Al igual que el patógeno anterior, inicialmente se trató de conseguir un control positivo de Estados Unidos de América (EUA); pero, al no tener el éxito deseado por el tiempo de llegada que significaría; se optó conseguir de las fecas perianales de becerros del establo San Juan al que después de un periodo de 50 días aproximadamente, se aisló según protocolo anexo Figura 13 y conservó bajo congelación hasta el momento de su uso. Al igual que el Campylobacter spp., el número de muestras no llegó a completarse a pesar de haberse censado a todos los puestos para la provincia de Huancayo (
2.4.2 Muestra)
haciéndose un total de 26 muestras entre Raez Patiño y Modelo de Huancayo. La colecta de muestras procedentes de la provincia de Tumbes quedó pendiente y postergado54 hasta que el problema de la tercera ola COVID19 se estabilice y al menos todos los investigadores estemos inmunizados. En definitiva, no se encontró resultados concluyentes como para sospechar que las muestras hayan sido sospechosas, o en su defecto, las muestras tomadas no tuvieron patógeno alguno. Por otro lado, se consideró no necesaria realizar la prueba molecular debido a que las muestras desarrollaron en el agar SMAC sorbitol con la consecuente aglutinación de látex O157 y la falta de actividad beta-glucuronidasa a la luz UV (Anexo Figura 14).
55 CONCLUSIONES
1. La calidad de las carnes en pollos y cerdo, fueron afectadas por el patógeno Salmonella spp. al igual que los mesófilos aerobios. A este último, se utilizó como indicador para el diagnóstico de Salmonella spp. y fijar su posible uso por parte de los inspectores sanitarios, como apto y no apto en función a la cantidad UFC/g. Respecto a los patógenos Campylobacter spp, Escherichia coli O157:H7, no se encontró resultados esperados.
2. A la evaluación Salmonella spp con el método tradicional (método cualitativo además del cuantitativo), el 80% de carnes de pollo (N= 56) y el 34% de carnes de cerdo (N= 14) no cumplieron con las condiciones de inocuidad exigidas por la normativa R.M. 591-2008-MINSA. Nuestro indicador microbiológico, supone presencia de Salmonella spp. en carnes de pollo, a partir del Log10 6.50ufc/g (3 163 636 ufc/g) permitido aun para la escala “m – M”. Mientras, que, en las carnes de cerdo, se evidencia a partir del Log10 7.33UFC/g (21 363 636 ufc/g); más del 100% por encima de la línea inicial
“>M” de la escala de criterios microbiológicos de calidad.
3. Todas las muestras conseguidas de los mercados de las distintas regiones del país, presentaron concentraciones microbiológicas de Salmonella spp. en carnes de pollo, destacando los mercados de la región de Tumbes con mínimos de 220.29 NMP/g hasta 1417.97 NMP/g y con el 100% de contaminación de todos sus puestos evaluados. Por otro lado, para las carnes de cerdo de los mercados de la región de Junín reportó entre los 3.1 NMP/g hasta los 82.33 NMP/g de concentración microbiológica con un 34% de contaminación de todos sus puestos evaluados. Es posible, que esta contaminación se haya dado, una más que en otras, debido al mal uso de los utensilios (cuchillos, tablas de picar en su mayoría de madera, jabas, estropajos, ganchos y otros), indumentarias (guardapolvos, guantes sucios, chompas oscuras grasosas), venta de otras especies cárnica en el mismo puesto (pollo más cerdo además de carnes res o camélido), carnes de origen clandestino (uso y re-uso de las aguas, ambientes antihigiénicos, etc), uso de aguas no potabilizadas para el lavado de sus mesas y herramientas de trabajo y anegamiento de las calles de ingreso al mercado con aguas servidas (este último, visto en la provincia de Tumbes).
56 4. Entre los métodos de cuantificación, la más destacada fue el método
tradicional respecto al método molecular qPCR, al menos para el caso de aislamiento de Salmonella spp. en carnes de pollo y cerdos. Este método, permitió determinar las condiciones insalubres que se viene comercializando las distintas carnes en los distintos mercados del país. Por otro lado, respecto a los patógenos Campylobacter spp y Escherichia coli O157:H7, no fue posible ser aislado, probablemente porque las carnes estaban libres de estos patógenos. La evaluación qPCR prueba molecular, no fue lo esperado, debido a que nos reportó varios falsos negativos comparado a la prueba tradicional. Es posible que, durante el desarrollo del proyecto, este método pueda mejorar especialmente en el campo de inhibidores, basura genética y otros, que no ayudaron a cristalizar esta prueba.
5. En cada región, la especie cárnica con mayor contaminación fue: la carne de pollo. Siendo uno de los alimentos con mayor demanda respecto a la carne de cerdo y de res. A fin de conocer la voluntad de cambio al menos para la parte sanitaria de los alimentos cárnicos, los administradores de cada mercado evaluado de las regiones de Tumbes (provincia de Tumbes) y Lima (provincia de Huaral), no fueron posibles ser entrevistados debido a la incertidumbre del aislamiento social (covid19). Sin embargo, los administradores de los mercados de la provincia de Huancayo, mencionaron que, con el respeto a los estatutos y reglamento institucional que cada mercado posee, apoyo profesional de la municipalidad, DIRESA y fiscalía en prevención del delito; es posible llegar a lo exigido por la normativa.
57 RECOMENDACIONES
1. Realizar nueva evaluación a los mercados mencionados, a fin de obtener un resultado probablemente diferente debido al momento (tiempo) que fue colectado las muestras. La falta de puestos de venta al momento de la colecta de muestras, probablemente se debió a las restricciones sanitarias COVID19 dadas por el gobierno en su momento, o existió pocos puestos de venta al momento de colectar la carne elegida.
2. La cuantificación de Salmonella spp. según ISO con el método tradicional es eficaz. Pero debido a su poca factibilidad por situaciones económicas, tiempo y personal especializado, se puede utilizar como indicador microbiológico a los mesófilos aerobios (cuantificaciones). Esta prueba además de la prueba sensorial, puede ser útil para los diferentes inspectores sanitarios dedicados a la mejora de la calidad de los alimentos, siempre en cuando se considere el tipo de carne (pollos o cerdos).
58 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Acha PN & Szyfres B. (2003). Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al hombre y a los animales (Organizacion Panamericana de la Salud (ed.); 3°
edicion). Publicacion cientifica y tecnica N°580.
Ameer, M. A., Wasey, A., & Salen, P. (2018). Escherichia Coli (E Coli 0157 H7). In StatPearls. StatPearls Publishing. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29939622 B. Malorny P. Fach, C. Bunge, A. Martin and R. Helmuth, E. P., Malorny, B.,
Paccassoni, E., Fach, P., Bunge, C., Martin, A., Helmuth, R., & Aliments, S.
(2004). Diagnostic Real-Time PCR for detection of Salmonella in food. Applied and Environmental Microbiology, 70(12), 7046–7052.
https://doi.org/10.1128/AEM.70.12.7046
Balakrishnan, B., Barizuddin, S., Wuliji, T., & El-Dweik, M. (2016). A rapid and highly specific immunofluorescence method to detect Escherichia coli O157: H7 in infected meat samples. International Journal of Food Microbiology, 231, 54–62.
https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2016.05.017
Bruyand, M., Mariani-Kurkdjian, P., Gouali, M., de Valk, H., King, L. A., Le Hello, S., Bonacorsi, S., & Loirat, C. (2018). Hemolytic uremic syndrome due to Shiga toxin-producing Escherichia coli infection. Medecine et Maladies Infectieuses, 48(3), 167–174. https://doi.org/10.1016/j.medmal.2017.09.012
Costa, D., & Iraola, G. (2019). Pathogenomics of emerging Campylobacter species.
Clinical Microbiology Reviews, 32(4), 1–24.
https://doi.org/10.1128/CMR.00072-18
Dgesep-deia, M. (2021). Producción y comercialización de productos avícolas.
Mes : Noviembre 2021. Ministerio de Desarrollo Agrario y Riego.
https://apa.org.pe/2021/11/15/produccion-comercializacion-de-productos- avicolas-noviembre-2021/
Dhanoa, A., & Fatt, Q. K. (2009). Non-typhoidal Salmonella bacteraemia:
Epidemiology, clinical characteristics and its’ association with severe immunosuppression. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 8, 15.
https://doi.org/10.1186/1476-0711-8-15
Easton, L. (1997). Escherichia Coli O157: Occurrence, Transmission and Laboratory Detection - PubMed. Br J Biomed Sci.
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9167308/
Fàbrega, A., & Vila, J. (2013). Salmonella enterica serovar Typhimurium skills to succeed in the host: Virulence and regulation. Clinical Microbiology Reviews, 26(2), 308–341. https://doi.org/10.1128/CMR.00066-12
FDA. (2000). BAM Chapter 7: Campylobacter. U.S. FOOD & DRUG Administration.
https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-7- campylobacter
FDA. (2020). BAM Chapter 4A: Diarrheagenic Escherichia coli.
https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bacteriological-analytical- manual-bam
Fratamico, P. M., & Strobaugh, T. P. (1998). Simultaneous detection of Salmonella
59 spp and Escherichia coli 0157:H7 by multiplex PCR. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 21(3), 92–98.
https://doi.org/10.1038/sj.jim.2900520
Friedmann, H. C. (2006). Escherich and Escherichia. Advances in Applied Microbiology, 60(06), 133–196. https://doi.org/10.1016/S0065-2164(06)60005-1 Gannon, V. P. J., D’Souza, S., Graham, T., King, R. K., Rahn, K., & Read, S. (1997).
Use of the flagellar H7 gene as a target in multiplex PCR assays and improved specificity in identification of enterohemorrhagic Escherichia coli strains.
Journal of Clinical Microbiology, 35(3), 656–662.
https://doi.org/10.1128/jcm.35.3.656-662.1997
García-Sánchez, L., Melero, B., & Rovira, J. (2018). Campylobacter in the Food Chain. Advances in Food and Nutrition Research, 86, 215–252.
https://doi.org/10.1016/bs.afnr.2018.04.005
Greig, J. D., Todd, E. C. D., Bartleson, C., & Michaels, B. (2010). Infective Does and Pathogen Carriage. Public Health Agency of Canada.
https://www.fsis.usda.gov/shared/PDF/Atlanta2010/Slides_FSEC_JGreig_Dos es.pdf?redirecthttp=true
Hung, Y. T., Lay, C. J., Wang, C. L., & Koo, M. (2017). Characteristics of nontyphoidal Salmonella gastroenteritis in Taiwanese children: A 9-year period retrospective medical record review. Journal of Infection and Public Health, 10(5), 518–521. https://doi.org/10.1016/j.jiph.2016.09.018
INCORE. (2021). Índice de Competitividad Regional 2021. Instituto Peruano de Economia IPE.
Kaakoush, N. O., Castaño-Rodríguez, N., Man, S. M., & Mitchell, H. M. (2015). Is Campylobacter to esophageal adenocarcinoma as Helicobacter is to gastric adenocarcinoma? Trends in Microbiology, 23(8), 455–462.
https://doi.org/10.1016/j.tim.2015.03.009
Kaakoush, N. O., Castaño-Rodríguez, N., Mitchell, H. M., & Man, S. M. (2015).
Global epidemiology of campylobacter infection. Clinical Microbiology Reviews, 28(3), 687–720. https://doi.org/10.1128/CMR.00006-15
Khan, C. M. A. (2014). The Dynamic Interactions between Salmonella and the Microbiota, within the Challenging Niche of the Gastrointestinal Tract.
International Scholarly Research Notices, 2014.
https://doi.org/10.1155/2014/846049
Kitaichi, K., Nakayama, H., Ueyama, J., Nadai, M., Baba, K., Takagi, K., Takagi, K., Ohta, M., & Hasegawa, T. (2004). Down-regulation of cytochrome P450 proteins and its activities by Shiga-like toxin II from Escherichia coli O157:H7.
Biochemical Pharmacology, 67(8), 1427–1435.
https://doi.org/10.1016/j.bcp.2003.12.009
La Ragione, R. M., Best, A., Woodward, M. J., & Wales, A. D. (2009). Escherichia coli O157:H7 colonization in small domestic ruminants. In FEMS Microbiology Reviews (Vol. 33, Issue 2, pp. 394–410). Oxford Academic.
https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2008.00138.x
60 Ley_N°1062. (2008). Ley de inocuidad de los alimentos.
Man, S. M. (2011). The clinical importance of emerging Campylobacter species.
Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology, 8(12), 669–685.
https://doi.org/10.1038/nrgastro.2011.191
Markey, B., Leonard, F., Archambault, M., Cullinane, A., & Maguire, D. (2013).
CLINICAL VETERINARY MICROBIOLOGY (Second Edi). MOSBY ELSEVIER.
Mcsorley, S. J. (2014). Immunity to intestinal pathogens: Lessons learned from Salmonella. In Immunological Reviews (Vol. 260, Issue 1, pp. 168–182).
Blackwell Publishing Ltd. https://doi.org/10.1111/imr.12184
Méndez, C. R., Vergaray, G., Morante, H. Y., Flores, P. R., & Gamboa, R. A. (2013).
Aislamiento y caracterización de Escherichia coli O157 : H7 a partir de carne molida de bovino en Lima-Perú. Rev.Peru.Biol., 20(December), 159–164.
MIDAGRI. (2021). Al 2021 se espera incrementar a 10 kilos el consumo per cápita de carne cerdo. Ministerio de Agricultura y Riego.
https://www.gob.pe/institucion/midagri/noticias/5691-al-2021-se-espera- incrementar-a-10-kilos-el-consumo-per-capita-de-carne-cerdo
MINAGRI-DGPA. (2020). Panorama y perspectivas de la produción de carne de cerdo en el Perú. Ministerio De Agricultura Y Riego, 1, 22.
http://repositorio.midagri.gob.pe:80/jspui/handle/MIDAGRI/721
MINSA-dge. (2019). Boletin epidemiologico del Perú. MINSA, 28(42), 1069–1071.
www.dge.gob.p
Newell, D. G., Mughini-Gras, L., Kalupahana, R. S., & Wagenaar, J. A. (2017).
Campylobacter epidemiology-sources and routes of transmission for human infection. In Campylobacter: Features, Detection, and Prevention of Foodborne Disease. Elsevier Inc. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-803623-5.00005-8 OMS. (2015). Informe de la OMS señala que los niños menores de 5 años
representan casi un tercio de las muertes por enfermedades de transmisión
alimentaria. OMS; World Health Organization.
https://www.who.int/es/news/item/03-12-2015-who-s-first-ever-global- estimates-of-foodborne-diseases-find-children-under-5-account-for-almost- one-third-of-deaths
Ørskov, F., & Ørskov, I. (1984). 2 Serotyping of Escherichia coli. Methods in Microbiology, 14(C), 43–112. https://doi.org/10.1016/S0580-9517(08)70447-1 Oyarzabal, O. A., & Carrillo, C. D. (2017). Isolation, identification, and typing of
campylobacter strains from food samples. In Campylobacter: Features, Detection, and Prevention of Foodborne Disease (Issue 1). Elsevier Inc.
https://doi.org/10.1016/B978-0-12-803623-5.00004-6
PAHO. (2015). Peligros biológicos. Pan American Health Organization.
https://www.paho.org/hq/index.php?option=com_content&view=article&id=108 38:2015-peligros-biologicos&Itemid=41432&lang=en
Platts-Mills, J. A., Liu, J., Gratz, J., Mduma, E., Amour, C., Swai, N., Taniuchi, M., Begum, S., Yori, P. P., Tilley, D. H., Lee, G., Shen, Z., Whary, M. T., Fox, J. G., McGrath, M., Kosek, M., Haque, R., & Houpt, E. R. (2014). Detection of
61 Campylobacter in stool and determination of significance by culture, enzyme immunoassay, and PCR in developing countries. Journal of Clinical Microbiology, 52(4), 1074–1080. https://doi.org/10.1128/JCM.02935-13
Pulido-landínez, M. (2019). Food safety - Salmonella update in broilers. Animal Feed Science and Technology, 250(September 2018), 53–58.
https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2019.01.008
Quino, W., Castro, J. C., Mestanza, O., Hurtado, C. V, Zamudio, M. L., & Gavilan, R. G. (2020). Phylogenetic structure of Salmonella Enteritidis provides context for a foodborne outbreak in Peru. Scientific Reports, 1–6.
https://doi.org/10.1038/s41598-020-78808-y
Rantsiou, K., Lamberti, C., & Cocolin, L. (2010). Survey of Campylobacter jejuni in retail chicken meat products by application of a quantitative PCR protocol.
International Journal of Food Microbiology, 141(SUPPL.), 1–18.
https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2010.02.002
Razmi, N., Hasanzadeh, M., Willander, M., & Nur, O. (2020). Recent Progress on the Electrochemical Biosensing of Escherichia coli O157:H7: Material and
Methods Overview. Biosensors, 10(5), 1–18.
https://doi.org/10.3390/bios10050054
RM.N°591-MINSA. (2008). Criterios microbiologicos de calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano. Ministerio de Salud, 8.
Rönnqvist, M., Välttilä, V., Ranta, J., & Tuominen, P. (2017). Salmonella risk to consumers via pork is related to the Salmonella prevalence in pig feed. Food Microbiology, 1–5. https://doi.org/10.1016/j.fm.2017.03.017
Ruiz-Roldán, L., Martínez-Puchol, S., Gomes, C., Palma, N., Riveros, M., Ocampo, K., Durand, D., Ochoa, T. J., Ruiz, J., & Pons, M. J. (2018). PRESENCIA DE Enterobacteriaceae y Escherichia coli MULTIRRESISTENTE A ANTIMICROBIANOS EN CARNE ADQUIRIDA EN MERCADOS TRADICIONALES EN LIMA. Rev Peru Med Exp Salud Publica, 35(3), 425–
432. https://doi.org/10.17843/rpmesp.2018.353.3737.425
Samanta, I., & Samiran Bandyopadhyay. (2020). Campylobacter. Antimicrobial Resistance in Agriculture, 241–251. https://doi.org/10.1016/B978-0-12- 815770-1.00019-5
Vadillo, S., Píris, S., & Yanes, E. (2002). MANUAL DE MICROBIOLOGIA VETERINARIA (Mc GRAW HILL INTERAMERICANA (ed.)). Mc GRAW HILL INTERAMERICANA.
Vásquez-Ampuero, Juan M., & Tasayco-Alcántara, W. R. (2020). Presencia de patógenos en carne cruda de pollo en centros de expendio, Huánuco-Perú: una problemática en salud. Selva Andina Research Society.
https://www.redalyc.org/journal/3613/361364361012/html/
Vásquez-Ampuero, Juan Marco, & Tasayco-Alcántara, W. R. (2020). Presencia de patógenos en carne cruda de pollo en centros de expendio, Huánuco-Perú.
Journal of the Selva Andina Research Society, 11(2), 130–141.
https://doi.org/10.36610/j.jsars.2020.110200130
62 WHO. (2010). WHO Global Foodborne Infections Network. Global Foodborne
Infections Network, February, 1–45.
WHO. (2021). World Health Statistics. THE GLOBAL HEALTH OBSERVATORY.
https://www.who.int/data/gho/publications/world-health-statistics
York, M. K., Baron, E. J., Clarridge, J. E., Thomson, R. B., & Weinstein, M. P. (2000).
Multilaboratory validation of rapid spot tests for identification of Escherichia coli.
Journal of Clinical Microbiology, 38(9), 3394–3398.
https://doi.org/10.1128/jcm.38.9.3394-3398.2000
63 ANEXOS
Figura 5.
Estructuración de Proceso Salmonella spp. y mesófilos aerobio.
Figura 6.
Reacción Salmonella spp a diferentes medios y enumeración según ISO
Figura 7.
Agar R&F Salmonella. Foto “A” parecido, Foto “B” Salmonella positivo.
A
mpn(positive = c(3, 3, 3, 2), tubes = c(3, 3, 3, 3), amount = c(.1, .02, .004, .0008)) = 1417.978
B
C
Figura 8.
Comportamiento de Salmonella spp en el agar R&F Salmonella y XLD y sus resultados bioquímicos positivos.
Figura 9.
Controles Positivos de Campylobacter spp y una Muestra Visto Por Estereoscopio.
Positivo – C. Jejuni
Positivo – C. Coli
Muestra
Figura 10.
Protocolo Campylobacter spp.
Figura 11.
Muestras H140 Positivo a Campylobacter spp. con aceite de inmersión y a 100x
Figura 12.
Agar CT-SMAC (colonias beige) y Agar R&F E.coli O157:H7
A B
Figura 13.
Protocolo Escherichia coli O157:H7
Figura 14.
Resultados Prueba Indol y Latex
∑ 𝑐𝑐
𝑣𝑣 ∗1.1∗ 𝑑𝑑 = 159
1𝑚𝑚𝑚𝑚 ∗1.1∗10−6 = 159
1.1∗0.000001 =
159 0.0000011
= 144 545 454
Figura 15. Contabilización de Mesófilos aerobios según formula.
Tabla 12.
Protocolo General Para la Extracción de ADN Bacteriano
EXTRACCIÓN MANUAL DE ÁCIDO NUCLEICO (ADN / ARN) VIRAL, BACTERIANO Y MICÓTICO A PARTIR DE FLUIDO ORGÁNICO O MEDIO DE
TRANSPORTE
Manual isolation of viral and pathogen nucleic acid (RNA and DNA) from biofluids and transport media (A42356)
MagMAX™ Viral/Pathogen Ultra Nucleic Acid Isolation Kit
DESCRIPCIÓN DEL KIT:
The Applied Biosystems™ MagMAX™ Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit ha sido desarrollado para la cuantificación y purificación rápida de ácido nucleico (ADN / ARN) viral, bacteriano y micótico a partir de fluido
orgánico o medio de transporte. El ácido nucleico purificado obtenido puede ser utilizado para diversas aplicaciones de biología molecular, como qPCR en tiempo real, RT-PCR en tiempo real y secuenciamiento.
COMPONENTE CANTIDAD ALMACENAMIENTO
Binding
Solution 53 mL.
15 - 25°C
Dynabeads® 2 mL.
Elution Solution 10 mL.
Proteinase K 1 mL.
Wash Buffer 100 mL.
Enzyme Mix 5 mL. -25 - -15°C
REGLAS GENERALES:
Realizar todo el procedimiento de extracción de ácido nucleico a temperatura ambiente (20-25°C).
Antes del primer del uso del kit, preparar etanol 80° a partir de etanol absoluto molecular y agua libre de nucleasas. Es necesario considerar que se utilizará 1500 μL. por cada muestra.
En caso se produzca la formación de precipitado en Binding Solution, debido a una temperatura ambiente demasiado fría, se deberá calentar el reactivo a 37°C durante 5 minutos y homogenizarlo manualmente
invirtiéndolo con cuidado evitando la formación de burbujas.
El volumen de partida es de 200 μL. (100 μL. de muestra + 100 μL. de agua libre de nucleasas).
PREPARACIÓN DE BINDING BEAD MIX.
Vortexear los Dynabeads® a velocidad máxima hasta resuspender y homogenizar el sedimento.
Preparar el Binding Bead Mix para el número de muestras programadas a procesar de acuerdo al siguiente cuadro:
COMPONENTE VOLÚMEN POR
MUESTRA
Binding Solution 265 μL.
Dynabeads® 10 μL.
VOLÚMEN TOTAL POR MUESTRA 275 μL.
En el caso de procesar más de una muestra, se deberá incluir un excedente del 10% al preparar el Binding Bead Mix.
Homogenizar el Binding Bead Mix manualmente invirtiéndolo con cuidado 10 veces. Almacenar a temperatura ambiente hasta el procesamiento inmediato de las muestras.
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA:
1. DIGESTIÓN ARTIFICIAL CON ENZYME MIX.
1.1. Vortexear la muestra (vial con medio de cultivo) para homogenizarla y transferir 100 μL. a un vial Eppendorf (1.5 mL.) (1)* nuevo.
Adicionalmente, agregar 100 μL. de agua libre de nucleasas al vial Eppendorf (1.5 mL.) (1)*. Por otra parte, agregar 200 de agua libre de nucleasas a otro vial Eppendorf (1.5 mL.) nuevo (control negativo).
A partir de esta indicación, el vial Eppendorf (1.5 mL.) (1)* será denominado
“muestra”.
1.2. Homogenizar manualmente el Enzyme Bead Mix invirtiendo con cuidado 5 veces y agregar 50 μL. a la muestra. Inmediatamente después del uso del Enzyme Mix, almacenarlo a temperatura de congelación.
Debido a la elevada densidad del reactivo, es necesario pipetear lentamente y no reutilizar la punta con el objetivo de extraer el volumen exacto.
1.3. Aplicar las siguientes condiciones:
1° Agitar a 1050 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.
2° Incubar a 65°C durante 15 minutos.
3° Agitar a 1050 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.
2. DIGESTIÓN ARTIFICIAL CON PROTEINASE K.
2.1. Homogenizar manualmente la Proteinase K invirtiendo con cuidado 5 veces y agregar 10 μL. a la muestra.
Debido a la elevada densidad del reactivo, es necesario pipetear lentamente y no reutilizar la punta con el objetivo de extraer el volumen exacto.
2.2. Homogenizar manualmente los Dynabeads® realizando movimientos circulares y agregar 20 μL. a la muestra.
2.3. Homogenizar manualmente el Binding Solution invirtiendo con cuidado 5 veces y agregar 530 μL. a la muestra.
Debido a la elevada densidad del reactivo, es necesario pipetear lentamente y no reutilizar la punta con el objetivo de extraer el volumen exacto.
2.4. Aplicar las siguientes condiciones:
1° Agitar a 1050 rpm durante 2 minutos a temperatura ambiente.
2° Incubar a 65°C durante 5 minutos.
3° Agitar a 1050 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.
2.5. Colocar la muestra en la rejilla del imán DynaMag ™ -2 en reposo
durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante con la pipeta. Evitar alterar los Dynabeads®.
3. LAVADO DE Dynabeads®.
3.1. Retirar la muestra de la rejilla del imán DynaMag ™ -2.
3.2. Homogenizar manualmente el Wash Buffer invirtiendo con cuidado 5 veces y agregar 1000 μL. a la muestra.
Debido a la elevada densidad del reactivo, es necesario pipetear lentamente y no reutilizar la punta con el objetivo de extraer el volumen exacto.
3.3. Agitar la muestra a 1050 rpm durante 1 minuto a temperatura ambiente.
3.4. Colocar la muestra en la rejilla del imán DynaMag ™ -2 en reposo durante 2 minutos. Eliminar el sobrenadante con la pipeta. Evitar alterar los Dynabeads®.
3.5. Retirar la muestra de la rejilla del imán DynaMag ™ -2.
3.6. Agregar 1000 μL. de etanol 80° a la muestra.
3.7. Agitar la muestra a 1050 rpm durante 1 minuto a temperatura ambiente.
3.8. Colocar la muestra en la rejilla del imán DynaMag ™ -2 en reposo durante 2 minutos. Eliminar el sobrenadante con la pipeta. Evitar alterar los Dynabeads®.
3.9. Retirar la muestra de la rejilla del imán DynaMag ™ -2.
3.10. Agregar 500 μL. de etanol 80° a la muestra.
3.11. Agitar la muestra a 1050 rpm durante 1 minuto a temperatura ambiente.
3.12. Colocar la muestra en la rejilla del imán DynaMag ™ -2 en reposo durante 2 minutos. Eliminar el sobrenadante con la pipeta. Evitar alterar los Dynabeads®.
3.13. Agitar la muestra destapada a 1050 rpm durante 2 minutos a temperatura ambiente.
4. ELUCIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO.
4.1. Homogenizar manualmente el Elution Solution invirtiendo con cuidado 5 veces y agregar 50 - 100 μL. a la muestra.
4.2. Aplicar las siguientes condiciones:
1° Agitar a 1050 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.
2° Incubar a 65°C durante 10 minutos.
3° Agitar a 1050 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.
4.3. Colocar la muestra en la rejilla del imán DynaMag ™ -2 en reposo durante 3 minutos. Extraer el sobrenadante (ácido nucleico) con la pipeta. Evitar alterar los Dynabeads®.
4.4. Transferir el sobrenadante (ácido nucleico) a un vial Eppendorf (1.5 mL.) (2)* nuevo y cerrar de inmediato para evitar la evaporación.
LA MUESTRA DE ÁCIDO NUCLEICO PURIFICADO ESTÁ LISTA PARA SU USO DE INMEDIATO.
5. MANTENER LA MUESTRA A -20°C PARA SU CONSERVACIÓN.
Para iniciar la PCR cuantitativa en tiempo real, es necesario descongelar la muestra de ácido nucleico a temperatura ambiente y almacenarla inmediatamente después de su uso en el rack de congelación.
La elevada concentración de Dynabeads® en la muestra de ácido nucleico puede afectar negativamente el rendimiento de la PCR cuantitativa en tiempo real.
* El número entre paréntesis indica la cantidad de viales Eppendorf (1.5 mL.) que se utilizaron por cada muestra.