Históricamente, tras una evaluación clínica exhaustiva, si había una orientación diagnóstica hacia un síndrome concreto de causa genética conocida, se dirigía el estudio en esa dirección. Por ejemplo, para alteraciones cromosómicas se utilizaban técnicas como la hibridación in situ fluorescente (FISH: fluorescence in
situ hybridization) o posteriormente la amplificación múltiple de sondas
dependiente de ligamiento (MLPA: multiplex ligation-dependent probe
amplification), para el estudio de mutaciones monogénicas habitualmente se
ha empleado la reacción en cadena de la polimerasa (PCR: polymerase chain
reaction) y secuenciación de Sanger, mientras que el análisis de enfermedades
debidas a expansiones de tripletes como el X-frágil se realizaba mediante el
Southern blot. En caso de carecer de una sospecha clínica clara, se realizaba
principalmente un cariotipo, en busca de grandes reordenamientos, pudiendo completarse este tipo de análisis con el estudio de regiones teloméricas tanto por FISH primero como por MLPA después.
Con el avance de las nuevas tecnologías, en la práctica asistencial el cariotipo ha sido sustituido por los arrays genómicos como primera herramienta para el rastreo de alteraciones en pacientes con DI. Esta nueva herramienta ha supuesto un gran avance en el diagnóstico etiológico de la DI, especialmente
sindrómica, describiéndose nuevos síndromes y causas de DI. Por otro lado, la interpretación de este tipo de resultados puede ser muy compleja, al aumentar el número de alteraciones detectadas cuyo significado es incierto y debido a la baja casuística de muchos de estos casos, que dificulta el poder establecer el espectro fenotípico de rasgos clínicos asociados a estas alteraciones de una forma exhaustiva y precisa.
Además, pese al aumento de la eficiencia diagnóstica con la introducción de las nuevas herramientas, todavía hay muchos pacientes con trastorno del neurodesarrollo cuya etiología permanece desconocida. Los mecanismos epigenéticos tienen especial relevancia en el desarrollo del sistema nervioso (Mehler MF, 2008; Hu et al., 2014; West y Orlando, 2014), por lo que su alteración podría explicar algunos de estos casos. En este sentido, el mecanismo epigenético mejor estudiado es la metilación del DNA. Para la búsqueda de alteraciones específicas de loci se han utilizado dos aproximaciones distintas basadas en enzimas de restricción sensibles a metilación o en el tratamiento del DNA con bisulfito sódico. Mientras que para el estudio más global de la metilación el método de referencia es la cromatografía líquida de alta eficiencia (high performance liquid chromatography; HPLC), aunque se han desarrollado nuevos métodos para este tipo de estudios basados en técnicas como los arrays de metilación o la pirosecuenciación. No obstante, además de que la mayoría de laboratorios no disponen del equipamiento necesario para aplicar estas técnicas, la dificultad mayor radica en comparar los resultados obtenidos en diferentes estudios, al aplicarse distintas técnicas en distintos tejidos de muestras sometidas a distintos tratamientos. Por último, una dificultad añadida en el estudio de la DI es la inaccesibilidad al tejido diana, el sistema nervioso central, especialmente durante el neurodesarrollo.
HIPÓTESIS
"Investigar es ver lo que todo el mundo ha visto, y pensar lo
que nadie más ha pensado."
La hipótesis fundamental de este trabajo es que las alteraciones de la regulación génica mediada por los procesos epigenéticos tienen una especial relevancia entre las causas de los trastornos del neurodesarrollo.
Esta hipótesis se concreta en los siguientes puntos:
- Las alteraciones de los mecanismos epigenéticos pueden ser tanto génicas como epigenéticas (epimutaciones).
- Estas alteraciones de la maquinaria epigenética están implicadas en los trastornos del neurodesarrollo.
- Existen variantes genéticas de predisposición a epimutaciones.
- En los casos en los que se detecten alteraciones genéticas debidas a cambios de dosis, el estudio de las zonas de incertidumbre donde se localizan los puntos de rotura en los que se han producido los reordenamientos cromosómicos, pueden ayudar a explicar el mecanismo de estas alteraciones.
- Patrones epigenéticos alterados en tejidos accesibles como la sangre periférica podrán servir de marcadores de alteraciones epigenéticas en otros tejidos menos accesibles como el sistema nervioso.
- Un estudio génico y epigenético completo permitirá identificar y catalogar mejor este grupo de patologías.
OBJETIVOS
"Entre las dificultades se esconde la oportunidad."
(Albert Einstein)
El objetivo general de esta tesis doctoral es contribuir al conocimiento de la etiología y al diagnóstico genético de los trastornos del neurodesarrollo.
Este objetivo general se concreta en la búsqueda de:
- Alteraciones genéticas relacionadas con este tipo de trastornos en genes candidatos, como aquellos implicados en la regulación epigenética, la diferenciación y el desarrollo del SNC, cuya expresión se encuentra activada preferentemente durante el desarrollo neuronal.
- Alteraciones en otros elementos del genoma que puedan intervenir en la regulación de la expresión génica como elementos ultraconservados y miRNAs. - Enriquecimiento de elementos reguladores, secuencias/regiones repetitivas del genoma o marcadores de estructuración de la cromatina, en las regiones de incertidumbre que contienen los puntos de rotura de las variantes en número de copias detectadas en estos pacientes (zona gris).
- Marcadores de alteraciones epigenéticas, centrándonos en la metilación del genoma completo y de regiones candidatas de interés, tales como dominios sometidos a metilación diferencial.
- Correlación de los tipos de alteraciones detectadas con la clínica de esos pacientes.
“Vamos a matar tres pájaros de un tiro.”
(Francisco Martínez Castellano)
Para la realización de este trabajo, se ha decidido utilizar el punto como separador decimal, siguiendo las recomendaciones de la Real Academia de la Lengua Española (2010); y la coma como separador de millares en la notación de las coordenadas genómicas, tal como se indica en la normativa internacional contenida en el ISCN (International system for human cytogenetic
nomenclature) (Shaffer et al., 2013). Además, todas las secuencias de
oligonucleótidos se escriben en orientación 5’3’, siguiendo el consenso internacional. Por último, se ha utilizado el mapa genético Hg19 (NCBI37) para referir todas las coordenadas genómicas presentadas en este trabajo.
1. Sujetos de estudio
1.1 Pacientes
En este trabajo se han estudiado 395 pacientes remitidos a la Unidad de Genética del Hospital Universitario y Politécnico La Fe para su inclusión en diversos proyectos de investigación centrados en el estudio de las causas genéticas de la DI y los trastornos del neurodesarrollo del grupo de Investigación traslacional en Genética.
Los pacientes estudiados en este trabajo fueron incluidos en los proyectos a lo largo de 12 años (desde octubre de 2001 hasta julio de 2013; figura 18), pero el presente trabajo se inició en septiembre de 2009.
Figura 18:Distribución del número de pacientes según su fecha de inclusión.
Los criterios utilizados para la selección de los pacientes se basan en la elección de individuos con trastornos del neurodesarrollo de etiología desconocida como DI o TEA que presentan además anomalías congénitas, rasgos dismórficos y/o antecedentes familiares de trastornos del neurodesarrollo, del comportamiento, abortos de repetición o malformaciones congénitas.
En todos los casos, el estudio del cariotipo había resultado normal, excluyéndose de este trabajo aquellos pacientes en los que se había detectado alguna alteración citogenética patológica. Además, en la mayoría de los casos se
0 10 20 30 40 50 60 70 80 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 Año de Inclusión N º d e P aci en te s
había descartado el síndrome del cromosoma X frágil, que como ya se ha comentado en la introducción, es una de las causas más frecuentes de DI de origen genético (tras el síndrome de Down), así como cualquier otro estudio asistencial que se considerara oportuno según la clínica de cada caso, como por ejemplo el síndrome de Rett, de Angelman, deleción 22q11, etc.
Los pacientes fueron valorados por dos profesionales sanitarios diferentes. Dentro de nuestro grupo de investigación se elaboró una hoja de recogida de datos clínicos y, después de informar a las familias sobre el proyecto, se obtuvo el consentimiento para la realización de los estudios pertinentes presentados en este trabajo (anexo I). Todo esto se llevó a cabo con la aprobación del comité ético del Hospital Universitario y Politécnico La Fe, cumpliendo, por tanto, con el tratado acordado en 1964 en Helsinki, por la Organización Médica Mundial, sobre los principios éticos de la investigación en humanos con fines médicos y posteriores revisiones del mismo (2013).
Además, a partir de febrero de 2004 el grupo de Investigación Traslacional en Genética, diseñó y puso en marcha una base de datos ACCESS para la recogida y categorización de los principales datos clínicos y el registro de los resultados de los diferentes estudios genéticos realizados, gestionada principalmente por la Dra. Orellana y Dra. Roselló. En dicha base de datos los campos identificativos de los pacientes se encuentran disociados cumpliendo con la ley de protección de datos.
Para la obtención de material genético se extrajo una muestra de sangre periférica venosa tanto al paciente como a sus progenitores. Además, en algunos casos, a raíz de los hallazgos obtenidos, fue necesario completar el estudio familiar, por lo que también se obtuvo muestra de otros miembros de la familia.
1.2 Grupos control
Para evaluar la frecuencia de los hallazgos encontrados en población sana, se recogieron muestras de 236 individuos de nuestra población que fueron obtenidas y anonimizadas de acuerdo con la normativa legal vigente. Las muestras de DNA de estos casos se obtuvieron a partir de los excedentes de la sangre venosa enviada a hematología para la realización de un hemograma. Estos individuos se remitieron desde distintos servicios, no estando la causa de su estudio relacionada con ningún trastorno del neurodesarrollo. Los únicos datos recogidos en estos casos fueron la edad y el género, buscando, en la medida de lo posible, la concordancia de estos parámetros con nuestra serie de pacientes (figura 19).
Como controles positivos para los estudios de metilación se disponía, por un lado, de muestras de 36 pacientes con trastornos del neurodesarrollo con alteraciones conocidas en genes implicados en procesos epigenéticos, como el
MECP2, CREBBP, RPS6KA3, ATRX, HDAC4 o EMTH1 (anexo II). Por otro lado,
teníamos acceso a muestras de DNA de pacientes con alteraciones en la impronta debidos a la metilación anómala de los genes SNRPN, KCNQ1OT1, H19 o MEG3, que fueron diagnosticados en nuestro servicio y que, en este trabajo, nos sirvieron de controles positivos en los estudios de metilación centrados en alteraciones de estos genes.
Figura 19: Distribución por género y edad de pacientes y controles. Representación por
género y edad de los pacientes estudiados (arriba) y los individuos control (abajo). La serie estudiada está formada por 237 varones y 158 mujeres, siendo la media de edad de 7 años, mientras que la serie control esta formada por 120 varones y 116 mujeres, con una media de edad de 7 años.