Síntesis de disacáridos utilizando biocatalizadores termófilos en medios acuosos

Se evaluó la actividad sintética en medios acuosos tamponados, de los dos biocatalizadores de fuentes termófilas con mayor actividad: los extractos celulares de HB27 inducido con celobiosa y la enzima recombinante TTP0042 expresada en E. coli. Además, para comprobar los datos obtenidos con controles experimentales, se realizaron reacciones con los extractos celulares del mutante de T. thermophilus T42Kat y con la enzima recombinante TTP0042 PNar expresada en T. thermophilus.

3.4.2.1. Reacciones de transglicosidación con extractos celulares de HB27 inducido

Las reacciones de transglicosidación utilizando extractos celulares de HB27 se realizaron a 80ºC con agitación a 220 rpm, las concentraciones molares de donador:aceptor fueron de 1:5 respectivamente, colocando para ello 0,0425 milimoles de donador (pNF-β-Gal y pNF-

β-fuc) y 0,213 mmoles de cada aceptor a los cuales se les adicionó 1,0 mL de tampón fosfato de sodio pH 5,50 y 25 mM. Para las reacciones con clorhidratos de azúcares (GlcNH2.HCl y GalNH2.HCl) el pH se ajustó hasta 6,0 con hidróxido de sodio 5 M y se

siguió con papel indicador de pH. Una vez atemperada la mezcla, se tomó una alícuota de 50 µL del medio inicial de reacción y posteriormente se adicionaron 9 unidades enzimáticas de extracto celular dando inicio a la reacción.

Se tomaron alícuotas de la reacción cada treinta minutos, hasta finalizar a las 3 horas, cada alícuota se trató con 450 µL de metanol y se guardaron inmediatamente a -20ºC para finalizar la reacción. Las alícuotas se centrifugaron y se filtraron (0,22 µm de poro) para ser luego analizadas por HPLC (punto 3.1.4.3) con ELSD como detector universal de los compuestos formados, fue necesario utilizar detectores UV a 317 nm para identificar los

grupos p-nitrofenilos liberados en la reacción y DC a 317 nm para detectar la presencia de los grupos fenilos cercanos a carbonos quirales (presumiblemente el carbono anomérico) y con esto diferenciar los productos de autocondensación β[1→3] y β[1→6] que se describen en la literatura consultada.83

Screening de aceptores para reacciones de transglicosidación con extractos celulares de HB27 inducido.

Se estudiaron los diferentes aceptores que los extractos de HB27 podían reconocer en reacciones de transglicosidación, utilizando la metodología general para este tipo de reacciones antes descrita. Se realizó un screening de aceptores para reacciones en donde se uso pNF-β-Gal como donador. Los aceptores utilizados fueron pNF-β-Gal (reacción de autocondensación sin otros aceptores), Gal, Man, Fuc, Glc, GlcNH2.HCl, GalNH2.HCl,

GlcNAc y GalNAc.

Estudio sobre reconocimiento de aceptores para reacciones de transglicosidación con extractos celulares de la cepa mutante T42kat.

Con base en los resultados anteriores para reacciones de transglicosidación de mayor interés y utilizando la metodología general para este tipo de reacciones previamente detallada, se realizó un screening de aceptores utilizando como biocatalizador los extractos celulares de T42kat. Dada la baja actividad en hidrólisis con este catalizador, no fue posible alcanzar las 9 unidades enzimáticas de reacción, por lo que se adicionó la misma cantidad de proteínas totales utilizada en las reacciones de transglicosidación para HB27 inducido (43,3 mg de proteínas totales) y pNF-β-Gal como donador. Los aceptores utilizados fueron

pNF-β-Gal (reacción de autocondensación sin otros aceptores), GlcNH2.HCl, GalNH2.HCl,

GlcNAc y GalNAc.

3.4.2.2. Reacciones de transglicosidación con enzimas recombinantes en medios acuosos tamponados

Las reacciones de transglicosidación utilizando enzimas recombinantes provenientes de HB27 (TTP042 en E. coli y HB27Nar, TTP0222 his6tag en E. coli) se realizaron a 65ºC con

agitación a 220 rpm, las concentraciones molares de donador: aceptor fueron de 1:5 respectivamente, colocando para ello 0,0425 milimoles de donador (pNF-β-Gal) y 212,5 milimoles de cada aceptor a los cuales se les adicionó 1,0 mL de tampón fosfato de sodio pH 6,00 y 50 mM. Para las reacciones con clorhidratos de azúcares (GlcNH2.HCl y

GalNH2.HCl) el pH se ajustó hasta 6,0 con hidróxido de sodio 5 M y se estimó con papel

indicador de pH. Una vez atemperada la mezcla, se tomó una alícuota de 50 µL del medio inicial de reacción y posteriormente se adicionaron 9 unidades enzimáticas para dar inicio a la reacción.

Se tomaron alícuotas de la reacción cada treinta minutos, hasta finalizar a las 3 horas, cada alícuota se trató con 450 µL de metanol y se guardaron inmediatamente a -20ºC para finalizar la reacción. Las alícuotas se centrifugaron y se filtraron (0,22 µm de poro) para ser luego analizadas por HPLC (ELSD, UV y DC) en las condiciones descritas en el punto 3.1.4.3. La configuración preliminarmente asignada a los productos fue en todos los casos la más reiterada en la literatura para los compuestos sintetizados por ésta enzima, siendo:

β[1→3]110, 116, 117. Los productos de mayor rendimiento obtenidos en las reacciones fueron purificados y elucidados estructuralmente por RMN. Siendo los más importantes: N-acetil lactosamina (Galβ[1→4]GlcNAc) y N-acetil alolactosamina (Galβ[1→6]GlcNAc), cuyos espectros de RMN aparecen interpretados en la sección 3.3.2.

Screening de aceptores para reacciones de transglicosidación con TTP0042 his6tag

expresada en E. coli

Se estudiaron los diferentes aceptores que la enzima TTP0042 his6tag podía reconocer en

reacciones de transglicosidación, utilizando la metodología antes descrita. El donador utilizado fue pNF-β-Gal y los aceptores utilizados fueron pNF-β-Gal (reacción de autocondensación sin otros aceptores), Gal, Man, Fuc, Glc, GlcNH2.HCl, GalNH2.HCl,

Screening de aceptores para reacciones de transglicosidación con TTP0042 his6tag

expresada en HB27Nar

Con la finalidad de analizar los posibles efectos del organismo productor de la enzima recombinante (punto 3.4.1.3.), se decidió expresar la propia enzima TTP0042 his6tag en T. thermophilus HB27Nar (punto 3.4.1.5.) y analizar los aceptores que la enzima puede

reconocer en reacciones de transglicosidación, utilizando las mismas condiciones de reacción (punto 3.4.2.2.) que con la enzima expresada en E. coli. Los aceptores evaluados fueron: pNF-β-Gal, GlcNH2.HCl, GalNH2.HCl, GlcNAc y GalNAc.

Reacciones de transglicosidación con TTP0222

Considerando los resultados obtenidos con extractos celulares de HB27 y tomando en cuenta que la enzima TTP0222 está presente tanto en dichos extractos como en los de T42kat, se decidió analizar la actividad de ésta enzima en las mismas condiciones de síntesis de TTP0042 his6tag. Las condiciones de reacción fueron las mismas descritas

utilizadas en el screening de aceptores de TTP0042 his6tag, se realizó una única reacción

con pNF-β-Gal como donador y GlcNAc como aceptor.

3.4.3. Síntesis de disacáridos con biocatalizadores termófilos en presencia de líquidos