En el presente trabajo hemos estudiado las propiedades espectroscópicas del cromóforo de los fitocromos sobre un modelo del mismo, y hemos comprobado que son reproducibles y están en acuerdo con los datos experimentales de la bibliografía. Todo esto lleva a dar por buenos tanto la metodología como el modelo utilizados en el estudio de la desactivación fotoquímica de dicho cromóforo.
El estudio presenta, además, un esquema de la fotoquímica intrínseca del cromóforo de los fitocromos que permite explicar de forma cualitativa su comportamiento, observado tanto en disolución como en el interior de la proteína.
Con nuestro estudio añadimos, a los conocimientos que ya se disponen sobre la fotofísica/fotoquímica de este cromóforo, que existen rutas de isomerización competitivas, casi sin barrera, que conducen a la formación de unas TICT-CIs, de estructura girada, en las que se ha transfererido carga desde una parte de la molécula a la otra. Desde dichas CIs se produce el decaimiento no radiativo ultrarrápido multicanal, o multiexponencial.
De acuerdo con nuestros resultados CASPT2//CIS, PLA correspondería a un estado intermedio excitado temprano (I*) y D a uno tardío (en la escala de los 3 ps de formación) correspondiente al estado intermedio excitado (Lumi-R*).
El decaimiento desde D se asignaría a una componente de desactivación más lenta (alrededor de 30 ps), mientras que los caminos inactivos biológicamente, B y C, conducirían a la desactivación rápida (3 ps) y principal depleción del estado excitado.
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Del mismo modo explicaría el menor rendimiento cuántico observado a través de D y la disminución en la intensidad de la señal asociada con las correspondientes señales vibracionales.
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Isoaloxacina, el anillo básico de las
flavinas
Tal como se ha introducido en el capítulo 2, el responsable de la fotoquímica de las flavinas es el anillo de isoaloxacina del FMN completamente oxidado.1,2,3 Después de la absorción de la luz, se forma un aducto cromóforo-proteína que se descompone en una escala de tiempo de minutos en la oscuridad posterior (véase esquema 2.3).4 Además, está totalmente aceptado entre la comunidad científica que, después de la absorción de la luz, el principal paso del fotociclo del FMN consiste en la población del estado excitado singlete más bajo, S1, para posteriormente
experimentar un rápido decaimiento al estado excitado triplete más bajo, T1,
a través de un mecanismo de cruce entre sistemas, ISC.5-9 La transferencia fotoinducida de electrones al triplete de las flavinas, que se comportan como aceptores, ha sido ampliamente analizada por medio de diferentes técnicas experimentales,10,11 y en este capítulo presentamos el análisis detallado del proceso no radiativo singlete-triplete dentro del marco de la fotoquímica adiabática. En particular, al iniciar la investigación sobre este fotociclo nos planteamos la cuestión clave de si la relajación del estado triplete consiste en un acoplamiento directo entre los estados singlete y triplete más bajos o se produce a través de un tercer estado excitado. Para dar respuesta a esta cuestión, se estudió, con cálculos químico-cuánticos ab initio, el mecanismo detallado de la fotoquímica de la isoaloxacina (benzo[g]pteridina-2, 4 (3H, 10H)-diona) (véase figura 4.1), que es el anillo básico de las flavinas. La elección de este anillo se fundamenta en que los espectros electrónicos de la lumiflavina, la 8-metil-isoaloxacina y la riboflavina muestran las mismas características, pudiendo ser descritos como típicos de isoaloxacinas12 en la
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región de energías hasta 5.5 eV, en que el espectro de absorción de estos sistemas se compone principalmente de tres bandas. Por otro lado, no se han encontrado diferencias significativas en los espectros de polarización de la lumiflavina, la riboflavina y el FMN en relación con la molécula original, la forma oxidada del anillo de la isoaloxacina13 y, por tanto, se puede esperar que éste sea el responsable de la fotoquímica de las flavinas.
Figura 4.1. Estructura y numeración de los átomos del anillo de isoaloxacina, cromóforo de las flavinas.
Se presenta, en este capítulo, la investigación teórica sobre los estados excitados de valencia de la molécula de isoaloxacina que han sido caracterizados mediante el método CASPT2//CASSCF,14 que ha demostrado su eficacia en la interpretación de los espectros electrónicos en un gran número de compuestos orgánicos15-23 y de cromóforos de distintas biomoléculas24-27 (estas últimas estudiadas por el grupo de Química Cuántica del Estado Excitado de la Universidad de Valencia, QCEXVAL). El presente trabajo incluye la determinación de las energías de transición vertical, orígenes de la banda y máximos de emisión relacionados con los estados excitados de valencia singlete y triplete más bajos del anillo de isoaloxacina. Además, se presentan los resultados obtenidos del análisis realizado de la relajación electrónica del sistema excitado a lo largo de la hipersuperficie de S1 que conduce a la población del estado triplete más bajo
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Detalles computacionales
Las optimizaciones de la geometría del estado fundamental y de los estados excitados de valencia más bajos se llevaron a cabo a nivel CASSCF.28 El espacio activo π de valencia del anillo de isoaloxacina incluye 18 electrones y 16 orbitales moleculares, CASSCF(18,16). El espacio activo para el cálculo de los estados de carácter ππ*, después de una cuidadosa calibración, se redujo a 14 electrones distribuidos en 13 MOs π de valencia, CASSCF(14,13), mientras que para los estados nπ* el espacio activo fue ampliado con los MOs correspondientes a los pares solitarios, manteniendo inactivo el MO π con el número de ocupación más alto del espacio CASSCF(14,13) y pasando al espacio secundario el MO π con el número de ocupación más bajo en dicha función, dando finalmente una función de onda CASSCF(16,13). Los resultados que se presentan corresponde, en todos los casos, a cálculos realizados con el conjunto de bases 6-31G(d), ya que la inclusión de funciones de polarización en los átomos de hidrógeno, mediante el uso de bases 6-31G(dp), tiene, en este caso, un efecto menor sobre el cálculo de las energías electrónicas de transición. Los cálculos exploratorios de las diferentes regiones de las hipersuperficies, del estado fundamental y estados excitados, a partir de geometrías muy distorsionadas del anillo de isoaloxacina acababan siempre en estructuras planas, incluso con bases ANO-S. Es por tanto que, de acuerdo con nuestra investigación, concluimos que la molécula se mantiene plana durante la reacción fotoquímica. Las energías de transición vertical se calcularon, pues, dentro de las limitaciones de simetría Cs. Los MOs de los estados excitados se
obtuvieron de cálculos CASSCF promedio, que incluyen todos los estados de interés dentro de una simetría dada: ocho raíces para los estados 1A', dos raíces para los estados 1,3A'' incluyendo la participación del MO del par solitario (se empleó el mismo tratamiento para los ubicados en los átomos de oxígeno o de nitrógeno, pero en cálculos independientes), y una raíz para el estado más bajo 3A'. El resto de efectos electrónicos de correlación se añadieron al realizar cálculos CASPT2.14 Además, el efecto de la interacción débil de los estados intrusos se minimizó mediante el uso de la técnica level-shift.29 El cálculo de los TDM se realizó con el método
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CASSI,30,31 y éstos, a su vez, se emplearon, junto con las energías CASPT2, para computar la fuerza de oscilador, f, así como para calcular los tiempos de vida media radiativa usando la aproximación de Strickler-Berg.32,33 Desde la geometría FC se realizó un MEP-CASSCF a lo largo de S1,
empleando el algoritmo descrito en la referencia 34 y calculando para cada punto la energía corregida CASPT2. El SOC se calculó de la forma que se describe en la referencia 35, empleándose en todo momento el paquete de cálculo MOLCAS 6.0.36,37