad al paciente. Puede requerirse hospitalización en casos de diarreas severas por bacteriemia, especialmente en pacientes muy jóvenes, ancianos e inmunocomprometidos (Dhanoa & Fatt, 2009). La verdadera prevalencia es difícil de evaluar debido que muchos países no disponen de un sistema de vigilancia epidemiológica ni notificaciones oportunas cuando aparecen casos leves y esporádicos (Acha PN & Szyfres B, 2003; MINSA-dge, 2019).
21 La salmonelosis con excepción de la Salmonella Typhi y los serotipos Paratíficos (en particular A y C) son específicos del hombre (Acha PN & Szyfres B, 2003). Por lo general, la salmonelosis zoonótica tiene un curso auto limitante con recuperación clínica entre 2 a 4 días para adultos, pero con desenlace mortal para niños. De hecho, el portador convaleciente puede eliminar salmonelas durante una semana y raramente, durante unos meses. (Acha PN & Szyfres B, 2003). Se estima que la Salmonella spp. causa más de 93 millones de casos globales asociadas a la diarrea y el 85% de estos casos están relacionados con los alimentos (Hung et al., 2017).
1.2.4. Escherichia coli O157:H7
a) Características Generales. Descubierta por el pediatra y microbiólogo Alemán Theodore von Escherich. Pertenece a la familia Enterobacteriaceae que comprende 41 géneros y cientos de especies reconocidas. El género Escherichia, es un bacilo gram-negativo, de tamaño 2-3µm, móvil mediante flagelos perítricos o inmóviles, con desarrollo anaerobio facultativo y crece preferiblemente a 37°C.
Además son catalasa positiva, fermentadoras D-glucosa, indol-lactosa positiva, oxidasa negativas, comprende 5 especies principales que son el E. blattae, E.
fergusonii, E. hermanii, E. vulneris y E. coli (Acha PN & Szyfres B, 2003). El esquema Kauffman clasifica serológicamente a la Escherichia coli en antígenos superficiales O (somáticos), K (capsulares) y H (flagelares) por lo que se ha identificado en 176 antígenos somáticos “O” (polisacáridos y termoestables), 112 flagelares (H) y 60 capsulares (K). (Acha PN & Szyfres B, 2003; Ørskov & Ørskov, 1984; York et al., 2000). “Esta forma de clasificación resultó muy útil en los estudios epidemiológicos y de la patogénesis de la E. coli, facilitando la diferenciación entre cepas virulentas e inocuas” (Acha PN & Szyfres B, 2003).
La E. coli presenta patotipos como la E. coli enterohemorrágica (EHEC), E.
coli enterotoxigénica (ETEC) E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli difusamente adherente (DAEC), entre otras (Razmi et al., 2020). Las EHEC son conocidas como la principal causa de colitis hemorrágica o diarrea sanguinolenta que, si progresa, puede producir el síndrome urémico hemolítico, el cual puede ser fatal. La EHEC se caracteriza por producir la toxina Shiga (Stx), también llamada verotoxina;
existen muchos serotipos de E. coli que producen Stx, sin embargo, sólo aquellos que han sido asociados clínicamente con la colitis hemorrágica son designadas
22 como EHEC. De ellos, la cepa O157:H7 es la más representativa de las EHEC y es causa principal de enfermedades a nivel mundial (Balakrishnan et al., 2016; FDA, 2020; Razmi et al., 2020).
La EHEC O157:H7 son fenotípicamente distintas a las demás E. coli debido a que exhiben una fermentación lenta o nula de sorbitol y no tienen actividad glucuronidasa (FDA, 2020). Por lo que se puede identificar, según estas características: ya sea cultivándola en agar cromogénico, haciendo test bioquímicos como la prueba de indol y disco coli completo, o realizando una identificación molecular mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la cual utiliza los genes uidA o wzy, entre otros. Sin embargo, éstas pruebas sólo identifican la parte O157 por lo que es necesario realizar una prueba de aglutinación de latex, que identifica tanto la parte O157 como la H7 a través de anticuerpos que se unen a dichos antígenos (FDA, 2020).
b) Colibacilosis En La Salud Pública. La enfermedad producida por EHEC inicia con la ingesta de alimentos pocos cocidos, aguas contaminadas, personas afectadas, contactos con rumiantes o entorno contaminado (Easton, 1997).
Diversas literaturas mencionan que la carne de res es el alimento con mayor predisposición a la contaminación por E. coli O157:H7(La Ragione et al., 2009).
Basta una dosis infecciosa de entre 10 a 100 células bacterianas como para poder colonizar las mucosas intestinales e iniciar la liberación de toxinas Shiga sobre las células epiteliales que recubren la mucosa intestinal (FDA, 2020; Greig et al., 2010).
Además, inducen a la muerte celular, desprendimiento de mucosa y manifestaciones diarreicas sanguinolentas en aproximadamente el 90% de los pacientes afectados (Ameer et al., 2018). La mayoría de los pacientes infantiles desarrollan el síndrome urémico hemolítico, disfunciones intestinales, daños al endotelio vascular del colon, riñón y sistema nervioso central (Kitaichi et al., 2004;
Méndez et al., 2013; Razmi et al., 2020). La terapia farmacológica no es eficiente por lo que su tratamiento es sintomatológico; aunque algunos estudios señalan que los antibióticos bacteriostáticos podrían ser beneficiosos (Bruyand et al., 2018).
1.2.5. Campylobacter spp.
a) Características Generales. Descubrimiento discrepado pero reconocido al pediatra y microbiólogo Alemán Theodore von Escherich (Friedmann, 2006). Este
23 género pertenece a la familia Campylobacteraceae y está compuesta por 32 especies oficialmente descritas (Costa & Iraola, 2019). Las especies de significancia sanitaria son 17 y las destacan el C. jejuni, C. coli, entre otros (Kaakoush, Castaño-Rodríguez, Mitchell, et al., 2015; PAHO, 2015). Estas son bacilos gramnegativos de 0.5 a 5µm, curvos (forma de S o gaviota), no fermentadores, oxidasas positivas, indol negativas, fumorato reductasa y según la especie catalasa variables. Igualmente, presentan una estructura morfológica de colonias distintas, por ejemplo: las colonias de C. jejuni son planas y de color gris mientras las de C. coli, son de una pigmentación rosa (García-Sánchez et al., 2018;
Man, 2011; Vadillo et al., 2002). Por otro lado, estas especies son muy sensibles al oxígeno, agentes físicos y químicos; como el calor, pH bajo, radiación gamma, desinfectantes o ambientes secos. Así mismo, pueden sobrevivir muchas semanas en medio acuoso a 4°C y durante meses a temperaturas de -20°C, pero son inactivadas en pocos días a temperaturas superiores a 15°C. (Vadillo et al., 2002).
En comparación con la mayoría de las bacterias, las especies de Campylobacter spp. presentan una escasa actividad bioquímica, por lo que no utilizan los azucares ni producen indol, características que sirven para su identificación en medios como el agar Desoxicolato-Cefoperazona-Carbón modificado (mCCD) y agar mCampi-cefex (Vadillo et al., 2002). Para la identificación de la Campylobacter en general, se puede realizar una incubación aeróbica a 25°C y otra a 41.5°C, además de la evaluación microscópica de la morfología y motilidad de la bacteria, así como su detección de la actividad oxidasa.
Adicionalmente, para identificar las especies se utilizan las siguientes pruebas:
reducción de nitratos y nitritos, producción de sulfuro de hidrogeno, sensibilidad o resistencia al ácido nalidíxico y a la cefalotina, crecimiento en presencia de cloruro sódico y de glicina, reacción a la catalasa e hidrolisis del hipurato de sodio (FDA, 2000).
b) Campilobacteriosis En La Salud Pública. El C. jejuni y el C. coli son agentes infecciosos que generan casos diarreicos en el mundo, especialmente en países desarrollados y recientemente reportado en países en vías de desarrollo (García-Sánchez et al., 2018; Oyarzabal & Carrillo, 2017). Diversos estudios mencionan que la carne de pollo es susceptible a contaminaciones con este microrganismo respecto a los otros alimentos (Newell et al., 2017; Samanta &
24 Samiran Bandyopadhyay, 2020). El mismo, al ser ingerido en una cantidad de entre 500 a 800 UFC pueden iniciar inflamaciones intestinales, infecciones pulmonares, abscesos cerebrales, bacteriemia, meningitis, artritis reactiva y diarrea acuosa con presencia de sangre. También señala que puede originar el esófago de Barrett, síndrome de Miller-Fisher (variante del Guillain-Barre), parálisis de Bell, entre otros(García-Sánchez et al., 2018; Greig et al., 2010; Kaakoush, Castaño- Rodríguez, Man, et al., 2015; Kaakoush, Castaño-Rodríguez, Mitchell, et al., 2015).
Actualmente en África, Asia, América Central y del Sur no se reporta datos epidemiológicos suficientes como para precisar el nivel de Campilobacteriosis. Sin embargo, está claro que en muchas de estas regiones, donde hay datos disponibles, las especies de Campylobacter parecen ser endémicas en los niños como lo estudiado en nuestro país el 2014 (Kaakoush, Castaño-Rodríguez, Mitchell, et al., 2015; Platts-Mills et al., 2014).
1.2.2. Principales Patógenos y Antecedentes Microbiológicos.
Las revisiones documentadas señalan que las principales bacterias patógenas que causan ETAs siguen siendo, en la mayoría de los casos, la Salmonella ssp, Escherichia coli O157-H7 y el Campylobacter ssp. Estos microrganismos son considerados de alta peligrosidad con vigilancia sanitaria descuidada y reportes de investigación aparentemente no transparente.
1.3. Definición De Términos Básicos
Alimentos Aptos Para Consumo Humano.
Alimentos que cumplen con los criterios de calidad sanitaria establecidos por la norma sanitaria.
Calidad Sanitaria.
Es el conjunto de requisitos microbiológicos, físico-químicos y organolépticos que debe reunir un alimento para ser considerado apto para el consumo humano.
Comercialización.
Significa el tener para la venta o exhibir para este fin, ofrecer para la venta, vender, entregar o colocar en el mercado de cualquier otra forma.
Criterio Microbiológico.
Define la aceptabilidad de un producto o un lote de un alimento basada en la ausencia o presencia, o en la cantidad de microorganismos, por unidad de masa, volumen, superficie o lote.
25 Inocuidad.
Garantía de que los alimentos no causaran daño al consumidor cuando se fabriquen, preparen y consuman de acuerdo con el uso a que se destinan.
Medida Correctiva.
Toda medida que se toma cuando se produce una desviación, con el fin de restablecer el control, segregar y determinar el destino del producto afectado, si lo hubiera, y prevenir o reducir al mínimo la recurrencia de la desviación.
NMP.
Número más probable.
Parámetros De Calidad Sanitaria.
Determinaciones analíticas que definen el nivel mínimo de calidad sanitaria de un alimento o debida industrializado.
Peligro.
Agente biológico, químico o físico presente en un alimento, o condición de dicho alimento, que pueden ocasionar un efecto nocivo para la salud.
Producción Primaria.
Las fases de la cadena alimentaria hasta alcanzar, por ejemplo, la cosecha, el sacrificio, el ordeño, la pesca.
Producto Final.
Producto terminado, envasado o sin envasar, listo para su consumo.
Riesgo.
Función de probabilidad de que se produzca un efecto adverso para la salud y de la gravedad de dicho efecto, como consecuencia de la presencia de un peligro o peligros en los alimentos.
UFC.
Unidad formadora de colonia.
Vigilancia Sanitaria.
Conjunto de actividades de observación y evaluación que realiza la autoridad competente sobre las condiciones sanitarias de la producción, transporte, fabricación, almacenamiento, distribución, elaboración y expendio de alimentos en protección de la salud.
26 1.4. Hipótesis
1.4.1. Hipótesis General.
Los patógenos microbiológicos, identificados en carnes de diferentes mercados de abasto del país; ponen en riesgo, la calidad de los alimentos y de las disposiciones de las normas sanitarias.
1.4.2. Hipótesis Especifica
• Las carnes de diferentes tipos, no cumplen con las condiciones de inocuidad establecidas en las normativas.
• Las carnes de diferentes tipos, tienen concentraciones microbiológicas distintas entre mercados de las diferentes regiones.
• Los métodos de cuantificación, tienen resultados distintas entre regiones.
• Al menos una especie cárnica de cualquier región presentan contaminación por microrganismos patógenos.
27 1.5. Operacionalización de las variables
Tabla 1.
Identificación de contaminantes microbiológicos en productos cárnicos procedentes de mercados de abastos
Variables Definición
conceptual Dimensiones Indicadores Valores finales Independiente
Carnes
procedentes de mercados de abastos
Musculo proteico de origen animal, que se consume como alimento de alta calidad para el
desarrollo, mantenimiento y conservación de la salud humana.
Patógenos
Carnes
Regiones
Mercados
Salmonella spp Campylobacter spp E. coli O157:H7 mesof. aerobios pollo
cerdo res Tumbes Lima Junín
Modelo de Tumbes 8 set. de Tumbes Modelo de Huaral Abasto de Huaral Modelo de Hyo Raez Patiño Hyo
NMP/g UFC/g UFC/g UFC/g Un tipo de carne más afectado.
Una Región más afectada
Un mercado más afectado
Dependiente Contaminación
microbiológica Introducción involuntaria o por descuido, de microorganismo s infecciosos a alimentos vigilados aptos para el consumo humano.
Aptitud, según normativa RM 591- 2008/MINSA
Métodos de cuantificacio nes
En 25g de muestra En 25g de muestra
< 105UFC/g 105–107UFC/g
>107UFC/g
Tradicionales cualitativos Tradicionales cuantitativos Moleculares
Ausencia Presencia Apto Marg.
Aceptable.
No Apto
Presencia Ausencia NMP/g UFC/g.
Log10 CG/g
28 CAPÍTULO II
DISEÑO METODOLÓGICO 2.1. Tipo y Nivel De Investigación.
Observacional, descriptivo y transversal. Similar a estudios realizados en Lima capital y la ciudad de Huánuco (Ruiz-Roldán et al., 2018; Juan M. Vásquez- Ampuero & Tasayco-Alcántara, 2020).
2.2. Método.
Se evaluó las cuantificaciones del microrganismo indicador en UFC/g y patógenos clásicos en NMP/g, mediante el estadístico Kruskal Wallis para datos no paramétricos aplicables en datos cuantitativas.
𝐾𝐾= 12
𝑁𝑁(𝑁𝑁+ 1)��𝑅𝑅𝑖𝑖2 𝑁𝑁𝑖𝑖 𝑘𝑘 𝑖𝑖=1
� −3(𝑁𝑁+ 1) Donde:
N = es el número total de observaciones en todas las muestras Ri = es la suma de los rangos de la i-ésima muestra
Nj = es el número de observaciones en la i-ésima muestra 2.3. Diseño
El presente trabajo con diseño epidemiológico descriptivo, inició desde el mes de marzo a noviembre del 2021. Para aislar mesófilos aerobios, se colectaron 108 muestras de carnes de pollos (N= 69) y carnes de cerdos (N= 39); así como para Salmonella spp.111 muestras de carnes de pollo (N=70) y carnes de cerdo (N=41). No se llegó colectar muestras de los mercados de la provincia de Tumbes, las que se suspendió por restricciones sanitarias COVID 19. También, para evaluar Campylobacter spp. se obtuvo solo 22 muestras adquiridas de los mercados de la provincia de Huancayo las mismas que por ser el microrganismo dificultoso para localizar se suspendió a fin de rediseñar el protocolo. Sin embargo, para el patógeno Escherichia coli O157:H7 se adquirió 26 muestras (N=26) obtenidas solo de los mercados de la provincia de Huancayo. Las cuantificaciones de mesófilos
29 aerobios, Campylobacter spp. y Escherichia coli O157:H7 fueron considerados cuantificables en unidades formadoras de colonias/gramo (UFC/g) y para Salmonella spp. como en número más probable/gramo (NMP/g). Todas las muestras de carnes fueron adquiridas censando (N) los puestos de cada mercado.
2.4. Población, Muestra y Unidad De Muestra.
2.4.1 Población
Se censó a todos los asociados que realizaron ventas de carnes dentro de cada mercado de las regiones de Tumbes, Lima y Junín. En la provincia de Tumbes a los mercados modelo y ocho de setiembre; en la provincia de Huaral a los mercados modelo y plataforma-abasto; y, en la provincia de Huancayo a los mercados modelo y Raez Patiño. No se diferenció condición de puesto, ventas mixtas, indumentaria, instrumentos de trabajo u otras formas para la atención al cliente.
2.4.2 Muestra y unidad de muestra.
Inicialmente, se consideró tomar muestras aleatorias simples con balota, según Tabla 2; pero, al no tener las cantidades esperadas se optó por censar en mutuo acuerdo a los responsables del proyecto.
La unidad de muestra polietápica, consistió en asegurar primero las regiones, mercados y tipos de carnes por conveniencia.
Tabla 2.
Presentación de la toma de muestra original.
Mercados Polloa Cerdob Resc
E.cO157 Salm.spp. mesóf.a. Campyl.spp Salm.spp mesóf.a.
Huancayo 30 30 30 30 30 30
Tumbes 30 30 30 - - 30
Huaral 30 30 30 30 30 -
Total 90 90 90 60 60 60
Nota. a Se cuantifica tres microrganismos. b Se cuantifica dos microrganismos. c Se a un microrganismo.
30 2.4.3 Técnica De Muestreo
La técnica que más se ajustó al presente trabajo fue colectando muestras por conveniencia (no probabilístico), debido a la mayor cantidad de puestos por cada mercado atendiendo al público (parte de las muestras), tipos de carnes como parte del objetivo del proyecto, medidas de bioseguridad en los accesos al mercado y bases de investigación en cada provincia elegida.
2.5. Técnicas e Instrumentos De Recopilación De Datos 2.5.1. Consideraciones Para La Toma De Muestra.
Por cada toma de muestra se utilizó el aplicativo Epicollect5, donde se registró la geolocalización, fotografía y hora de adquisición (ver anexo, Figura 17).
Se utilizó el mismo empaque con que el comerciante despachaba las carnes.
Fueron rotuladas según procedencia de la siguiente manera: H (mayúscula) para Huancayo, hl (minúscula) para Huaral y T (mayúscula) para Tumbes.
Seguidamente, se llevó a una caja conservadora de frio donde se incorporó termómetro marca TempTale Ultra que tiene la característica de registrar la temperatura en formato PDF desde el momento que se activa (salida) hasta el momento de llegada (ver anexo Figura 16).
2.5.2. Para Aislar Y Cuantificar Aerobios Mesófilos.
Se desarrolló de acuerdo a recomendación ISO 4833-1:2013. Para ello, se hizo un seriado hasta 10-7, se rotuló y se vertió 9 ml a partir de la dilución 10-2 hasta el último. Luego, se pesó 25 g de muestra y mezcló con 225 ml de agua peptonada al 10%, agitó por 2 minutos y vertió 10 ml al tubo 10-1. Ésta dilución se agitó nuevamente y transfirió 1 ml al tubo 10-2 luego al tubo 10-3 y así hasta la última dilución. Al mismo tiempo, se vertió 1 ml a sus correspondientes placas petri desde la dilución menor al mayor. Por otro lado, previa auto clavada del agar standard plate count (PCA) se temperó a 45°C y mantuvo en baño maría hasta que frente a un mechero se vertió a las placas inoculadas, se agitó en forma horaria y anti horaria, dejó enfriar y se condujo a incubar a 30°C por 72 horas. Concluido el tiempo de incubación, se seleccionó las diluciones que tuvieran entre 10 – 300 colonias, se contabilizó en placa con apoyo de un plumón y remplazó valores de acuerdo a la fórmula (ver anexo Figura 15):
∑ 𝑐𝑐
𝑣𝑣 ∗ 1.1 ∗ 𝑑𝑑
31
c
= Suma de colonias de dos placas de diluciones sucesivas, las cuales al menos una contiene un mínimo de 10 colonias.v
= Volumen de inóculo colocado en cada placa petri, en mililitros.d
= Factor de la dilución correspondiente a la primera dilución retenida.2.5.3. Para Aislar y Cuantificar Salmonella spp.
Igual que la anterior, se siguió las recomendaciones del ISO 6579-1: 2017 para su detección e ISO/TS 6579-2:2012 para su enumeración mediante la técnica de NMP miniaturizado. Para ello, se utilizó 25 g de muestras de carnes además de 225 ml de agua peptonada tamponado 10%, se agitó por 2 minutos y obtuvo la dilución inicial (10-1). Seguidamente se dividió el procedimiento en dos formas: la primera, para el método molecular con enriquecimiento y sin enriquecimiento. El
“sin enriquecimiento”, consistió en separar una alícuota de 40 ml en tubo Falcon e inmediatamente congelarlo y el “con enriquecimiento” otra alícuota en tubo Falcon para incubarlo junto a las muestras del método tradicional. La segunda forma, fue realizar el método tradicional iniciando el rotulado de 12 tubos (cuatro triplicados) de forma que se serió 10-1 – 10-4. Al primer seriado se hizo una alícuota de 2.5 de la solución inicial, mientras que a las diluciones 10-2 hasta la 10-4 se vertió 2 ml de agua peptonado tamponada. En seguida, previa agitación, se transfirió 500μl de la dilución 10-1 a la 10-2 y de ésta a la siguiente hasta la última dilución. Terminada el procedimiento se incubó por 18 h ± 2h a 37°C, para su pre-enriquecimiento.
Seguidamente, se transfirieron a dos formas: la primera, para realizar diluciones cuantitativas con 20μL y la segunda para inocular con 100 μL a placas petris consideradas cualitativas. Al agar semisólido de Rappaport-Vassiliadis (MRSV) (preparadas anteriormente con 2 ml de éstas a microplacas de 12 pocillos), fueron transferidos 20 µL entre sus correspondientes pocillos. Así mismo, sobre el agar semisólido MRSV en placa Petri se vertió una alícuota de 100 µL proveniente del tubo Falcon incubado, la que se distribuyó en tres puntos equidistantes y condujo a incubación por 24h ± 3h a 41.5°C. Las colonias sospechosas (halo blanquecino o gris) se transfirieron con un ansa y frente al mechero al agar desoxicolato de xilosa y lisina (XLD) y agar R&F salmonella (no tifoidea). Luego se incubó a 35°C por 24h ± 3h al que después se buscó las colonias típicas (en el XLD rojo a amarillo con centros de color negro y coloración rosada en el agar, lo mismo en el R&F colonias rosadas); para transferirlo a la evaluación bioquímica entre el TSI, agar
32 urea y L-lisina por 24h ± 3h a 37°C (ver anexo Figura 5 y Figura 6). Los pocillos positivos fueron identificados, contabilizados horizontalmente y subido al programa Rcomander para su enumeración en NMP/g de la siguiente manera:
mpn(positive = c(1, 0, 0, 0), tubes = c(3, 3, 3, 3), amount = c(.1, .02, .004, .0008)) Donde:
Positivo c = número de pocillos detectados.
Tubos c = número de pocillos por dilución.
Diluciones c = fracciones decimales de la muestra.
2.5.4. Para Aislar y Cuantificar Campylobacter spp.
Se respetó las recomendaciones del ISO 10272-2:2017 con sembrado directo en placa. Para ello se inició homogenizando por dos minutos, 25 g de muestra de piel del cuello de pollo en 225 ml de agua peptonada al 1% y obtener la solución inicial (10-1). Seguidamente se hizo una alícuota de 40 ml en tubos Falcon para inmediatamente congelarlo y llevar posteriormente a la prueba molecular. Por otro lado, se separó una alícuota de 10 ml de la dilución inicial e hizo diluciones hasta 10-3. Se agitó los tubos y con el uso de una pipeta se transfirió 1ml a las diluciones correspondientes (ver anexo Figura 10). También se rotuló las placas preparadas con agar Desoxicolato-Cefoperazona-Carbón modificado (mCCD) y agar Campylobacter con 10% sangre ovina y vertió 100μl de las diluciones preparadas por duplicado solo a la primera dilución 10-1, se distribuyó con asa Digralsky en L, luego a la segunda y a la tercera de sus diluciones correspondientes.
Seguidamente, se acondicionaron las placas en jarras microaerobias con sachet CampyGenTM además de unas gotas de glicerina sobre un papel y condujeron a incubación de 41.5°C por 44 horas. Al terminar este procedimiento, se seleccionaron las placas que tuvieran colonias traslucidas (forma de rocío) grises y brillosas de entre 500 μm a 1mm aproximadamente (solo observable a estereoscopio) e inmediatamente se realizó la tinción Gram y observación con aceite de inmersión (ver anexo Figura 11). Las placas sospechosas se separaron y realizaron la contabilidad de entre 15 a 150 UFC. Al tener a estas sospechosas se cultivaron en agar Columbia con 5% de sangre ovina a temperatura de 41.5°C por 44 horas para confirmar nuevamente la morfología (prueba Gram) (ver anexo Figura 9 y Figura 11), motilidad en solución salina 0.85%, crecimiento micro aerobio a 25°C y aerobio a 41.5°C y finalmente con la prueba oxidasa.
33 2.5.5. Para Aislar y Cuantificar Escherichia coli O157:H7
Este procedimiento se hizo con el método sembrado directo en placa. Para ello, se pesó 25 g de carne de res y mezcló con 225 ml caldo R&F E.coli O157:H7, la que previo masaje por 2 minutos se obtuvo la solución inicial 10-1. Usando una pipeta se realizó una alícuota de 10 ml en dos tubos de los cuales uno de los tubos se destinó para la cuantificación y el otro para separación inmunomagnetica (cualitativo). Así mismo, se hizo una alícuota de 40 ml en tubo Falcon para realizar PCR a lo que junto a los tubos destinados para la cuantificación fueron incubados a 37°C por 18 horas. Mientras, el tubo separado para procesar el aislamiento cualitativo se desarrolló de la siguiente manera: se colocó en un rack 4 microtubos, etiquetó e hizo diluciones seriadas hasta 10-4 donde el primero fue para la dilución inicial 10-1 y los tres restantes vertido con 900μl de solución peptona sal. A la primera dilución (10-1) se vertió 20 μL de Dynabeads® anti – E. coli O157 seguido de 1 ml de la dilución inicial (tubo de 10ml agitado). Seguidamente al microtubo se le agitó suavemente por 10 minutos en forma separada y se le incrustó a la placa magnética DynaMagTM-2. En ella, se le agitó nuevamente por 10 minutos y se le extrajo el sobrenadante para ser remplazado y lavado con 1 ml de la solución phosphate buffered saline (PBST), siendo después retirado de la placa magnética y agitado por otros 10 minutos (se repite por tres veces este procedimiento).
Seguidamente se vertió 900 μl a los microtubos rotulados 10-2 hasta la 10-4 y se transfirió 100 µl a la dilución 10-2 y de éstaa la siguiente hasta llegar al último tubo.
Una vez preparado estas diluciones, se rotuló el código de la muestra en la placa de los agares MacConkey-Sorbitol (CT-SMAC) y cromogénico R&F E.coli O157:H7 y se transfirió 100 μL de estas diluciones a sus correspondientes agares a los mismos que se expandió con asa triangular metálico cauterizado en el mechero.
Importante: considere un control positivo hasta el final de la prueba. Se incubó a 35°C por 22 horas. Luego, con ayuda del estereoscopio se buscó la colonia sospechosa en el agar CT-SMAC de color beige o incoloro (ver anexo Figura 12A) y azul oscuro o negruzco en el agar R&F E.coli O157:H7 (ver anexo Figura 12B) con diámetros entre 1.5 a 2.0mm. Estas colonias son transferidas por agotamiento al agar SMAC y también al agar R&F (reconfirmatorio) y se condujeron a incubación por 22 horas a 35°C. Seguidamente fueron sometidas a pruebas bioquímicas solo con los resultados del agar SMAC (libre de antibióticos). Prueba MUG con el Kit de identificación rápida Bactiden® E. coli que consistió en verter a su pocillo
34 (cuadrado) 200μL de agua destilada autoclavada y dentro de ella verter con el ansa aséptica las colonias encontradas en el agar SMAC, se le colocó la tira reactiva hasta la base del pocillo y selló la boca con parafina. Seguidamente, se condujo a incubación por 2 horas a 37°C y observó en un espacio oscuro la “no-luminiscencia”
a la lámpara UV 366 nm (si emite luminiscencia entonces la muestra tiene β - D – glucuronidasa y es una E. coli genérica). Si era negativa a MUG, se realizó a la prueba INDOL con el reactivo KOVACS, que de ser positivo (color rojo) se hizo la prueba de aglutinación con Remel™ RIM E. coli O157:H7 Latex Test, la que debe presentar aglutinación si es del antígeno O157, si continuaba estos resultados a la prueba siguiente fue con látex H7 la que debe ser positiva (ver anexo Figura 14).
2.5.6. Técnica Molecular
Se procedió a realizar este procedimiento siempre en cuando el método tradicional llegara a detectar patógeno sospechoso y pueda realizar su cuantificación. Consistió en realizar la preparación, extracción y su amplificación de cada muestra procesada del método tradicional a fin de contrastar la efectividad.
2.5.7. Purificación y Extracción De La Muestra
a) Muestra Inicial. Se considera muestra inicial a aquellos tubos Falcon etiquetadas con las letras “A”, a la que se consideró sin enriquecimiento (no incubadas); y la letra “B”, las muestras con enriquecimientos (incubadas por 18hrs), ambas congeladas a temperaturas por debajo de 22°C.
b) Ruptura De La Pared Bacteriana y Liberación Del Núcleo Celular. Se descongeló a temperatura ambiente (18°C), se agitó y extrajo con apoyo del pipeteador Eppendorf una alícuota de 100μL en micro tubos A y B para luego agregar 100 μL de agua libre de nucleasas a cada uno y verter 50uL de Enzyme Mix que incluye las perlas magnéticas del Dynabeads (ver anexo Tabla 12).
c) Ruptura de la membrana nuclear. Seguidamente se vertió 5 μL de la enzima Proteinaze K, a fin de liberar el ADN celular, para ello se agitó, condujo al termo bloque y colocó en la rejilla DynaMag ™-2 (en ella puede acompañar muchas bacterias comprometidas por lo que no se considera netamente puras) ver procedimientos del anexo Tabla 12.
d) Primer Lavado Del Dynabeads Y Separación Magnética. El principal objetivo es capturar la mayor cantidad de ADN capturadas en las perlas magnéticas. Al ser ésta de carga negativa (fosfatos que forman parte del nucleótido quedan dispuestos hacia el exterior de la doble hélice) son atraídas al imán
35 DynaMag™-2 y el sobrenadante purgada mediante pipeta. Seguir los procedimientos del anexo Tabla 12.
e) Segundo Lavado Del Dynabeads Con Etanol 80°. Este procedimiento al igual que la anterior tiene la finalidad de seguir lavando la muestra separando del imán, agitándolo y nuevamente colocando al imán para luego retirar el sobrenadante de modo que quede solo las perlas magnéticas.
f) Elución Del Ácido Nucleico. Finalmente, utilizando 50 μL de Elution Solution se diluye las perlas a fin de separar el ADN adherida y con una pipeta el líquido conteniendo la muestra purificada. Seguir procedimientos del anexo Tabla 12.
2.5.8. Amplificación Del ADN
Se transfirió 5 µL de la muestra ADN (del paso de extracción) a una placa óptica de 96 pocillos que contuvo 20 µL del master mix. Luego, se agregó un control negativo y una curva patrón. La placa fue cubierta con una película adhesiva óptica MicroAmp®. Finalmente, las copias genómicas se desarrollaron de acuerdo con las sondas y cebadores descritas en la Tabla 13 (B. Malorny P. Fach, C. Bunge, A.
Martin and R. Helmuth et al., 2004; Gannon et al., 1997; Rantsiou et al., 2010), reguladas con parámetros de temperaturas según tipo de microrganismo (Tabla 14) y procesadas en el termociclador QuantStudio™ 3 marca Thermo Fisher Scientific, Massachussetts - USA).
2.6. Técnica De Procesamiento De Datos
Los resultados de evaluación microbiológica en laboratorio fueron registrados en Microsoft Excel para ser importados al paquete estadístico Rcomander y Rstudio, versión R-4.2.1. Para conseguir diferencia entre grupos de los datos numéricos entre mercados, se sometió a la prueba de normalidad y homocedasticidad. Al no conseguirla, se optó por la evaluación no paramétrica de Kruskal Wallis y post-hoc. Como también, se consignó las medianas con rangos mínimos y máximos de las UFC/g y NMP/g de cada mercado. Ver principales pasos en el anexo Figura 18.
36 CAPÍTULO III
ANÁLISIS Y DISCUSIONES DE RESULTADOS 3.1. Resultados mesófilos aerobios en carnes de pollos y cerdos.
De acuerdo al presente resultado, más del 55% de los establecimientos evaluados, comercian carnes de pollo por encima de las 10 000 000 UFC/g (1.0e+7) o son mayores a los valores “M”, lo que hace que las carnes no se consideren aptos para el consumo humano según la normativa RM 591-2008-MINSA. Por otro lado, existe un grupo importante de comerciantes (cerca del 45%) que expenden carnes consideradas marginalmente aceptables (valores entre “m — M”) destacando en ella los mercados plataforma-Abasto de Huaral y el Modelo de Huancayo. Se puede expresar marginalmente aceptables a la condición de los alimentos que solo un inspector sanitario capacitado pueda certificar la continuación en el comercio o lo contrario lo conveniente sería decomisar. Por otro lado, en la Tabla 3, se observa la diferencia de medianas entre mercados con concentración mínimas (Min.) y máximas (Max.), siendo el mercado Modelo de Huancayo con menor carga de problemas sanitarios respecto a los mercados Modelo de Tumbes y Modelo de Huaral.
37 Tabla 3.
Diferencia microbiológica entre carnes de pollo P=0.009721 por mercados y resultados al test posthoc de Kruskal Wallis.
Mercados N UFC/g
Mediana UFC/g
Min. Max. mesófilos aerobios
<m m — M % >M %
Mod.Hyo 19 3.4e+6a 9.9e+5—3.0e+8 0 14 73.7 5 26.3
Raez P.Hyo 10 3.8e+6ab 2.1e+6—5.9e+8 0 7 70.0 3 30.0
Mod.Tumbes 6 1.3e+8b 5.8e+7—1.8e+8 0 0 0 6 100
8 set.Tumbes
4 1.1e+8ab 8.5e+5—3.8e+8 0 1 25.0 3 75.0
Mod. Huaral 28 2.8e+7b 1.5e+5—3.5e+8 0 7 25.0 21 75.0 Plataf. Huaral 2 4.5e+6ab 6.2e+5—8.5e+6 0 2 100 0 0
Total 69 0 31 44.9 38 55.1
Nota. Ilustración de los mercados: Modelo de Huancayo (Mod.Hyo), Raez Patiño de Huancayo (Raez P.Hyo), Modelo (Mod. Tumbes), ocho de setiembre (8 set. Tumbes), Modelo (Mod. Huaral), Plataforma-Abastos (Plataf. Huaral). Los superíndices “a” y “b” indican diferencias entre mercados. NA= 1 (Mod.Hyo) Fuente: elaboración propia.
Durante el desarrollo de este aislamiento y por no presentar diluciones seriadas congruentes hasta la 10-7, se declaró extraviado una muestra (NA) correspondiente al mercado Modelo de Huancayo (Mod.Hyo). A la que como acción correctiva se suspendió la colecta de muestras y se tuvo que practicar la buena dilución seriada por dos semanas y luego continuar.
Por otro lado, sobre la presencia de mesófilos en carnes porcinas, solo un puesto guardó las condiciones de calidad y estuvo localizado en el mercado Plataforma-Abasto de la provincia de Huaral. A pesar de la mala experiencia con la muestra extraviada anterior, también sucedió lo mismo, esta vez con dos muestras procedentes del mercado plataforma-abasto de Huaral a la que se declaró extraviado (NA). El error estuvo en procesar las muestras en tubos esterilizados guardadas en vitrina por más de tres semanas que al observar las placas procesadas, éstas se mostraron incontables hasta en el control negativo. Su acción correctiva fue etiquetar cada paquete de tubo autoclavado con fecha de salida y preferiblemente utilizar tubos estériles post-24horas. Luego, nunca más se repetiría
38 el reporte de muestras extraviadas. Al momento de colectar las muestras de carnes, se pudo observar que la mayoría de los establecimientos de los mercados de la provincia de Huaral comercializaban carnes con el sello de inspección sanitaria de algún matadero autorizado, lo que pone en duda con la publicación de la portada web sobre mataderos autorizados en Huaral por SENASA. En esta publicación señala que esta provincia solo tuvo autorización hasta el 2013. Entonces ¿Cómo es que los mercados de Huaral son abastecidos con carnes garantizadas sin la aprobación del SENASA? Es casi probable que entre los mataderos privados y municipales tengan reclamos frontales y legales frente a esta institución debidos a la alta competencia desleal que tienen los mataderos con los comerciantes informales; pero esto es tema de otra investigación.
Respecto a las carnes porcinas para los mercados de Huancayo, en esta provincia, no existe matadero privado ni municipal que provean carnes garantizadas. La mayoría son de procedencia clandestina especialmente del Distrito de Sapallanga. Salvo la Empresa REDONDOS S.A. que proveen a algunos puestos del mercado, carnes con el sello de calidad. Pero, en menor cantidad debido a que los usuarios prefieren consumir carnes serranas (sopleteados con gas propano) respecto a los escalfados (blancas). El dato curioso es que los dizques carnes serranas, en su mayoría son de granjas clandestinas limeñas, que son traídas en pie al Distrito mencionado, beneficiados y puesto al mercado en plataformas de camión por la madrugada.
En la Tabla 4, podemos observar que el mercado Plataforma-Abasto de Huaral
(
Plat.Huaral)
representa como el único mercado con menor problema sanitario respecto a los demás establecimientos. Obsérvese que, de cinco muestras, un puesto ofrece carnes compatibles con la calidad exigida (46 000 UFC/g respecto a 100 000 UFC/g), tres puestos requieren observaciones sanitarias (m – M) y solo uno sería puesto a disposición de las autoridades sanitarias (>M). Si bien es cierto que el tamaño de muestra no es suficiente, aun así, nos muestra que los asociados de este mercado procuran ser cuidadosos con sus productos que ofrecen a sus clientes (caseros). Así mismo, se aprecia que más del 85% de las muestras evaluadas del mercado Raez Patiño (RaezP. Hyo) están por encima de las exigencias de los criterios microbiológicos discrepando con la calidad. La39 contabilización de colonias mínimos (Min.) y máximos (Max.) consignada en la tabla, siguen el procedimiento de conteo en placa detallada en el anexo Figura 15.
Tabla 4.
Diferencia entre carnes de cerdos p=0.01629 según mercados y resultados al test poshoc de Kruskal Wallis.
Mercados N Mediana UFC/g UFC/g Min. – Max.
mesófilos aerobios
<m % m - M % >M %
Mod. Hyo 13 8.5e+6ab 1.5e+5—2.3e+8 0 0 7 53.8 6 46.2 RaezP. Hyo 7 3.5e+7a 7.0e+6—4.2e+8 0 0 1 14.3 6 85.7 Mod.Huaral 14 6.1e+6ab 1.5e+5—1.9e+8 0 0 9 64.3 5 35.7 Plat.Huaral 5 1.6e+6b 4.6e+4—1.0e+7 1 20 3 60.0 1 20.0
Total 39 1 2.5 20 51.3 18 46.2
Nota. Los superíndices “a” y “b” indican diferencias entre carnes de los diferentes mercados. Mercados: Modelo de Huancayo (Mod.Hyo), Raez Patiño de Huancayo (Raez P.Hyo), Modelo (Mod. Huaral), Plataforma-Abastos (Plataf. Huaral). NA= 2 (Plat.H).
Comparando las medianas de los microrganismos mesófilos aerobios y Salmonella spp. en carnes de pollo y porcinos, se pueden observar que los valores atípicos u outlier proyectada en algunas cajas y bigotes, se alejan demasiadamente (acontecimiento extraordinario) debido a que algunos datos presentaron cuantificaciones exorbitantes (Figura 1). Así mismo, las carnes de cerdo correspondiente a las provincias de Tumbes no se incluyeron debido a que este producto es comercializado desde sus casas, por lo que, durante la toma de muestra iniciada con carnes de pollo, no se observó comerciantes vendiendo este producto (restricciones sanitarias o dentro del mercado no acostumbran venderlos) y que se decidió no ir debido a la segunda ola COVID 19. Ver Tabla 5.
