1. Cambio de dosis
1.4 Alteraciones en elementos reguladores
1.4.1. Análisis de enriquecimiento en elementos ultraconservados
Uno de los objetivos de esta tesis era estudiar la implicación en los trastornos del neurodesarrollo de elementos que puedan participar en la regulación génica como los UCEs. En un análisis previo con parte de los resultados de esta serie publicado en 2010, se observó un enriquecimiento de UCEs en CNVs patológicas (Martínez et al., 2010). En este trabajo se ha completado este análisis para toda la serie, determinando el número de UCEs dentro y fuera de nuestras CNVs (patológicas, patológicas de penetrancia incompleta y VOUS, o benignas) utilizando la herramienta Table Browser del UCSC. El enriquecimiento en estos elementos se estima calculando el cociente entre el número de UCEs observados y el número de UCEs esperados en estas regiones (razón de enriquecimiento; RE). Asumiendo una distribución aleatoria de los UCEs en el genoma, el número de elementos esperados se obtiene multiplicando el número total de elementos ultraconservados (481 UCEs) por la proporción del genoma que representan las CNVs. Para valorar la significación de esta relación se realiza una estimación de X2 basándose también en el número de elementosobservados y esperados (figura 62).
Al igual que en los resultados preliminares publicados en 2010, se observa un enriquecimiento altamente significativo de UCEs en deleciones patológicas (p <0.0001), mientras que en aquellas alteraciones cuya repercusión no está clara (pip y VOUS) se observa un empobrecimiento, siendo más evidente en los polimorfismos benignos, que no contienen ningún UCE (tabla 46).
genoma CNV genoma e
pb
T
pb
T
NE
NE
)
(
)
(
e oNE
NE
RE
e e oNE
NE
NE
2 2
(
)
Figura 62: Fórmulas utilizadas para el análisis de enriquecimiento. e: esperados; NE: número
Tabla 46: Análisis de enriquecimiento de UCEs en CNVs.
Alteración CNV Tamaño (Mb) Nº UCEs RE p Patológica total 279.0 82 1.92 <0.0001 deleción 179.5 63 2.29 <0.0001 duplicación 117.1 20 1.11 0.23 pip+VOUS total 25.7 2 0.51 0.33 deleción 11.4 1 0.57 0.57 duplicación 21.3 1 0.31 0.20 Benigna total 17.0 0 - 0.11 deleción 6.5 0 - 0.32 duplicación 11.7 0 - 0.18 Genoma - 3137 481 - -
Datos obtenidos de la herramienta Table Browser del UCSC el 17-4-2015.
Figura 63: Distribución en el genoma de los elementos ultraconservados. Representación de la distribución en el genoma de los 481 UCEs, diferenciando los contenidos en CNVs patológicas: 62 en deleciones (verde), 19 en duplicaciones (rojo) y uno (uc. 110) en deleción y duplicación (amarillo), frente a los 419 UCEs no alterados en las CNVs de nuestra serie.
UCEs en deleciones patológicas UCEs en duplicaciones patológicas
UCE en CNVs patológicas de ganancia y pérdida de dosis UCEs que no están contenidos en CNVs patológicas
Los UCEs se encuentran distribuidos a lo largo de todo el genoma, exceptuando los cromosomas 21 e Y, estando a menudo agrupados. Los UCEs contenidos en las CNVs patológicas no son exclusivamente aquellos que se encuentran agrupados, sino que también se observan algunos aislados contenidos en este tipo de alteraciones (figura 63).
1.4.2. Análisis de enriquecimiento en miRNAs
Al igual que los elementos ultraconservados, los miRNAs pueden participar en la regulación génica. De forma análoga al apartado anterior se ha calculado la razón de enriquecimiento y significatividad mediante la estimación de X2 para
cada tipo de CNVs (patológicas, patológicas de penetrancia incompleta y VOUS, o benignas) detectada en nuestra serie (figura 62). En este caso se ha observado un enriquecimiento de miRNA muy significativo (p <0.0001) en CNVs cuya repercusión en la clínica de los pacientes no está del todo esclarecida (pip y VOUS) y en duplicaciones patológicas (p = 0.0004), mientras que en el total de CNVs patológicas y en las CNVs benignas el número de miRNAs se ajusta a los valores esperados (tabla 47).
Tabla 47: Análisis de enriquecimiento de miRNAs en CNVs.
Alteración CNV tamaño (Mb) Nº miRNAs RE p Patológica total 279.0 94 1.13 0.25 deleción 179.5 42 0.78 0.11 duplicación 117.1 56 1.60 0.0004 pip+VOUS total 25.7 64 8.32 <0.0001 deleción 11.4 10 2.92 0.0004 duplicación 21.3 63 9.88 <0.0001 Benigna total 17.0 7 1.37 0.40 deleción 6.5 3 1.53 0.46 duplicación 11.7 4 1.14 0.79 Genoma - 3137 938 - -
Datos obtenidos de la herramienta Table Browser del UCSC el 17-4-2015.
Al igual que los UCEs, los miRNAs se encuentran distribuidos a lo largo de todo el genoma, estando a menudo agrupados, y de igual forma, los miRNAs contenidos en las CNVs patológicas tampoco son exclusivamente aquellos que se encuentran agrupados, sino que también se observan algunos aislados (figura 64).
Figura 64:Distribución en el genoma de los miRNAs. Representación de la distribución en el genoma de los 938 miRNAs, diferenciando los contenidos en CNVs patológicas: 38 en deleciones (verde), 52 en duplicaciones (rojo) y 4 en deleción y duplicación (amarillo), frente a los 844 miRNAs no alterados en las CNVs de nuestra serie de pacientes.
1.4.3. Aplicación del array de diseño propio para la detección de
alteraciones en miRNAs y UCEs
En el análisis específico de los resultados de los CGH-arrays de diseño propio en busca de CNVs que afectaran a miRNAs o/y UCEs nos encontramos:
- Casos con alteraciones de gran tamaño que contenían genes presumiblemente responsables de la patología.
- Alteraciones que no se pudieron confirmar o se consideraron artefactuales por la alta incidencia de casos alterados, tanto en pacientes como en controles, además de una elevada variabilidad de los valores de LogRatio.
- CNVs que, aun estando confirmadas, no pudieron asociarse con la clínica que presentaba el paciente ni considerarse como patogénicas.
miRNAs en deleciones patológicas miRNA en duplicaciones patológicas
miRNAs en CNVs patológicas de ganancia y pérdida de dosis miRNAs que no están contenidos en CNVs patológicas
Por ejemplo, en la paciente 4023, con la cuarta versión del array dirigido, encontramos una deleción de una única sonda (A_18_P15691324) en el cromosoma 6 que delimitaba una alteración con un tamaño comprendido entre 60 pb y 142 Kb (figura 65A). Esta alteración afectaba al miRNA MIR30C2 cuyos genes diana validados incluyen a genes asociados a la DI como HDAC4,
ARHGEF6 y PIK3R2. No obstante, al confirmar la alteración por PCR cuantitativa
se pudo determinar que se trataba de un cambio heredado de su madre sana, por lo que se clasificó como una variante probablemente benigna (figura 65B).
Figura 65: Deleción de MIR30C2 en la paciente 4023. (A) Imagen del UCSC donde se representa el tamaño máximo (del_max) y mínimo (del_min) de la deleción. (B) Valores de cuantificación relativa (RQ) en el análisis por qPCR, utilizando cebadores contenidos en la región máxima alterada (6q13) y en el gen A2BP1 (16p13.3) para calcular el dCt.