Purificación de enzimas recombinantes de HB27 expresadas en E col

Se produjeron enzimas recombinantes siguiendo los protocolos descritos en el punto 3.4.1.3. Se emplearon dos enzimas recombinantes de T. thermophilus clonadas y expresadas en E. coli: TTP0042 y TTP0222, ambas enzimas poseen un extremo polipeptídico de veinte aminoácidos que posee 6 histidinas (His6tag). Se utilizó además

una enzima clonada y expresada en T. thermophilus HB27Nar: TTP0042 His6tag. Todas

las proteínas se modificaron por adición de una cola de seis histidinas incluidas en un brazo extensor de 19 aminoácidos unidos por el amino terminal de la enzima.

Las enzimas recombinantes expresadas en E. coli fueron: TTP0042 his6tag y TTTP0222

his6tag. En estos casos la biología molecular actual aportó dos elementos de gran

importancia que facilitaron el proceso de purificación:

a) La expresión de una enzima termófila en un organismo mesófilo, esto permite precipitar una gran cantidad de proteínas de E. coli que a 70 ºC desnaturalizan y luego son eliminadas por centrifugación, tal y como se ha repetido en numerosos estudios sobre este tema110, 112-114, 120 _{algunos de los cuales no realizan una purificación posterior y}

utilizan este extracto como biocatalizador para reacciones de síntesis de glicoconjugados124, 174_{, ésta aproximación es sumamente válida dado que probablemente}

la única enzima activa en el extracto será la proteína de origen termófilo, mientras que la enzima termófila expresada no precipitará, adicionalmente el proceso de desnaturalización por calor remueve numerosas proteínas, hecho que se observa en los procesos de electroforesis.72 _{Pese a la clara conveniencia de este paso en la purificación}

se debe tener en cuenta que la actividad de la enzima puede disminuir producto del desgate térmico al que se somete, sin embargo el balance general tiende a favorecer el uso de este paso en la purificación de la proteína.

b) La presencia de un péptido adicional rico en histidina en el extremo amino de la proteína que permite su aislamiento utilizando la técnica de cromatografía de afinidad con metales quelatados, la cual fue reportada por primera vez en 1975 por Porath y colaboradores,288 estando comprobada su baja actividad imunogénica249 y pocos o nulos efectos en las propiedades de las proteínas recombinantes que la utilizan82. A la fecha se han purificado β-galactosidasas recombinantes de origen termófilo a las que se les ha añadido este extremo terminal de histidinas para facilitar su purificación luego de la precipitación térmica las proteínas de E. coli.163, 172 Los resultados obtenidos en los procesos de purificación con las proteínas recombinantes (his6tag) de HB27 expresadas

en E. coli se muestran a continuación.

Purificación de la enzima TTP0042 his6tag

La enzima TTP0042 his6tag se sometió a tres procedimientos de purificación:

eliminación de precipitados celulares por centrifugación, eliminación de proteínas por desnaturalización a 70 ºC y centrifugación, y finalmente purificación por cromatografía

de afinidad Ni 2+-agarosa. La figura 42 muestra el perfil de elución a 280 nm de la columna de Ni 2+-agarosa con el extracto de E. coli clarificado (luego de desnaturalizar a 80ºC por 40 minutos y centrifugar). De 0 a 20 minutos se equilibra la columna con tampón de adhesión (ver punto 3.2.5), luego de 20 a 66 minutos las proteínas se cargan en la columna con el mismo tampón y se hacen pasar por la columna lentamente (a un flujo de 0,50 mL/min) para garantizar una adecuada fijación de la proteína recombinante mediante las histidinas de la enzima y el niquel (II) de la columna.

Desde los 66 hasta los 78 minutos, la columna se lava con un tampón de lavado que se encuentra ligeramente enriquecido en imidazol (10 mM) para eliminar proteínas que se han adherido a la columna por interacciones debidas posiblemente a histidinas adyacentes en su estructura nativa, una pequeña parte de la enzima TTP0042 también eluye en esta zona. Finalmente desde los 78 hasta los 86 minutos se hace pasar tampón de elución que Figura 42. Perfil de elución (utilizando el Biologic LP) de proteínas en la columna de Ni2+_-

agarosa leídas a 280 nm, para extractos de E. coli con la enzima recombinante TTP0042, luego de ser calentados a 80ºC y centrifugados. La proteína TTP0042 eluye entre los 80 y 86 minutos del cromatograma.

posee una alta concentración de imidazol (500 mM) desprendiendo la enzima de la columna.

La figura 43 muestra el proceso de purificación seguido mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes, la enzima purificada muestra un alto grado de pureza por la eliminación de proteínas de E. coli mediante desnaturalización térmica a 70ºC. La elución en cromatografía de afinidad Ni2+_{-agarosa mejora notablemente la pureza de la}

enzima. Durante la purificación se ha contabilizado una eliminación de hasta un 80% de las proteínas presentes en el extracto clarificado (B) luego de someterse a calentamiento a 80ºC durante 40 minutos, el restante 20% de proteínas presentes en el medio acuoso clarificado se purifican por cromatografía de afinidad obteniéndose una altísima pureza.

Finalmente, la tabla 30 presenta un resumen general del proceso de purificación de la enzima. De dicha tabla se puede apreciar que la proteína se purifica con un factor de 40 veces respecto al estracto crudo inicial. La enzima purificada representa un rendimiento del 39% de la actividad total determinada en los extractos crudos de E. coli, mientras que respecto al total de proteínas presentes en dicho extracto, la enzima purificada equivale al 0,98%. Además, la actividad enzimática pasa de ser 4,15 U/mg hasta 165 U/mg luego del proceso de purifiación.

Figura 43. SDS-PAGE (12,5% acrilamida) para las fracciones

obtenidas en el proceso de purificación de la enzima TTP0042 his6tag (49 kDa) expresada en E. coli. A) Extracto crudo; B)

Extracto clarificado por calentamiento a 80 ºC; C) Proteína obtenida luego de la cromatografía de afinidad (Ni2+_-agarosa).

Tabla 30. Resumen del proceso de purificación de la proteína TTP0042 his6tag expresada en E. coli. (la actividad enzimática está medida en un medio 5 mM en pNF-β-Gal en fosfato de sodio

pH 7,00 50 mM a 80ºC).

Paso de purificación Proteínas

totales (mg) Rendimiento de proteínas (%) Actividad específica (U/mg) Factor de purificación

Centrifugación del extracto crudo 1523 100 4,15 1

Precipitación a 70 ºC y

centrifugación 792 52 6,88 1,7

Cromatografía de afinidad Ni2+_-

agarosa 15,0 0,98 165 40

Purificación de la enzima TTP0222 his6tag

La enzima TTP0222 his6tag se sometió a los mismos procedimientos de purificación que

la enzima TTP0042 his6tag descrita en el apartado anterior. La tabla 31 muestra los

rendimientos obtenidos en el proceso de purificación de la enzima, los cuales son bastante similares a los obtenidos con la enzima TTP0042 his6tag, lo que sugiere que los

promotores del gen y el proceso de inducción son bastante reproducibles en las condiciones de trabajo utilizadas con E. coli.

Tabla 31. Resumen del proceso de purificación de la proteína TTP0222 his6tag expresada en E. coli. (la actividad enzimática está medida en un medio 5 mM en pNF-β-Gal en fosfato de sodio

pH 7,00 50 mM a 80ºC).

Paso de purificación Proteínas

totales (mg) Rendimiento de proteínas (%) Actividad específica (U/mg) Factor de purificación

Centrifugación del extracto crudo 129 100 0,023 1

Precipitación a 70 ºC y

centrifugación 47 36 0,041 1,8

Cromatografía de afinidad Ni2+_-

agarosa 1,3 1 1,011 44

El peso molecular estimado de la proteína TTP0222 es de 77,5 kDa en condiciones nativas,73 _{sin embargo este valor es ligeramente mayor debido a la cola de histidinas}

adicionada a la misma. En la figura 44 se aprecia claramente la mayor afinidad de ésta proteína hacia la columna de Ni2+_{-agarosa, aunque se aprecia poca sobrexpresión de la}

Figura 44. SDS-PAGE (10% acrilamida) para las

fracciones obtenidas en el proceso de purificación de la enzima TTP0222 his6tag (aprox. 78 kDa). A) Extracto

crudo centrifugado; B) Extracto clarificado por calentamiento a 70 ºC y centrifugación); C) Proteína obtenida luego de la cromatografía de afinidad (Ni2+_-

agarosa).

Por otra parte, esta enzima presentó una actividad específica muy baja: 1,01 U/mg a 80ºC, utilizando tampón fosfato de sodio (pH 7,0, 50 mM) como medio de reacción y 5 mM de pNF-β-Gal como sustrato. Este valor de actividad enzimática es más de 160 veces inferior al obtenido con la enzima TTP0042 his6tag purificada en las mismas condiciones

y cerca de dos veces menor que el presentado en los extractos celulares de HB27 inducido con celobiosa (80ºC). Las razones por la que se obtiene un valor tan bajo de actividad para esta enzima podrían deberse a una baja estabilidad térmica que se evidenciaría por la pérdida de actividad tras la desnaturalización de proteínas de E. coli a 70ºC durante el proceso de purificación. Además también se observa la presencia de otras proteínas secundarias en el gel de electroforesis (Figura 44). Pese a todas las consideraciones realizadas, la actividad específica obtenida para la enzima TTP0222 his6tag es tan baja que se considera poco viable su uso como biocatalizador.

4.2.2.2. Purificación de TTP0042 his6tag expresadas en T. thermophilus HB27Nar En la purificación de la enzima TTP0042 his6tag expresada en HB27Nar se obtuvo una

actividad específica de 248 U/mg, mientras que la misma proteína obtenida de los extractos de E. coli posee una actividad de 165 U/mg, ambas actividades fueron medidas a 80ºC en 5 mM de sustrato (pNF-β-Gal) y tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0. La principal diferencia entre ambas proteínas, radica en el hospedero sobre el que se expresa, la proteína expresada en E. coli realiza su plegamiento en condiciones mesófilas a 37º mientras que la enzima clonada en HB27Nar realiza su plegamiento en condiciones

óptimas de su naturaleza termófila, constituyendo una ventaja a considerar respecto a su par mesófilo.

Un hecho similar ha sido descrito por Yoo y colaboradores,289 _{quienes purificaron una β-}

glicosidasa (con actividad sobre varios enlaces glicosídicos β-gal > β-fuc > β-gluc) en la especie Thermus caldophilus GK24 mediante procesos cromatográficos y lograron aislar una proteína de 49 kDa con una actividad específica de 165 U/mg, utilizando como medio de reacción tampón fosfato de sodio 20 mM a pH 6,00 y 75ºC, y como sustrato 5 mM de pNF-β-Gal, aunque también se utilizaron otros p-nitrofenil glicósidos (Fuc, Glc y Xil). Un año más tarde se expresó la misma enzima en E. coli y se purificó mediante desnaturalización por calentamiento (40 min, 80ºC) y posterior tratamiento mediante una cromatografía de exclusión molecular. Mediante este proceso de purificación se obtuvo una actividad específica de 83 U/mg bajo las mismas condiciones experimentales, siendo la proteína purificada similar en un 92% a la TTP0042 de HB27.79 _{Estos resultados}

indican que se ha obtenido una actividad casi dos veces más alta para proteínas de termófilas que han sido expresadas en un hospedero termófilo respecto a su par en E.

coli.

Tabla 32. Resumen del proceso de purificación de la proteína TTP0042 his6tag expresada en Thermus thermophilus HB27Nar. (la actividad enzimática está medida en un medio 5 mM en pNF-β-Gal en fosfato de sodio pH 7,00 50 mM a 80ºC).

Paso de purificación Proteínas

totales (mg) Rendimiento de proteínas (%) Actividad específica (U/mg) Factor de purificación Extracto crudo 40,5 100 5,64 1,0

Centrifugación del extracto

crudo 24,9 61 12,4 2,2

Cromatografía de afinidad Ni2+_-

agarosa 0,034 0,08 248 44

Respecto a los datos obtenidos para la enzima en el proceso de purificación (tabla 32), se puede observar que la enzima TTP0042 his6tag expresada en HB27Nar da resultados

sumamente bajos en cuanto a la cantidad proteína purificada (probablemente vinculados al tipo de promotor genético y la respuesta de éste en la cepa HB27Nar). Al comparar el rendimiento proteico obtenido en esta cepa (0,08%) respecto el total con el mismo

rendimiento obtenido por expresión en E. coli (0,98), se obtiene un rendimiento 12 veces mejor al expresar la proteína en la bacteria mesófila.

Finalmente, la electroforesis (SDS-PAGE, figura 45) no muestra una sobreexpresión de la enzima, aunque si muestra una eficiente purificación de la misma con pequeñas contaminaciones debido a otras proteínas presentes en los extractos celulares de HB27Pnar que poseen cierta afinidad por el níquel (II) y por ello no separadas por la columna de afinidad.