Amplificación y análisis de las regiones variables de los integrones clase 1 presentes en los aislamientos

Como se mencionó previamente, los integrones poseen una zona variable en la cual se pueden encontrar casetes génicos que carecen de promotor propio y que pueden ser correctamente expresados gracias a la presencia del promotor ubicado en el gen intI1 corriente arriba de la zona variable y adecuadamente orientado. A fin de investigar qué genes podrían estar formando parte de las zonas variables de los

integrones detectados en los aislamientos analizados, se procedió a amplificar dichas regiones para su posterior secuenciamiento y su análisis in silico. Para ello se utilizaron

primers previamente diseñados que alinean con secuencias conservadas de las regiones 5´CS y 3´CS, flanqueando esta región. La amplificación de las regiones variables con distintos juegos de primers se realizó para los 6 aislamientos en los que previamente se había detectado amplificación positiva para el gen de la integrasa (intI1) presente en integrones de clase 1. Se utilizó un único primer directo, sulpro3, que se encuentra en el segmento 5´CS, en combinación con 7 primers reversos: 3´CSNew, HS287, AJH60, TniR y HS286, IS26F e IS26R (Materiales y Métodos, Tabla II.4), complementarios al segmento 3´CS del integrón.

De las 7 combinaciones de primers ensayadas, 3 de ellas (sulpro3/3’CSnew, sulpro3/HS287 y sulpro3/AJH60) permitieron amplificar la región variable en 3 aislamientos distintos. Como puede verse en la Figura IV.5, el juego sulpro3/3’CSnew amplificó un fragmento de alrededor de 1.200 pb en los aislamientos de Ochrobactrum

sp. BF02, Pseudomonas putida BF25 y Pseudomonas sp. BF27; el par sulpro3/HS287 amplificó un fragmento de la misma longitud en los aislamientos BF25 y BF27, mientas que el juego sulpro3/AJH60 permitió amplificar la zona variable en el aislamiento BF25, también de 1.200 pb. Las 4 combinaciones de primers restantes (3´CSNew/TniR, 3´CSNew/HS286, 3´CSNew/IS26F y 3´CSNew/IS26R) arrojaron resultados negativos con todos los moldes de ADN ensayados.

Estos resultados indican que al menos 3 de los aislamientos analizados poseen una zona variable de aproximadamente 1.200 pb. El resto de los aislamientos, para los que no se obtuvo amplificación, probablemente contengan un segmento 3´CS cuya

Figura lV.5. Amplificación de la región variable de los integrones de clase 1 detectados en la colección de aislamientos utilizando distintos juegos de primers: A) sulpro3/ 3’CS new. B) sulpro3 /HS287. C) sulpro3/ AJH60. Los productos de PCR se corrieron en un gel de agarosa al 0,8%.

L1 00 H 20 02 19 25 27 42 44 A B C L100 H20 02 19 25 27 42 44 L100 H20 02 19 25 27 42 44 1.200pb

secuencia nucleotídica difiera en algún grado de la descripta. Dado el origen ambiental de los aislamientos analizados, no es sorprendente que el extremo 3´CS de estos integrones difiera de los previamente depositados en bases de datos, que son mayoritariamente de origen clínico.

Los amplicones de la zona variable generados por PCR en los tres aislamientos fueron secuenciados utilizando los productos generados con la combinación de

primers sulpro3/3´CSNew. Se determinó la identidad de las secuencias de las regiones variables amplificadas, realizando una búsqueda de similitud a nivel ADN (BLASTn) y a nivel proteína (BLASTx). Esta búsqueda se realizó en la base de datos de NCBI. Los resultados se muestran en las Tablas IV.1 y IV.2.

Tabla IV.1. Identidad a nivel de secuencia nucleotídica (BLASTn) de las regiones variables amplificadas y secuenciadas

Aislamiento Descripción Cobertura E value Identidad N° acceso

BF02

Salmonella enterica subespecie entérica serovar Typhimurium,

plásmido incHI2

98% 0.0 92% LN794248.1 BF25 Klebsiella pneumoniae cepa 34618,

genoma completo 98% 0.0 99% CP010392.1

BF27 Klebsiella pneumoniae cepa 34618,

genoma completa 100% 0.0 99% CP010392.1

Tabla IV.2. Identidad a nivel de secuencia aminoacídica (BLASTx) de las regiones variables amplificadas y secuenciadas

Aislamiento Descripción Organismo Cobertura E value Identidad N° acceso

BF02 aminoglicósido nucleotidiltransferasa ANT3 Raoultella planticola 85% 0.0 91% WP_022635574.1 BF25 aminoglicósido nucleotidiltransferasa ANT3 Escherichia coli 84% 0.0 100% WP_001297038.1 BF27 aminoglicósido nucleotidiltransferasa ANT3 Escherichia coli 85% 0.0 100% WP_001297038.1

En los tres casos, el fragmento amplificado de aproximadamente 1.200 pb contiene un gen que codifica para una aminoglicósido nucleotidil-transferasa (aadA), la cual confiere resistencia a estreptomicina/ espectinomicina (Gestal 2005). A nivel de secuencia nucleotídica, puede verse que en los aislamientos BF25 y BF27 esta secuencia es similar y posee un 99% de identidad con la misma secuencia presente en el genoma de Klebsiella pneumoniae, mientras que la secuencia del aislamiento BF02 posee una menor identidad con la misma secuencia presente en el plásmido IncHI2 hallado en un aislamiento de Salmonella typhimurium.

Se han reportado numerosos casos en los que este gen aadA se encuentra integrado en la región variable en integrones de clase 1 (Michael, et al., 2005, Binh, et al., 2009, Lopes, et al., 2014, Shahcheraghi, et al., 2014). Si bien los aislamientos BF02, BF25 y BF27 presentan este gen en su zona variable, en el aislamiento BF02 el porcentaje de identidad con el gen aadA más cercano depositado en la base de datos NCBI es sólo de 91%, por lo cual se podría decir que este integrón posee una nueva variante de la familia aadA, de la cual hasta la fecha se han descripto al menos 26

proteínas distintas (depositadas en la base de datos de NCBI:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). En el caso de los aislamientos BF25 y BF27, ambos genes poseen un 100% de identidad con el gen aadA más cercano depositado en esta base de datos.

IV.2.6. Secuenciamiento y análisis de los genes intI1 identificados en los