ESTABLECIMIENTO DE UNA COLECCIÓN DE BACTERIAS PORTADORAS DE PLÁSMIDOS DE ALTO
III.6. Evaluación de la movilidad de los plásmidos de la colección
Un aspecto importante de los plásmidos que merece ser analizado es su movilidad. Como se mencionó en la introducción de esta Tesis (Capítulo I, sección I.2.2.1.1), los plásmidos pueden clasificarse, de acuerdo a su movilidad, en conjugativos, movilizables y no transferibles. Este fenotipo puede determinarse por
ensayos de conjugación bacteriana entre los aislamientos portadores de plásmidos y cepas bacterianas de referencia, como E. coli o P. putida. En nuestro sistema de estudio, la mayor limitante para evaluar la movilidad plasmídica es el desconocimiento del contenido de los plásmidos (de los cuales en principio no conocemos más que su tamaño aproximado) y consecuentemente la falta de marcadores requeridos para la selección de transconjugantes. Sin embargo, dado que en los aislamientos seleccionados se encontraron algunos fenotipos de tolerancia a antibióticos y metales pesados, podría esperarse que algunos de los genes que confieren dichas resistencias posean localización plasmídica. Bajo esta hipótesis, en una primera etapa realizaron ensayos de conjugación triparentales entre los 35 aislamientos de la colección y cepas de E. coli (HB101 o CV601). Los transconjugantes se seleccionaron en medios conteniendo los 11 antibióticos y 7 metales (separadamente) que se emplearon para determinar la MIC de los aislamientos. Para las conjugaciones triparentales, se utilizaron cepas portadoras de plásmidos helper (esto es, plásmidos conjugativos que aportan los genes MPF necesarios para movilizar plásmidos de tipo movilizables). Las conjugaciones triparentales generaron transconjugantes para 6 aislamientos distintos en 7 condiciones de selección diferentes (ver Tabla III.3), indicando la presencia de plásmidos movilizables en estos aislamientos de la colección.
En una etapa posterior se realizaron conjugaciones biparentales con el propósito de determinar si estos 6 aislamientos, que generaron transconjugantes en conjugaciones triparentales, poseían plásmidos automovilizables (conjugativos). Se realizaron ensayos utilizando E. coli HB101 o CV601 y cada uno de los 6 aislamientos como cepas receptoras y dadoras, respectivamente. Los ensayos fueron repetidos varias veces empleando una relación [dadora:receptora] de aproximadamente [108:108]. Como resultado de las conjugaciones biparentales, se obtuvieron transconjugantes cuando se utilizó el aislamiento Alcalígenes sp. BF42 como dador y Hg+2 como agente de selección, indicado que este aislamiento posee un plásmido conjugativo portador de un gen u operón que confiere la resistencia a Hg+2.
Tabla III.3. Plásmidos transmisibles y conjugativos detectados en los aislamientos de la colección
Aislamiento dador Conjugación triparental Conjugación biparental Resistencia Cellulosimicrobium cellulans BF14 + - estreptomicina, gentamicina Microbacterium sp. BF36 + - estreptomicina Alcaligenes sp. BF42 + - tetraciclina Alcaligenes sp. BF42 + + Hg+2
Pseudomonas sp. BF61 + - ácido nalidíxico
Bacillus sp. BF71 + - Zn+2
Pseudomonas sp. BF75 + - Zn+2
En el resto de las conjugaciones tri y biparentales no se detectaron transconjugantes. Esto sugiere que dichos plásmidos no serían movilizables/ conjugativos o bien que se transferirían a una frecuencia muy baja (menor que 10- 8
/célula donadora). Sin embargo, estos resultados deben considerarse con cautela. Por un lado la ausencia de marcadores de selección conocidos para el seguimiento de la transferencia de muchos plásmidos puede hacer que las frecuencias de conjugación sean a veces difíciles de detectar y cuantificar. Además, la expresión de genes del sistema de transferencia conjugativa puede estar altamente regulada y requerir de inductores que no siempre están presentes en las condiciones experimentales de laboratorio (More, et al., 1996, Li, et al., 1998). Asimismo, la transferencia conjugativa puede depender del background genómico de la cepa dadora y requiere que los plásmidos sean replicativos en las cepas de E. coli utilizadas como receptoras.
Como puede observarse en la Tabla III.3, el aislamiento de Alcalígenes BF42 posee dos plásmidos: uno conjugativo (de resistencia a Hg+2) y otro movilizable (de resistencia a tetraciclina). Hemos comprobado que las tolerancias al antibiótico y al metal fueron transferidas independientemente. Otro punto interesante, es la presencia de plásmidos movilizables en tres aislamientos Gram-positivos:
cuales confieren resistencia a gentamicina/estreptomicina, estreptomicina y Zn+2, respectivamente, indicando la capacidad de tales plásmidos de replicar tanto en bacterias Gram-positivas como Gram-negativas.
III.7. Discusión
En este Capítulo hemos establecido una colección de 75 aislamientos bacterianos portadores de plásmidos de alto peso molecular, entre los cuales 35 fueron seleccionados como aislamientos representativos. Se realizó una primera caracterización genotípica de los aislamientos en la que se determinó la identidad de los mismos, y una caracterización fenotípica, analizándose su tolerancia a distintos antibióticos y metales pesados. Dado que estas bacterias son portadoras de plásmidos, era esperable encontrar fenotipos de resistencia ya que los plásmidos juegan un rol clave en la diseminación de este tipo de genes, no sólo en aquellos ambientes que presentan una presión de selección (como los hospitales o desechos animales en granjas), sino también en ambientes que no la presentan. Se han reportado plásmidos conteniendo genes de resistencia en ambientes prístinos libres de contaminación antropogénica (Allen, et al., 2009, Berglund, 2015). Si bien los plásmidos son los elementos más importantes en el esparcimiento de estos genes, el hecho de que los aislamientos presenten un fenotipo de tolerancia a un antibiótico o metal no implica que esta resistencia se encuentre codificada en un plásmido.
En cuanto a los plásmidos presentes en los aislamientos seleccionados, se estimó que la colección de aislamientos representativos cuenta con al menos 50 plásmidos de alto peso molecular y mediante la técnica de lisis in situ y se determinó que sus tamaños varían entre 30 y 1.500 Kpb aproximadamente. Dos de estos plásmidos pudieron ser asignados a grupos de incompatibilidad plasmídica de amplio rango de huésped, mientras que los restantes no pudieron clasificarse. Esto sugiere la presencia de plásmidos de otros grupos de incompatibilidad plasmídica no ensayados en este trabajo, o bien de grupos que aún no han sido caracterizados. Por otro lado, se ha evaluado la movilidad de los plásmidos, encontrándose al menos 6 replicones movilizables y 1 conjugativo. Tal como mencionamos en la sección III.6, estos
resultados deben analizarse con cuidado dado que la metodología empleada sólo permite visualizar eventos de conjugación siempre y cuando haya un gen de resistencia a alguno de los antibióticos o metales utilizados en el ensayo; probablemente exista un mayor número de plásmidos en la colección que tengan un fenotipo móvil, pero que no contengan en sus esqueletos algún gen de resistencia. Asimismo, la transferencia conjugativa puede estar altamente regulada, depender del
background genómico de la cepa dadora y además requiere que los plásmidos sean capaces de replicar en la cepa receptora utilizada.
Adicionalmente, encontramos que el aislamiento de Alcalígenes BF42 posee al menos dos plásmidos: uno conjugativo (de resistencia a Hg+2) y otro movilizable (de resistencia a tetraciclina), y este aislamiento mostró señal positiva en el abordaje utilizado para detectar replicones IncP-1. En particular, los plásmidos IncP-1 son relativamente grandes (50 a 500 kpb) y por lo general contienen otros MGEs asociados, tales como integrones, secuencias de inserción y transposones, llevando genes de resistencia a antibióticos y metales, así como agrupaciones de genes catabólicos (Dennis, 2005). A los plásmidos IncP-7 se los ha asociado con la degradación de contaminantes orgánicos y naturales (Dennis, 2005). La baja proporción de plásmidos similares a IncP dentro de la colección bacteriana sugiere que plásmidos de otros grupos de incompatibilidad podrían ser los responsables de la difusión de información en la comunidad BPS. Por otra parte, es concebible que estos plásmidos codifiquen funciones de replicación y genes de mantenimiento diferentes a los de los plásmidos caracterizados anteriormente de aislamientos clínicos y ambientales.
Para dar continuidad al estudio realizado en el presente capítulo, presentaremos en los capítulos siguientes los resultados referidos a la caracterización genotípica y al análisis in silico de los tipos de replicones y genes asociados a movilidad presentes en nuestra colección de aislamientos.