MATERIALES Y MÉTODOS
II.1. Técnicas microbiológicas
II.1.1.Cepas bacterianas utilizadas en este trabajo
Las cepas bacterianas utilizadas en este trabajo y sus características más relevantes se muestran en la Tabla II.1.
Cepa Características relevantes Referencias
Escherichia coli CV601 thr, leu, thi, RfR, GFP (Smalla, et al., 2006) Escherichia coli CSH26 F−araΔ(lac-pro) thi, RfR (Miller, 1972) Escherichia coli HB101 pro, leu, thi, lacY, endA, recA, hsdR,
hsdM, RfR, SmR
(Boyer & Roulland- Dussoix, 1969) Escherichia coli HB101 pRK600 tra+, CmR, RfR (Finan, et al., 1986) Escherichia coli HB101 pRK2013 tra+, KmR, RfR (Figurski & Helinski, 1979)
Ensifer meliloti MVII-1 SmR (Hynes, et al.), 1986 Escherichia coli DH5 recA1, endA1, 80d, lacZ, dm15 Bethesda Laboratory Escherichia coli S17-1 294 recA, RP4 integrado
cromosomalmente, TcR
(Simon, et al., 1983)
Escherichia coli BL21(DE3)Star F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3)
Invitrogen
Agrobacterium tumefaciens UBAPF2
Curada del plásmido pAtC58, RfR (Hynes, et al., 1985)
Proteus mirabilis PR9 Aislamiento clínico portador de un integrón de clase 1 y clase 2
(Arduino, et al., 2012)
Escherichia coli pLT06 Cepa portadora del plásmido pLT06, CmR (Thurlow, et al., 2009)
Enterobacter sp. pAci39 Cepa portadora del plásmido pAci39, AgR Salto y Pistorio, comunicación personal BF02 Ochrobactrum sp. Aislamiento portador de plásmido/s de
alto peso molecular obtenido del BPS de Kortrijk, Bélgica *
(Martini, et al., 2015)
BF13 Ochrobactrum sp. Idem * Martini, et al., 2015
BF14 Cellulosimicrobium cellulans
Idem * Martini, et al., 2015
BF15 Ochrobactrum sp. Idem * Martini, et al., 2015
Tabla II.1. (continuación)
Cepa Características relevantes Referencias
BF19 Variovorax sp. Idem * Martini, et al., 2015
BF21 Paenibacillus sp. Idem * Martini, et al., 2015 BF22 Paenibacillus tundra Idem * Martini, et al., 2015 BF25 Pseudomonas putida Idem * Martini, et al., 2015
BF27 Pseudomonas sp. Idem * Martini, et al., 2015
BF28 Paenibacillus xylanexedens
Idem * Martini, et al., 2015
BF30 Bordetella sp. Idem * Martini, et al., 2015
BF31 Cellulosimicrobium sp. Idem * Martini, et al., 2015 BF33 Pseudomonas putida Idem * Martini, et al., 2015 BF36 Microbacterium sp. Idem * Martini, et al., 2015
BF37 Serratia sp. Idem * Martini, et al., 2015
BF42 Alcaligenes sp. Idem * Martini, et al., 2015
BF43 Serratia sp. Idem * Martini, et al., 2015
BF44 Microbacterium oxydans Idem * Martini, et al., 2015
BF46 Serratia sp. Idem * Martini, et al., 2015
BF48 Microbacterium sp. Idem * Martini, et al., 2015 BF52 Brevibacterium sp. Idem * Martini, et al., 2015 BF53 Agromyces cerinus Idem * Martini, et al., 2015 BF55 Pseudomonas putida Idem * Martini, et al., 2015 BF56 Acinetobacter sp. Idem * Martini, et al., 2015
BF58 Pseudomonas sp. Idem * Martini, et al., 2015
BF59 Sphingobacterium sp. Idem * Martini, et al., 2015 BF60 Sphingobacterium sp. Idem * Martini, et al., 2015
BF61 Pseudomonas sp. Idem * Martini, et al., 2015
BF62 Pseudomonas sp. Idem * Martini, et al., 2015
BF67 Pseudomonas sp. Idem * Martini, et al., 2015
BF68 Pseudomonas sp. Idem * Martini, et al., 2015
BF70 Bacillus pumilus Idem * Martini, et al., 2015
BF71 Bacillus sp. Idem * Martini, et al., 2015
BF73 Bacillus megaterium Idem * Martini, et al., 2015
II.1.2. Plásmidos utilizados en este trabajo
Los plásmidos utilizados en este trabajo y sus características más importantes se muestran en la Tabla II.2.
Plásmido Características relevantes Referencias
pBAM1 tnpA, oriR6K, oriT, ApR, KmR (Martinez-Garcia, et al., 2011)
pET22b(+) Vector de expresión, ApR Novagen
pET22b(+)::lac188 Construcción que contiene el gen de la lacasa lac188, ApR
Este trabajo
pK18mob Vector de clonado, mob, KmR (Schafer, et al., 1994) pG18mob Vector de clonado, mob, GmR (Kirchner & Tauch, 2003) pUC19mob Vector de clonado de alto número de copias,
mob, ApR
New England Biolabs
pSM10 mob, GmR (Selbitschka, et al., 1995)
pUC57 Vector de clonado, ApR GenScript
pLT06 Origen de replicación termosensible, P-pheS, cat, lacZ, CmR
(Thurlow, et al., 2009)
pAci39 AgR Salto y Pistorio, comunicación
personal RN3 Plásmido utilizado como control positivo para
grupo de incompatibilidad IncN
(Gotz, et al., 1996)
R388 Plásmido utilizado como control positivo para grupo de incompatibilidad IncW
(Llosa, et al., 1991)
RSF1010 Plásmido utilizado como control positivo para grupo de incompatibilidad IncQ
(Nagahari & Sakaguchi, 1978) pKJK5 Plásmido utilizado como control positivo para
grupo de incompatibilidad IncP-1
(Bahl, et al., 2007)
pCAR1 Plásmido utilizado como control positivo para grupo de incompatibilidad IncP-7
Izmalkova, et al., 2005
pM3 Plásmido utilizado como control positivo para grupo de incompatibilidad IncP-9 α
(Dealtry, et al., 2014) b pBS2 Plásmido utilizado como control positivo para
grupo de incompatibilidad IncP-9 β
Dealtry, et al., 2014 b pBS265 Plásmido utilizado como control positivo para
grupo de incompatibilidad IncP-9 γ
Dealtry, et al., 2014 b
II.1.3. Medios de cultivo y conservación de microorganismos
II.1.3.1. Medios de cultivo sólidos y líquidos
Los medios de cultivo utilizados en este trabajo, así como su composición detallada, se indican en la Tabla II.3. Todos los medios ricos fueron preparados y luego esterilizados en autoclave a 120 °C por 20 minutos a 1 atm de sobrepresión. Los medios mínimos fueron preparados esterilizando previamente las soluciones stock de los micronutrientes (1000 X) por filtración y luego agregando las cantidades adecuadas Tabla II.2 (continuación)
Plásmido Características relevantes Referencias
pSN11 Plásmido utilizado como control positivo para grupo de incompatibilidad IncP-9 δ
Dealtry ,et al., 2014 b pMG18 Plásmido utilizado como control positivo para
grupo de incompatibilidad IncP-9 ε
Dealtry ,et al., 2014 b pNL60 Plásmido utilizado como control positivo para
grupo de incompatibilidad IncP-9 ζ
Dealtry ,et al., 2014 b pNL15 Plásmido utilizado como control positivo para
grupo de incompatibilidad IncP-9 η
Dealtry ,et al., 2014 b pSVS15 Plásmido utilizado como control positivo para
grupo de incompatibilidad IncP-9 θ
Dealtry ,et al., 2014 b pNL22 Plásmido utilizado como control positivo para
grupo de incompatibilidad IncP-9 ι
Dealtry ,et al., 2014 b pBAM1-oriV KmR, ApR. Construcción derivada del pBAM1 con
el fragmento que contiene el oriV del pSM10
Este trabajo
pBAM1-oriV-SceI KmR, ApR. Construcción derivada del pBAM1 que contiene el oriV del pSM10 y el sitio de
reconocimiento de la endonucleasa SceI en el sitio SwaI
Este trabajo
pBAM1-oriV-SceI Sin oriR6K/oriT
KmR, ApR. Construcción derivada del pBAM1-oriV- SceI; se le eliminaron el oriVR6K y oriT originales del pBAM1
Este trabajo
p-RESC KmR, ApR. Construcción derivada del pBAM1-oriV- SceI, sin oriR6K/oriT con el oriT del pUC19mob. Utilizada para la captura de plásmidos.
a una solución de ágar-agua previamente esterilizada en autoclave. La composición de los medios líquidos es similar a la composición de los sólidos, excepto que a los líquidos no se les adicionó 1,5% de ágar. Todos los medios fueron llevados a volumen con agua destilada.
Medio Composición (por litro) Referencia
Medios de cultivo complejos
LB (Luria-Bertani) Glucosa 1 g (Sambrook, et al., 1989) NaCl 5 g Triptona 10 g Agar 15 g TY (Tryptone-Yeast) CaCl2.2H2O 0,7 g (Beringer, 1974) Triptona 5 g Extracto de levadura 3 g Agar 15 g EMB (Eosin Methylene Blue ) Peptona 10 g (Levine, 1918) Lactosa 5 g Sacarosa 5 g Fosfato dipotásico 2 g Eosina 0,4 g Azul de metileno 0,065 g Agar 13,5 g Dex (Dextrose-agar )
Digerido enzimático de caseína 10 g
Sigma-Aldrich Dextrosa 40 g Agar 15 g MCk (Mac Conkey) Peptona 17 g (Macconkey, 1905) Pluripeptona 3 g Lactosa 10 g
Mezcla de sales biliares 1,5 g
NaCl 5 g Rojo neutro 0,03 g Cristal violeta 0,001 g Agar 13,5 g MH (Mueller-Hinton) Infusión de carne 300 g Oxoid Ltd. Peptona ácida de caseína 17,5 g
Almidón 1,5 g
Agar 15 g
Tabla .3 (continuación)
Medios de cultivo mínimos
GS (Glutamato- sacarosa)
Sacarosa 29,2 mM
(del Papa, et al., 1999)
Glutamato sódico 2,67 mM K2HPO4.3H2O 0,15 mM KH2PO4 0,15 mM Na2SO4 0,7 mM MgSO4.7H2O 1 mM CaCl2.2H2O 1 mM H3BO3 0,048 mM MnSO4.H2O 0,01 mM ZnSO4.7H2O 0,01 mM CuSO4.5H2O 0,048 mM CoCl2.6H2O 0,0005 mM Na2MoO4.2H2O 0,001 mM FeCl3.3H2O 0,001 mM Tiamina HCl 0,00295 mM Ácido Pantoténico 0,0042 mM Biotina 0,000082 mM PIPES 20 mM agar 15 g M9 Na2HPO4 5,8 g (Miller, 1972) KH2PO4 3 g NaCl 0,5 g NH4Cl 1 g Glucosa 10 g agar 15 g
II.1.3.2. Medios de conservación bacterianos
Para conservar a largo plazo las bacterias, éstas se cultivaron previamente hasta fase logarítmica tardía en LB o el medio adecuado y se suplementaron con glicerol al 50% (v/v) y 25% (v/v) para su conservación a -20 °C y -80 °C respectivamente. Para uso rutinario, alícuotas de estas reservas se hicieron crecer en medio sólido con el/los antibióticos correspondientes.