Por cada toma de muestra se utilizó el aplicativo Epicollect5, donde se registró la geolocalización, fotografía y hora de adquisición (ver anexo, Figura 17).
Se utilizó el mismo empaque con que el comerciante despachaba las carnes.
Fueron rotuladas según procedencia de la siguiente manera: H (mayúscula) para Huancayo, hl (minúscula) para Huaral y T (mayúscula) para Tumbes.
Seguidamente, se llevó a una caja conservadora de frio donde se incorporó termómetro marca TempTale Ultra que tiene la característica de registrar la temperatura en formato PDF desde el momento que se activa (salida) hasta el momento de llegada (ver anexo Figura 16).
2.5.2. Para Aislar Y Cuantificar Aerobios Mesófilos.
Se desarrolló de acuerdo a recomendación ISO 4833-1:2013. Para ello, se hizo un seriado hasta 10-7, se rotuló y se vertió 9 ml a partir de la dilución 10-2 hasta el último. Luego, se pesó 25 g de muestra y mezcló con 225 ml de agua peptonada al 10%, agitó por 2 minutos y vertió 10 ml al tubo 10-1. Ésta dilución se agitó nuevamente y transfirió 1 ml al tubo 10-2 luego al tubo 10-3 y así hasta la última dilución. Al mismo tiempo, se vertió 1 ml a sus correspondientes placas petri desde la dilución menor al mayor. Por otro lado, previa auto clavada del agar standard plate count (PCA) se temperó a 45°C y mantuvo en baño maría hasta que frente a un mechero se vertió a las placas inoculadas, se agitó en forma horaria y anti horaria, dejó enfriar y se condujo a incubar a 30°C por 72 horas. Concluido el tiempo de incubación, se seleccionó las diluciones que tuvieran entre 10 – 300 colonias, se contabilizó en placa con apoyo de un plumón y remplazó valores de acuerdo a la fórmula (ver anexo Figura 15):
∑ 𝑐𝑐
𝑣𝑣 ∗ 1.1 ∗ 𝑑𝑑
31
c
= Suma de colonias de dos placas de diluciones sucesivas, las cuales al menos una contiene un mínimo de 10 colonias.v
= Volumen de inóculo colocado en cada placa petri, en mililitros.d
= Factor de la dilución correspondiente a la primera dilución retenida.2.5.3. Para Aislar y Cuantificar Salmonella spp.
Igual que la anterior, se siguió las recomendaciones del ISO 6579-1: 2017 para su detección e ISO/TS 6579-2:2012 para su enumeración mediante la técnica de NMP miniaturizado. Para ello, se utilizó 25 g de muestras de carnes además de 225 ml de agua peptonada tamponado 10%, se agitó por 2 minutos y obtuvo la dilución inicial (10-1). Seguidamente se dividió el procedimiento en dos formas: la primera, para el método molecular con enriquecimiento y sin enriquecimiento. El
“sin enriquecimiento”, consistió en separar una alícuota de 40 ml en tubo Falcon e inmediatamente congelarlo y el “con enriquecimiento” otra alícuota en tubo Falcon para incubarlo junto a las muestras del método tradicional. La segunda forma, fue realizar el método tradicional iniciando el rotulado de 12 tubos (cuatro triplicados) de forma que se serió 10-1 – 10-4. Al primer seriado se hizo una alícuota de 2.5 de la solución inicial, mientras que a las diluciones 10-2 hasta la 10-4 se vertió 2 ml de agua peptonado tamponada. En seguida, previa agitación, se transfirió 500μl de la dilución 10-1 a la 10-2 y de ésta a la siguiente hasta la última dilución. Terminada el procedimiento se incubó por 18 h ± 2h a 37°C, para su pre-enriquecimiento.
Seguidamente, se transfirieron a dos formas: la primera, para realizar diluciones cuantitativas con 20μL y la segunda para inocular con 100 μL a placas petris consideradas cualitativas. Al agar semisólido de Rappaport-Vassiliadis (MRSV) (preparadas anteriormente con 2 ml de éstas a microplacas de 12 pocillos), fueron transferidos 20 µL entre sus correspondientes pocillos. Así mismo, sobre el agar semisólido MRSV en placa Petri se vertió una alícuota de 100 µL proveniente del tubo Falcon incubado, la que se distribuyó en tres puntos equidistantes y condujo a incubación por 24h ± 3h a 41.5°C. Las colonias sospechosas (halo blanquecino o gris) se transfirieron con un ansa y frente al mechero al agar desoxicolato de xilosa y lisina (XLD) y agar R&F salmonella (no tifoidea). Luego se incubó a 35°C por 24h ± 3h al que después se buscó las colonias típicas (en el XLD rojo a amarillo con centros de color negro y coloración rosada en el agar, lo mismo en el R&F colonias rosadas); para transferirlo a la evaluación bioquímica entre el TSI, agar
32 urea y L-lisina por 24h ± 3h a 37°C (ver anexo Figura 5 y Figura 6). Los pocillos positivos fueron identificados, contabilizados horizontalmente y subido al programa Rcomander para su enumeración en NMP/g de la siguiente manera:
mpn(positive = c(1, 0, 0, 0), tubes = c(3, 3, 3, 3), amount = c(.1, .02, .004, .0008)) Donde:
Positivo c = número de pocillos detectados.
Tubos c = número de pocillos por dilución.
Diluciones c = fracciones decimales de la muestra.
2.5.4. Para Aislar y Cuantificar Campylobacter spp.
Se respetó las recomendaciones del ISO 10272-2:2017 con sembrado directo en placa. Para ello se inició homogenizando por dos minutos, 25 g de muestra de piel del cuello de pollo en 225 ml de agua peptonada al 1% y obtener la solución inicial (10-1). Seguidamente se hizo una alícuota de 40 ml en tubos Falcon para inmediatamente congelarlo y llevar posteriormente a la prueba molecular. Por otro lado, se separó una alícuota de 10 ml de la dilución inicial e hizo diluciones hasta 10-3. Se agitó los tubos y con el uso de una pipeta se transfirió 1ml a las diluciones correspondientes (ver anexo Figura 10). También se rotuló las placas preparadas con agar Desoxicolato-Cefoperazona-Carbón modificado (mCCD) y agar Campylobacter con 10% sangre ovina y vertió 100μl de las diluciones preparadas por duplicado solo a la primera dilución 10-1, se distribuyó con asa Digralsky en L, luego a la segunda y a la tercera de sus diluciones correspondientes.
Seguidamente, se acondicionaron las placas en jarras microaerobias con sachet CampyGenTM además de unas gotas de glicerina sobre un papel y condujeron a incubación de 41.5°C por 44 horas. Al terminar este procedimiento, se seleccionaron las placas que tuvieran colonias traslucidas (forma de rocío) grises y brillosas de entre 500 μm a 1mm aproximadamente (solo observable a estereoscopio) e inmediatamente se realizó la tinción Gram y observación con aceite de inmersión (ver anexo Figura 11). Las placas sospechosas se separaron y realizaron la contabilidad de entre 15 a 150 UFC. Al tener a estas sospechosas se cultivaron en agar Columbia con 5% de sangre ovina a temperatura de 41.5°C por 44 horas para confirmar nuevamente la morfología (prueba Gram) (ver anexo Figura 9 y Figura 11), motilidad en solución salina 0.85%, crecimiento micro aerobio a 25°C y aerobio a 41.5°C y finalmente con la prueba oxidasa.
33 2.5.5. Para Aislar y Cuantificar Escherichia coli O157:H7
Este procedimiento se hizo con el método sembrado directo en placa. Para ello, se pesó 25 g de carne de res y mezcló con 225 ml caldo R&F E.coli O157:H7, la que previo masaje por 2 minutos se obtuvo la solución inicial 10-1. Usando una pipeta se realizó una alícuota de 10 ml en dos tubos de los cuales uno de los tubos se destinó para la cuantificación y el otro para separación inmunomagnetica (cualitativo). Así mismo, se hizo una alícuota de 40 ml en tubo Falcon para realizar PCR a lo que junto a los tubos destinados para la cuantificación fueron incubados a 37°C por 18 horas. Mientras, el tubo separado para procesar el aislamiento cualitativo se desarrolló de la siguiente manera: se colocó en un rack 4 microtubos, etiquetó e hizo diluciones seriadas hasta 10-4 donde el primero fue para la dilución inicial 10-1 y los tres restantes vertido con 900μl de solución peptona sal. A la primera dilución (10-1) se vertió 20 μL de Dynabeads® anti – E. coli O157 seguido de 1 ml de la dilución inicial (tubo de 10ml agitado). Seguidamente al microtubo se le agitó suavemente por 10 minutos en forma separada y se le incrustó a la placa magnética DynaMagTM-2. En ella, se le agitó nuevamente por 10 minutos y se le extrajo el sobrenadante para ser remplazado y lavado con 1 ml de la solución phosphate buffered saline (PBST), siendo después retirado de la placa magnética y agitado por otros 10 minutos (se repite por tres veces este procedimiento).
Seguidamente se vertió 900 μl a los microtubos rotulados 10-2 hasta la 10-4 y se transfirió 100 µl a la dilución 10-2 y de éstaa la siguiente hasta llegar al último tubo.
Una vez preparado estas diluciones, se rotuló el código de la muestra en la placa de los agares MacConkey-Sorbitol (CT-SMAC) y cromogénico R&F E.coli O157:H7 y se transfirió 100 μL de estas diluciones a sus correspondientes agares a los mismos que se expandió con asa triangular metálico cauterizado en el mechero.
Importante: considere un control positivo hasta el final de la prueba. Se incubó a 35°C por 22 horas. Luego, con ayuda del estereoscopio se buscó la colonia sospechosa en el agar CT-SMAC de color beige o incoloro (ver anexo Figura 12A) y azul oscuro o negruzco en el agar R&F E.coli O157:H7 (ver anexo Figura 12B) con diámetros entre 1.5 a 2.0mm. Estas colonias son transferidas por agotamiento al agar SMAC y también al agar R&F (reconfirmatorio) y se condujeron a incubación por 22 horas a 35°C. Seguidamente fueron sometidas a pruebas bioquímicas solo con los resultados del agar SMAC (libre de antibióticos). Prueba MUG con el Kit de identificación rápida Bactiden® E. coli que consistió en verter a su pocillo
34 (cuadrado) 200μL de agua destilada autoclavada y dentro de ella verter con el ansa aséptica las colonias encontradas en el agar SMAC, se le colocó la tira reactiva hasta la base del pocillo y selló la boca con parafina. Seguidamente, se condujo a incubación por 2 horas a 37°C y observó en un espacio oscuro la “no-luminiscencia”
a la lámpara UV 366 nm (si emite luminiscencia entonces la muestra tiene β - D – glucuronidasa y es una E. coli genérica). Si era negativa a MUG, se realizó a la prueba INDOL con el reactivo KOVACS, que de ser positivo (color rojo) se hizo la prueba de aglutinación con Remel™ RIM E. coli O157:H7 Latex Test, la que debe presentar aglutinación si es del antígeno O157, si continuaba estos resultados a la prueba siguiente fue con látex H7 la que debe ser positiva (ver anexo Figura 14).
2.5.6. Técnica Molecular
Se procedió a realizar este procedimiento siempre en cuando el método tradicional llegara a detectar patógeno sospechoso y pueda realizar su cuantificación. Consistió en realizar la preparación, extracción y su amplificación de cada muestra procesada del método tradicional a fin de contrastar la efectividad.
2.5.7. Purificación y Extracción De La Muestra
a) Muestra Inicial. Se considera muestra inicial a aquellos tubos Falcon etiquetadas con las letras “A”, a la que se consideró sin enriquecimiento (no incubadas); y la letra “B”, las muestras con enriquecimientos (incubadas por 18hrs), ambas congeladas a temperaturas por debajo de 22°C.
b) Ruptura De La Pared Bacteriana y Liberación Del Núcleo Celular. Se descongeló a temperatura ambiente (18°C), se agitó y extrajo con apoyo del pipeteador Eppendorf una alícuota de 100μL en micro tubos A y B para luego agregar 100 μL de agua libre de nucleasas a cada uno y verter 50uL de Enzyme Mix que incluye las perlas magnéticas del Dynabeads (ver anexo Tabla 12).
c) Ruptura de la membrana nuclear. Seguidamente se vertió 5 μL de la enzima Proteinaze K, a fin de liberar el ADN celular, para ello se agitó, condujo al termo bloque y colocó en la rejilla DynaMag ™-2 (en ella puede acompañar muchas bacterias comprometidas por lo que no se considera netamente puras) ver procedimientos del anexo Tabla 12.
d) Primer Lavado Del Dynabeads Y Separación Magnética. El principal objetivo es capturar la mayor cantidad de ADN capturadas en las perlas magnéticas. Al ser ésta de carga negativa (fosfatos que forman parte del nucleótido quedan dispuestos hacia el exterior de la doble hélice) son atraídas al imán
35 DynaMag™-2 y el sobrenadante purgada mediante pipeta. Seguir los procedimientos del anexo Tabla 12.
e) Segundo Lavado Del Dynabeads Con Etanol 80°. Este procedimiento al igual que la anterior tiene la finalidad de seguir lavando la muestra separando del imán, agitándolo y nuevamente colocando al imán para luego retirar el sobrenadante de modo que quede solo las perlas magnéticas.
f) Elución Del Ácido Nucleico. Finalmente, utilizando 50 μL de Elution Solution se diluye las perlas a fin de separar el ADN adherida y con una pipeta el líquido conteniendo la muestra purificada. Seguir procedimientos del anexo Tabla 12.
2.5.8. Amplificación Del ADN
Se transfirió 5 µL de la muestra ADN (del paso de extracción) a una placa óptica de 96 pocillos que contuvo 20 µL del master mix. Luego, se agregó un control negativo y una curva patrón. La placa fue cubierta con una película adhesiva óptica MicroAmp®. Finalmente, las copias genómicas se desarrollaron de acuerdo con las sondas y cebadores descritas en la Tabla 13 (B. Malorny P. Fach, C. Bunge, A.
Martin and R. Helmuth et al., 2004; Gannon et al., 1997; Rantsiou et al., 2010), reguladas con parámetros de temperaturas según tipo de microrganismo (Tabla 14) y procesadas en el termociclador QuantStudio™ 3 marca Thermo Fisher Scientific, Massachussetts - USA).