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DISEÑO DE UNA ESTRATEGIA Y CONSTRUCCIÓN DE LAS HERRAMIENTAS MOLECULARES NECESARIAS

TRANSPOSANTES TRANSCONJUGANTES

DONOR RECEPTOR/ES DONOR en el cromosoma en el p-target TRANSPOSANTES Me zc la d e b ac teria s p-RESC E. coliHB101 pBAD-SceI RfR

E. coli HB101 pBAD p-target::transposón RfR Arabinosa Selección en LB con arabinosa, Km, Zeo y Rf B1 Conjugación triparental

+

RECEPTOR FINAL DONADORES HELPER Suspensión de bacterias (en masa)

Plaqueo (mezcla de bacterias)

TRANSPOSANTES TRANSCONJUGANTES RECEPTOR/ES DONOR en el cromosoma en el p-target TRANSPOSANTES M ez cl a d e b act er ia s

+

E. coli HB101 pBAD-SceI RfR Selección en LB con arabinosa, Km, Zeo y Rf Conjugación triparental

+

+

RECEPTOR FINAL DONADORES HELPER

Plaqueo (mezcla de bacterias)

La arabinosa induce el promotor de sceI. SceI

corta en el sitio de reconocimiento de esta enzima en el p-RESC Arabinosa RfR B2 TRANSPOSANTES TRANSCONJUGANTES RECEPTOR/ES DONOR en el cromosoma en el p-target TRANSPOSANTES M ez cl a d e b act er ia s Suspensión de bacterias (en masa)

Primer a et apa Segund a e tapa C Screening Screening: - LB Amp (negativo) - PCR (nptII, positivo)

- Gel de lisis in situ

Colonias resistentes a: Km, Zeo, Rf E. coli HB101 pBAD p-target::transposón RfR Arabinosa Selección en LB con arabinosa, Km, Zeo y Rf

Plaqueo (mezcla de bacterias)

Ter

cer

a

et

De esta manera, la estrategia desarrollada nos permitirá tener en una cepa de clonado, de crecimiento rápido y fácil manipulación, uno o más plásmidos que luego podrán ser fácilmente purificados, secuenciados y caracterizados.

3- La tercera etapa corresponde al screening. Una vez realizada la selección bacteriana en medio LB conteniendo kanamicina, rifampicina y arabinosa, las colonias obtenidas deberán ser chequeadas para corroborar que efectivamente posean la construcción buscada (plásmido target + transposón) en la cepa receptora final (Figura VIII.3.C). Los siguientes controles ayudarán para avanzar en el análisis de las colonias obtenidas:

i) Analizar el crecimiento de las colonias obtenidas en medio conteniendo ampicilina; aquellos clones que crecieran en este medio serán portadores del vector p-RESC, o podrán contener un plásmido target capturado que posea un gen que confiere resistencia a este antibiótico o bien podrán ser resistentes espontáneas.

ii) Analizar el contenido plasmídico de las colonias obtenidas mediante la técnica de lisis in situ de Eckhardt (Materiales y Métodos, II.2.4.3). Esta técnica permitirá distinguir los clones que posean el plásmido p-RESC de aquéllos que contengan el plásmido target con el transposón insertado, e incluso hacer una estimación de su tamaño.

VIII.3. Evaluación de la funcionalidad de las herramientas que emplearemos en la estrategia delineada

Hasta aquí hemos descripto el diseño, construcción y mapa físico del plásmido que contiene al nuevo transposón. El uso de la nueva herramienta en estudios de captura de plásmidos requerirá entonces verificar que, luego de la introducción del

oriV y el oriT, el nuevo minitransposón mantiene sus propiedades de transposición.

VIII.3.1. Evaluación de la frecuencia de transposición del transposón diseñado

original, siendo ésta del orden de 10-3 (transposiciones / célula recipiente) cuando se empleó la cepa de E. coli HB101 como bacteria receptora (Lozano, et al., 2013). Mediante ensayos de transposición realizados en el laboratorio con la versión modificada del transposón, se corroboró que la frecuencia de transposición del mismo resultó coincidente con la previamente descripta, por lo que las modificaciones realizadas sobre el transposón no han modificado su funcionalidad.

VIII.3.2. Evaluación de la actividad de SceI: control de la escisión del p-RESC como consecuencia de la expresión de SceI inducida por la presencia de arabinosa

En el vector pBAD-SceI el promotor Para se induce en presencia de L-arabinosa 0,5% p/v, lo que permite activar la expresión génica de la endonucleasa SceI. En la estrategia diseñada la expresión de la proteína SceI en la segunda etapa es necesaria para evitar la presencia de la construcción p-RESC en la cepa receptora de E. coli

HB101 pBAD-SceI. Para chequear la funcionalidad del sistema de inducción por arabinosa se diseñó un ensayo que se explica a continuación y se esquematiza en la Figura VIII.4. Se realizó una conjugación biparental entre E. coli S17-1 conteniendo el p- RESC y E. coli HB101 conteniendo el pBAD-SceI, y la suspensión bacteriana fue colocada en una caja de Petri con medio LB sólido conteniendo o no arabinosa. Para evaluar si la preinducción del gen sceI mejora la eficiencia de corte del p-RESC, en uno de los casos se preincubó HB101 pBAD-SceI en medio con arabinosa, para encender el sistema de inducción del promotor Para antes del ingreso del p-RESC a la célula receptora final. Luego, las células se resuspendieron en medio líquido para homogeneizar el cultivo conteniendo rifampicina y zeocina para favorecer el crecimiento de la cepa receptora, y conteniendo o no arabinosa (como se muestra en la Figura VII.4). Finalmente, se realizaron diluciones seriadas de estos cultivos y recuentos (Materiales y Métodos, sección II.1.12) en medio de similar composición a la del cultivo líquido anterior, conteniendo además ampicilina, para seleccionar aquellos transconjugantes que hayan adquirido el vector p-RESC. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: en la placa control (Figura VIII.4.A) se observó crecimiento hasta la dilución 10-6 inclusive, mientras que cuando el sistema se indujo con arabinosa se

observó una reducción del crecimiento en tres órdenes de magnitud (10-3) cuando no se preincubó la E. coli HB101 pBAD-SceI con arabinosa (Figura VIII.4.B) y de 4 órdenes de magnitud cuando sí hubo preincubación con arabinosa (Figura VIII.4.C), viéndose crecimiento en este caso hasta la dilución 10-2. Estos resultados indican que existe un fuerte control en la regulación del promotor Para. Si bien es deseable que no haya crecimiento alguno en presencia de arabinosa, el resultado encontrado podría atribuirse a que el número de copias del vector p-RESC por célula es alto, y en consecuencia su eliminación por acción de la endonucleasa SceI no es completa. Hemos repetido el ensayo con diversas concentraciones de arabinosa, pero no se han obtenido mejores resultados independientemente de las condiciones de inducción diversas del promotor Para analizadas.

Figura VIII.4. Esquema de los ensayos realizados a fin de evaluar la inducción por arabinosa y la expresión de SceI. A) control: conjugación entre S17-1 p-RESC y HB101 pBAD-SceI sin inducción por arabinosa. En la placa se observa el crecimiento de todos los transcojugantes (E. coli HB101 pBAD-SceI que adquirieron el p- RESC). B) Inducción con arabinosa sin preinducción del cultivo de E. coli HB101 pBAD-SceI. C) Inducción con arabinosa con preinducción de la endonucleasa en el cultivo de E. coli HB101 pBAD-SceI. Los recuentos se realizaron por el método de la gota (el número de colonias en el esquema es sólo ilustrativo).

E. coliHB101 + pBAD-SceI En LB con arabinosa 0,5% E. coliHB101 + pBAD-SceI En LB sin arabinosa E. coliS-17 + p-RESC En medio LB

Medio LB sin arabinosa

Medio LB con arabinosa 0,5% Medio LB con arabinosa 0,5%

Medio LB sin arabinosa, con zeocina y rifamipicina

Medio LB con arabinosa 0,5%, con zeocina y rifamipicina

Medio LB con arabinosa 0,5%, con zeocina y rifamipicina

Medio LB sin arabinosa, con zeocina, rifamipicina y

ampicilina

Medio LB con arabinosa 0,5%, con zeocina, rifamipicina y

ampicilina

Medio LB con arabinosa 0,5%, con zeocina, rifamipicina y

ampicilina

Conjugación biparental Resuspensión y cultivo Selección A B C 24 hs 24 hs 24 hs 1 h 1 h 1 h

VIII.4. Validación del sistema de captura de plásmidos mediada por el vector p-RESC

En un último ensayo se procedió a desarrollar el protocolo completo planteado para la captura de plásmidos. Si bien el sistema fue diseñado con el objetivo de aislar plásmidos de comunidades bacterianas y de aislamientos bacterianos que porten plásmidos desconocidos, en una primera instancia se utilizaron plásmidos de tamaño y características conocidas (poseen un marcador de selección positivo), a fin de simplificar el screening y la validación del sistema de captura diseñado.

VIII.4.1. Elección de plásmidos target para la evaluación del sistema

A fin de evaluar el funcionamiento de la la metodología diseñada, se escogieron dos plásmidos target de características diversas: i) pLT06, el cual se encuentra en una cepa de E. coli y tiene un tamaño de 8 Kb, disponemos de su secuencia, posee un gen de resistencia a cloranfenicol (CmR), un origen de replicación termosensible (que le permite replicar a 28 °C o temperaturas inferiores pero no puede hacerlo a 37 °C) y no contiene oriT; ii) pAci39, el cual se encuentra en un aislamiento clínico de Enterobacter

sp. que ha sido caracterizado en nuestro laboratorio (Salto, Tesis en redacción). El plásmido pAci39 posee un tamaño estimado de 40 Kb y confiere resistencia a plata (AgR), aunque se desconoce su mapa físico y secuencia. La elección del plásmido pLT06 se debe, pese a su tamaño pequeño, a la imposibilidad de moverse por sí mismo y de replicar a una cierta temperatura, por lo cual sería esperable que, si luego de realizar el protocolo experimental diseñado se evidencia su presencia en la cepa huésped HB101 pBAD-SceI, ésta sería consecuencia de la incorporación del transposón. En cuanto al plásmido pAci39, su elección se debe principalmente a su mayor tamaño, a la existencia de un gen marcador (AgR) y a su imposibilidad de movilizarlo en ensayos previos realizados en el laboratorio, por lo cual su movilidad se atribuiría a la presencia del transposón aportado por el p-RESC.

VIII.4.2. Prueba de la estrategia diseñada

como se indica a continuación, empleando como plásmidos target pLT06 (contenido en E. coli Top10) o el pAci39 (contenido en Enterobacter sp.).

1. En una primera etapa se realizaron dos conjugaciones biparentales independientes: 1) entre E. coli S17-1 p-RESC y Enterobacter sp. pAci39, 2) entre E. coli

S17-1 p-RESC y E. coli Top10 pLT06. Las suspensiones bacterianas de cada conjugación (y los controles de ambos cultivos) se incubaron en medio LB a 28 °C durante 24 horas.

2. Luego se realizó la segunda conjugación (triparental) entre la suspensión bacteriana resultante de cada primer conjugación con la cepa E. coli HB101 pBAD-SceI y el plásmido pRK2013 como helper. Las conjugaciones (y los controles correspondientes a cada cultivo), se incubaron en medio LB con arabinosa a 28 °C durante 24 horas.

3. Finalmente, la mezcla de bacterias se suspendieron en medio LB suplementado con arabinosa, rifampicina y kanamicina, en donde se incubaron durante 6 horas. De estos cultivos se realizaron diluciones seriadas y recuentos en placas de LB suplementado con rifampicina, kanamicina, arabinosa, zeocina, más cloranfenicol o AgNO3 (dependiendo de si el target utilizado fue el plásmido pLT06 o el pAci39, respectivamente) y conteniendo (o no) ampicilina.

VIII.4.3. Resultados obtenidos

De acuerdo con la metodología utilizada, debería esperarse que aquellas colonias que crecen en medio conteniendo kanamicina, rifampicina y cloranfenicol o AgNO3 (dependiendo del plásmido empleado) contengan el plásmido target con el transposón insertado en alguna posición de su esqueleto. Por el contrario, en aquellas placas que fueron suplementadas con ampicilina, no debería observarse crecimiento, ya que el gen que confiere esta resistencia está presente en el p-RESC. Sin embargo, al realizar el screening mencionado (para los dos plásmidos ensayados) observamos en las placas con y sin ampicilina, crecimiento en el plaqueo directo y en la dilución 10-1. Los resultados de este procedimiento fueron similares en 3 ensayos independientes realizados. Estos resultados indican que todas las colonias obtenidas contendrían aún