Reacciones de acilación de azúcares con lipasas libres

Se evaluaron varias aproximaciones de acilación de azúcares utilizando lipasas, siendo uno de los mayores problemas compatibilizar la solubilidad del azúcar con el medio de reacción para la lipasa, ya que las lipasas suelden desempeñarse mejor en medios poco polares y los azúcares se tienden a disolver en medios muy polares. Se probaron distintas aroximaciones con lipasas libres para obtener derivados acilados de azúcares, modificando la relación aceptor (azúcar): donador (éster vinílico del ácido graso), disolventes y tiempos de reacción.

3.5.2.1. Reacciones en tetrahidrofurano y 2-metiltetrahidrofurano:

El tetrahidrofurano (THF) es un disolvente poco sostenible, en tanto que el metil- tetrahidrofurano (Me-THF), se decidió comparar ambos disolventes como medio de reacción asumiendo que su polaridad es compatible en parte con los sustratos y en parte con los productos. La relación molar donador:aceptor fue 5:1. Se colocaron 30 mg pNF-β-Gal (0.10 mmol) en un tubo de reacción y se añadieron las cantidades equivalentes a 0.50 mmol de agente acilante (butirato de vinilo, laurato de vinilo y esterato de vinilo). La mezcla resultante se suspendió en 1,0 mL de disolvente y se añadió un 10% m/v de tamiz molecular (3Aº) para eliminar el agua del medio y evitar las reacciones de hidrólisis. Se utilizaron como disolventes el THF y el Me-THF, la mezcla resultante se atemperó a 40 ºC y se agitó a 220 rpm por agitación magnética. Se añadieron 10 mg de CAL-B (se coloca menos cantidad de CAL-B por que es un sólido con mayor actividad enzimática que la CAL) durante 24 horas. Se tomaron alícuotas de 100 µL a las 0, 24, 48 y 72 horas de reacción para analizar su composición por HPLC (ver punto 3.5.1.5). Dado que la mezcla perdía volumen por la evaporación del disolvente, se añadieron 500 µL más de Me-THF u

800 µL de THF cada 24 horas para compensar las pérdidas de volumen. Las cantidades de reactivos y disolventes utilizados en este caso aparecen en la Tabla 10.

Tabla 10. Condiciones de reacción para la acilación de pNF-β-Gal en THF y Me-THF.

.Ensayo Enzima Disolvente Donador Aceptor Disolvente 1 10 mg CAL-B THF 30 mg pNF-β-Gal 65 µL Butirato de vinilo 1 mL THF 2 10 mg CAL-B THF 30 mg pNF-β-Gal 130 µL Laurato de vinilo 1 mL THF 3 10 mg CAL-B THF 30 mg pNF-β-Gal 180 µL Esterato de vinilo 1 mL THF 4 10 mg

CAL-B Me-THF 30 mg pNF-β-Gal

65 µL

Butirato de vinilo 1 mL THF

5 10 mg

CAL-B Me-THF 30 mg pNF-β-Gal

130 µL

Laurato de vinilo 1 mL THF

6 10 mg

CAL-B Me-THF 30 mg pNF-β-Gal

180 µL

Esterato de vinilo 1 mL THF

Las reacciones se repitieron con las enzimas CAL y ROL, usando una cadena más grande de ácido graso: el laurato de vinilo, debido a que el butirato de vinilo no pareció ser reconocido para la acilación sino para la hidrólisis del mismo. Y en la literatura este sustrato parece ser fácilmente reconocido por la lipasa.173, 175 _{Las nuevas reacciones fueron}

las mostradas en la Tabla 11.

Tabla 11. Condiciones de reacción para la acilación de pNF-β-Gal en THF y Me-THF. .Ensayo Enzima Donador Aceptor Disolvente

1 10 mg ROL 30 mg pNF-β-Gal 130 µL Laurato de vinilo 1 mL THF 2 10 mg ROL 30 mg pNF-β-Gal 130 µL

Laurato de vinilo 1 mL MeTHF

3 15 mg CAL* 30 mg pNF-β-Gal 130 µL Laurato de vinilo 1 mL THF 4 15 mg CAL* 30 mg pNF-β-Gal 130 µL

Laurato de vinilo 1 mL MeTHF

3.5.2.2. Reacciones en Terc-butanol y líquidos iónicos:

Algunas referencias sobre la acilación de azúcares utilizando lipasas postulan el terc- butanol (T-BuOH) como un disolvente compatible con las lipasas y los sustratos. En ciertos casos se utilizan líquidos iónicos como cosolventes.97, 101 _{Por ese motivo se decidió usar}

esta aproximación, ya que los resultados obtenidos con THF y Me-THF no fueron existosos. En este nuevo intento se cambió la relación donador: aceptor a 1:1 con un pequeño déficit de donador (95% de donador) para evitar posibles di-acilaciones observadas en el primer intento y atribuidas a un exceso de donador. También se redujo el tiempo de reacción a 24 h para evitar múltiples acilaciones. Las condiciones de reacción se describen en detalle en la tabla 12.

Tabla 12.Condiciones de reacción para la acilación de pNF-β-Gal en T-BuOH.

.Ensayo Enzima Donador Aceptor Disolvente 1 10 mg CAL-B 30 mg

pNF-β-Gal

12 µL

Butirato de vinilo 1 mL T-BuOH

2 10 mg CAL-B 30 mg

pNF-β-Gal

24 µL

Laurato de vinilo 1 mL T-BuOH

3 10 mg CAL-B 30 mg

pNF-β-Gal

34 µL

Esterato de vinilo 1 mL T-BuOH

4 15 mg CAL* 30 mg

pNF-β-Gal

12 µL

Butirato de vinilo 1 mL T-BuOH

5 15 mg CAL* 30 mg

pNF-β-Gal

24 µL

Laurato de vinilo 1 mL T-BuOH

6 15 mg CAL* 30 mg

pNF-β-Gal

34 µL

Esterato de vinilo 1 mL T-BuOH

7 10 mg ROL 30 mg

pNF-β-Gal

12 µL

Butirato de vinilo 1 mL T-BuOH

8 10 mg ROL 30 mg

pNF-β-Gal

24 µL

Laurato de vinilo 1 mL T-BuOH

9 10 mg ROL 30 mg

pNF-β-Gal

34 µL

Esterato de vinilo 1 mL T-BuOH

Se realizó una aproximación más diluida con T-BuOH y un 10% de líquidos iónicos (sistema bifásico) utilizando el líquido [Bmim][PF6]. En esta ocasión se utilizó otro

aceptor: GlcNAc, con la finalidad de analizar si los bajos rendimientos obtenidos en las ocasiones anteriores se han debido a la naturaleza del primer aceptor (pNF-β-Gal). Las condiciones de reacción aparecen mostradas en la tabla 13

Tabla 13. Reacciones de acilación de azúcares

.Ensayo Enzima Donador Aceptor Disolvente Cosolvente 1 10 mg CAL-B 23,3 mg

GlcNAc 12 Butirato de vinilo µL 1 mL T-BuOH 10% [Bmim][PF6]

2 10 mg CAL-B 23,3 mg

GlcNAc 24 Laurato de vinilo µL 1 mL T-BuOH 10% [Bmim][PF6]

3 10 mg CAL-B 23,3 mg

GlcNAc 34 Esterato de vinilo µL 1 mL T-BuOH 10% [Bmim][PF6]

4 15 mg CAL* 23,3 mg

GlcNAc 12 Butirato de vinilo µL 1 mL T-BuOH 10% [Bmim][PF6]

5 15 mg CAL* 23,3 mg

GlcNAc 24 Laurato de vinilo µL 1 mL T-BuOH 10% [Bmim][PF6]

6 15 mg CAL* 23,3 mg

GlcNAc 34 Esterato de vinilo µL 1 mL T-BuOH 10% [Bmim][PF6]

7 10 mg ROL 23,3 mg

GlcNAc 12 Butirato de vinilo µL 1 mL T-BuOH 10% [Bmim][PF6]

8 10 mg ROL 23,3 mg

GlcNAc 24 Laurato de vinilo µL 1 mL T-BuOH 10% [Bmim][PF6]

9 10 mg ROL 23,3 mg

GlcNAc 34 Esterato de vinilo µL 1 mL T-BuOH 10% [Bmim][PF6]

3.5.2.3. Análisis por HPLC:

Las alícuotas se diluyen con 9 volúmenes de THF y se conservan a -20ºC en tubos de vidrio, ya que el THF tiende a disolver (lentamente) los tubos Ependorf. Las muestras se filtran a temperatura ambiente utilizando un poro de 0.2 µm y se analizan por HPLC (ver punto 3.1.4.3) siguiendo las indicaciones de la bibliografía de referencia:97 _{columna ODS}

Hypersyl 120-5C18 (Thermoelectron corporation) de 250 mm x 4.6 mm con un tamaño de partícula de 5 µm eluida a 0.20 mL/min utilizando de fase móvil 75:20:5 (MeOH:ACN:H2O). Se utilizó un sistema de dos detectores ELSD para detectar los

compuestos sólidos en general, UV para deterctar compuestos con el residuo de p-nitrofenil que absorven a a 317 nm. Se realizaron blancos con los tiempos iniciales de reacción (sin lipasas) y blancos de lipasa en disolvente orgánico para identificar falsos positivos, como por ejemplo compuestos presentes en los preparados sólidos de lipasas.

3.5.3. Síntesis de glicoconjugados utilizando lipasas inmovilizadas