Esquema 2. Mecanismo de reacción en el centro activo de las glicosidasas que invierten la
1.3.2. Síntesis de oligosacáridos utilizando ββββ galactosidasas
1.3.2.1. ββββ Galactosidasa de Bacillus circulans: Biolacta No 5 (Daiwa kasei)
Bacillus circulans es una bacteria Gram positiva en forma de bastón que se ha encontrado en
los suelos. La enzima comercial biolacta No 5 de la casa Daiwa kasei (Osaka, Japón), es una
circulans y según la literatura consultada, éste preparado comercial se elabora con la cepa
ATTC 31382 de dicha especie.55
Del preparado comercial se han realizado estudios que determinaron su actividad sintética durante la hidrólisis de lactosa, identificando hasta 11 oligosacáridos como subproductos de la reacción,56 por otra parte se han ensayado reacciones de transglicosilación donde principalmente se emplea el p-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (pNF-β-Gal) como donador y la N-Acetil-D-glucosamina (GlcNAc) como aceptor, por lo que se conoce que ésta enzima favorece enlaces de tipo β(1→4) dando lugar a la síntesis de N-Acetil-D- Lactosamina (Gal-β(1→4)GlcNAc ó LacNAc) y en menor cantidad β(1→6) obteniéndose
N-Acetil-D-Alolactosamina (Gal-β(1→6)GlcNAc ó N-Allo, ver Esquema 3).57 El disacárido β(1→4) es conocido como una estructura representativa de los núcleos estructurales de los oligosacáridos presentes en glicoproteínas y glicolípidos,2, 13-15 y su
síntesis química se ha estudiado y se ha abordado para hacerla más eficiente pero se caracteriza por pasos elaborados de protección y desprotección,61-64 lo que hace más
atractiva la síntesis mediante métodos enzimáticos, a la vez que más sostenible.
Esquema 3. Síntesis de N-acetil-D-lactosamina, isómero β(1→4), catalizada por las β- galactosidasas contenidas en Biolacta Nº 5, utilizando N-Acetil-D-glucosamina (GlcNAc) como aceptor y p-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (pNF-β-Gal) como donador. Esta reacción suele generar como producto secundario N-acetil-D-alolactosamina (isómero β(1→6)).
β-galactosidasa Bacillus circulans (Biolacta Nº 5) O OH HO OH O OH O HO HO NH OH OH O + O OH HO OH OH O O HO NH OH OH O O OH HO OH OH O O HO NH OH O HO NO2 Gal-β(1→4)-GlcNAc Gal-β(1→6)-GlcNAc
Curiosamente el preparado comercial de Biolacta No5 no sintetiza oligosacáridos con enlaces β[1→3], lo cual si se ha descrito para la cepa ATCC31382 de éste organismo.58
Estudios con esta cepa han permitido clonar el gen que posee actividad de síntesis β[1→3]55
y además caracterizar la enzima recombinante.59 La razón por la cual el preparado comercial
no posee ésta actividad es hasta cierto punto desconocida y se ha descrito que puede ser debido a una represión debida al medio de cultivo utilizado durante la producción o bien, a pérdidas en el proceso de ultrafiltración de Biolacta.55
La síntesis de disacáridos Galβ(1→4)GlcNAc y Gal β(1→6)GlcNAc ha sido ampliamente estudiada por varios grupos de investigación106, 120, 121 con la finalidad de mejorar los
rendimientos del isómero β(1→4) o de cambiar su regioselectividad para favorecer uno de los isómeros formados. Dentro de las estrategias empleadas para mejorar este proceso, se han considerado como opciones disminuir la temperatura el tiempo de incubación (3h), las unidades enzimáticas (6U) y el pH (5,0).60
ββββ-Galactosidasas aisladas de Biolacta No 5
En 1984 Mozzafar y colaboradores61 lograron aislar dos β-galactosidasas dentro del preparado comercial de Biolacta No 5 utilizando técnicas como la cromatografía de permeabilidad en gel y de intercambio iónico. De éste trabajo se concluyó que las β- galactosidasas aisladas, denominadas como I y II, poseen un peso molecular aparente de 240 kDa y 160 kDa respectivamente. Este valor se obtuvo por filtración en gel (sephadex G-200) y se corroboró con electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE). Estos parámetros determinados en éste estudio se muestran en la tabla 1.
Casi 14 años después, Vetere y Paoletti62 realizan un proceso de purificación con el fin de
aumentar la regioselectividad de las síntesis de disacáridos utilizando enzimas de B.
circulans y en dicho proceso se encuentran con una tercera isoenzima de este tipo. En dicha
publicación realizan un estudio comparativo de las enzimas aisladas con respecto a las encontradas inicialmente por Mozzafar y colaborades,61 aunque finalmente no se hace
mención a la síntesis de oligosacáridos con éstas enzimas. Las diferencias más importantes, a juicio de los autores62 fueron los pesos moleculares de las enzimas, pues en este nuevo
estudio los pesos moleculares aparentes fueron de 212, 140 y 86 kDa. Varios de los parámetros medidos en este estudio se muestran en la tabla 1.
Tabla 1. Comparación de las propiedades de las β-galactosidasas purificadas del preparado comercial Biolacta No 5 en los estudios publicados.
Enzima Peso Molec. (kDa) a Peso Molec. (kDa) b Actividad Específica U/mg a (40ºC, pH 6,0) Actividad Específica U/mg b, c pH óptimo a pH óptimo b Temp. Óptima a Temp. Óptima b I 240 212 128 (2-16mM) 75,2 6,0 6,0 45 ºC 44 ºC II 160 145 56 (2-16mM) 15,3 6,0 4,0 60 ºC 74 ºC III -- 86 -- 10,2 -- 4,0 -- 60 ºC
NOTAS: En todos los casos, los datos están referidos a la hidrólisis de oNF-β-Gal. El peso molecular reportado es el peso molecular aparente determinado según metodología del estudio referido. aEstudio realizado por Mozzafar y colaboradores61. b Estudio realizado por Vetere y
Paoletti62. c Valores máximos reportados en el estudio en mención, no se indica la concentración de
sustrato ni condiciones del ensayo para tales actividades.
Una de las observaciones más importantes de los estudios anteriores, es que no existe constancia en ninguno de ellos, de que las enzimas purificadas ni la enzima comercial hallan sido sometidas a electroforesis en condiciones no desnaturalizantes con la finalidad de ver subunidades y/o conglomerados liberados en el SDS-PAGE. Este es un hecho de suma importancia, ya que en el primer caso, Mozzafar y colaboradores61 aislaron dos enzimas bajo
la consigna de ser monoméricas, mientras que el estudio de Vetere y Paoletti62 se aislaron
tres enzimas, pero no se realizó afirmación alguna sobre esta temática. Finalmente, a la fecha, no se conoce a fondo cual de las tres enzimas es la responsable de la síntesis de cada uno de los disacáridos (β[1→4] y β[1→6]), pues los autores de los estudios de tales purificaciones no lo explicaron y al parecer, no existen publicaciones sobre éste tema.