Caracterización de los anticuerpos desarrollados en un modelo animal de

candidemia en conejo infectado con Candida

albicans

4.1.1 Reacción de la fracción de IgG totales por inmunofluorescencia indirecta (IFI) frente a

Candida albicans

La reacción de la fracción de IgG totales (total-IgG) de los sueros de conejo infectado 16706 (título AM 1/160, anti-Bl 1/640) y 16715 (título AM 1/160, anti-Bl 1/320) se verificó por inmunofluorescencia indirecta (IFI) frente a Candida albicans. La fracción total IgG reaccionó tanto con blastosporas como con los tubos germinales (Figura/Figure 4.1). En dicha figura se puede observar que a mayor título de anticuerpos específicos frente a C. albicans era necesaria una menor concentración de IgG para evidenciar la reacción, probablemente debido a la mayor representatividad de los anticuerpos anti- Candida entre las IgG totales. Así, el suero 16715 mostró reconocimiento a concentraciones de IgG ≥ 50 µg/ml.

4.1.2 Caracterización de los CAGTA mediante ELISA

Mediante estudios de inmunoproteómica, en nuestro laboratorio se han identificado algunos antígenos reconocidos por los CAGTA (Sáez-Rosón et al., 2014). Estos antígenos incluyen proteínas que se han producido posteriormente en nuestro laboratorio de forma recombinante en Escherichia coli, entre las que se encuentran 14-3-3, Adh1, Als3-N, Eno-1, Met-6 y Hwp1-N. Con el fin de determinar la respuesta de anticuerpos frente a estos antígenos en el modelo animal y su evolución a lo largo de la infección, en primer lugar, se obtuvieron estas proteínas recombinantes para su posterior utilización en ensayos de ELISA.

4.1.2.1 Producción de Hyphal Wall Protein (Hwp1-N)

Las cepas de E. coli transformadas con los plásmidos codificantes de las diferentes proteínas, construidas previamente por colaboradores de nuestro grupo de investigación, se cultivaron para obtener dichas proteínas recombinantes y su posterior purificación. Como ejemplo se muestra el proceso de producción y purificación de Hwp1-N siguiendo el protocolo descrito por Laín y colaboradores (Laín et al., 2007a) (Figura/Figure 4.2 y Figura/Figure 4.3).

.

1

(a) (b)

Figura/Figure 4.1 Reacción de IgG totales de los sueros de conejo 16706 (a) y 16715 (b)

con tubos germinales de C. albicans. Inmunofluorescencia indirecta de la reactividad. Concentración de la fracción total de IgG (6,25-200 µg/ml). En cada caso se presentan parejas de imágenes: a la izquierda microscopía de fluorescencia con el anticuerpo secundario conjugado a FITC, y a la derecha su correspondiente imagen por microscopia óptica de contraste de fases. La barra representa 50 µm de longitud.

Figura/Figure 4.2 Expresión de la proteína Hwp1-N. Extractos proteicos, separados por

SDS-PAGE, de los cultivos de E. coli RosettaTM (DE3) conteniendo el plásmido recombinante para Hwp1-N, a lo largo del tiempo de incubación (0, 1, 2, 3 y 4 horas) a 37˚C. El panel izquierdo muestra el gel teñido con azul Coomassie y el derecho la inmunodetección con el anticuerpo monoclonal anti-HSV Tag. Calles 2, 4, 6, 8 y 10: extractos de células inducidas con IPTG; Calles 1, 3, 5, 7, 9: extractos de células sin inducir.

Una vez inducida la proteína (Figura/Figure 4.2), se purificó a partir de los sobrenadantes de cultivo mediante cromatografía de afinidad a níquel posibilitada por la presencia de una cola de histidinas. En cada purificación, se recogieron 7-8 eluidos de unos 3 ml cada uno y se verificó la presencia y pureza de la proteína por electroforesis SDS-PAGE seguida de una tinción con azul Coomassie y un análisis Western Blotting con el anticuerpo monoclonal antiHSV·Tag®_{, comprobando de esta forma en que fracción del} eluido se encontraba la proteína de interés (Figura/Figure 4.3). En el caso de las calles E1 y E2 representadas en esta figura, los eluidos se volvieron a pasar por una columna cromatográfica, obteniendo de esta forma una fracción más pura de la proteína.

0 h 1 h 2 h 3 h 4 h - + 0 h 1 h 2 h 3 h 4 h 30 kDa 50 kDa Tiempo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 - + - + - + - + - + - + - + - + - +

4.1.2.2 Evolución de los títulos de los anticuerpos frente a las proteínas recombinantes

Se estudió por ELISA la capacidad de reconocimiento de los anticuerpos desarrollados en el modelo animal de candidiasis frente a distintos antígenos de C. albicans seleccionados en trabajos previos de nuestro grupo. Como se puede observar en la Figura/Figure 4.4, la evolución de los títulos de anticuerpos IgG específicos para las diferentes proteínas en los dos conejos del ensayo fue muy similar. Todos los sueros mostraron reacción con los antígenos seleccionados, obteniendo los valores más altos frente a la proteína recombinante Hwp1-N, seguida por Adh1, Met-6, y Eno-1, así como con la enolasa purificada a partir de un extracto de pared de tubos germinales de C. albicans. En el caso de los anticuerpos anti-14-3-3 y anti-Als3-N los perfiles de ambos conejos fueron bajos y mantenidos. La aparición de anticuerpos con distintas especificidades siguió un patrón diferente para las proteínas ensayadas. Los anticuerpos contra Hwp1-N inician su elevación tras la primera inoculación con blastosporas vivas de C. albicans, alcanzando valores máximos tras la segunda inoculación. La reacción con Eno-1 y Eno-pared alcanza valores máximos tras la segunda inoculación y consecutivas. En contraste, los anticuerpos frente a Adh1 y Met-6 requirieron cuatro tandas de inoculación antes de elevar sus títulos.

E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7

M E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7

80 kDa 50 kDa 30 kDa

Figura/Figure 4.3 Eluidos recogidos en el proceso de purificación de la proteína

recombinante Hwp1-N por cromatografía de afinidad a níquel. El panel izquierdo muestra el gel teñido con azul Coomassie y el derecho la inmunodetección con el anticuerpo monoclonal anti-HSV·Tag. Calles: M es el marcador de tamaño molecular; E1, E2, E3, E4, E5, E6 y E7: distintas fracciones de eluidos recogidas.

Figura/Figure 4.4 Evolución de los títulos de anticuerpos (absorbancia relativa) en el

modelo animal de candidiasis invasora (conejos 167 y 168) frente a las proteínas de

C. albicans 14-3-3, Adh1, Als3-N, Eno-1, Eno-Pared, Met-6 y Hwp1-N. Las flechas se

corresponden a los días de inoculación intravenosa con 2x106 _{blastosporas viables de}

4.2 Selección de antígenos reconocidos por CAGTA mediante rastreo de una