Figura 20 Cuantificación de isoprenoides en el mutante ggpps11‐4 Se crecieron plántulas silvestres (WT)
2.2.2. Confirmación de las interacciones in vivo
Para confirmar los resultados de la inmunoprecipitación y a la vez probar la interacción entre GGPPS11 y PSY se llevaron a cabo dos abordajes diferentes, un ensayo de doble híbrido de levadura y otro de complementación bimolecular de la fluorescencia (BiFC) en células de cebolla.
El ensayo de doble híbrido de levadura se realizó en colaboración con el profesor Ralf Welsch, Universidad de Freiburg, Alemania). Las actividades GGPPS11 y SPPS2 se localizan en el estroma de los plastos y las enzimas PYS y GGR se han detectado asociadas en las membranas tilacoidales (Joyard et al., 2009). Teniendo en cuenta estas consideraciones, se
GUS-GFP
GGPPS11-GFP IgG
IgG
Figura 25. Detección de las proteínas
inmunoprecipitadas GGPPS11‐GFP y GUS‐ GFP mediante Western‐Blot con un anticuerpo específico comercial a‐GFP en plántulas crecidas durante 14 días bajo fotoperiodo de día largo
empleó la variante Split‐Ubiquitin (Y2H‐SUS) que presenta la ventaja principal de que es capaz de detectar interacciones in situ, en el compartimento celular donde ocurran en lugar de requerir un importe de las proteínas de estudio al núcleo. Esta técnica permite por tanto trabajar con proteínas ancladas a membranas, como PSY y GGR, y que además no necesariamente se unan de forma directa sino que formen parte del mismo complejo incluidos aquellos que sean demasiado inestables o transitorios para ser detectados por otros métodos (Johnsson y Varshavsky, 1994; Stagljar et al., 1998). Para ensayar la interacción, cada proteína se fusiona a un fragmento de la ubiquitina los cuales no pueden interaccionar por si solos debido a una mutación en un aminoácido en el fragmento C‐terminal.. Sin embargo, una interacción positiva entre las proteínas de interés, permite la fusión de los dos fragmentos de ubiquitina, la recuperación de la conformación nativa y por tanto la acción de unas proteasas que liberan un factor de transcripción fusionado al fragmento C‐terminal de la ubiquitina. Este factor de transcripción se traslada al núcleo por difusión activando los genes reporteros LacZ y His3 integrados en el genoma de la cepa de levadura empleada. Así la rotura por las proteasas se traduce finalmente en la aparición de colonias en un medio selectivo y en segundo lugar a la actividad β‐galactosidasa de las células supervivientes.
Para llevar a cabo el experimento de Y2H‐SUS, se generaron las construcciones para coexpresar GGPPS11 fusionado al fragmento N‐terminal de la ubiquitina (GGPPS11‐UBN) y las potenciales proteínas interactoras fusionadas al C‐terminal (PSY‐UBC, GGR‐ UBC y SPPS2‐UBC) puesto que la combinación GGPPS11‐UBC sola provocaba una gran activación inespecífica de los genes reporteros (Figura 26). Además, como control positivo de interacción se usaron construcciones similares con la proteína KAT1, cuya homodimerización ya se ha reportado (Obrdlik et al., 2004). Se transformaron las cepas THY.AP4 y THY.AP5 con las construcciones UBN y UBC respectivamente y a continuación se aparearon según la interacción a testar. Las células diploides resultado del apareamiento se cultivaron un medio completo pero sin leucina y triptófano. El ensayo de interacción se realizó en un medio mínimo suplementado con metionina a una concentración de 150 mM para las combinaciones con PSY‐UBC que ayudó a reducir la leve activación de fondo del gen reportero. Para los ensayos de actividad β‐ galactosidasa y la extracción de fitoeno, la levadura se cultivó en un medio completo suplementado con adenina e histidina a 28°C durante toda una noche. Los resultados obtenidos permitieron confirmar una clara interacción entre GGPPS11 y PSY en base al crecimiento en medio selectivo y la actividad β‐galactosidasa de la cepa transformada con las construcciones GGPPS11‐UBN y PSY‐UBC. Además, esta interacción no impedía la actividad enzimática de las proteínas puesto que se detectó la acumulación de fitoeno, el producto de la actividad de PSY, en las células transformadas. En segundo lugar se pudo corroborar la interacción entre GGPPS11 y GGR del mismo modo pero sin embargo, no se pudo evaluar la interacción con SPPS2 mediante este sistema experimental porque la construcción SPPS2‐UBC sola provocó también una gran activación inespecífica de los genes reporteros.
Para confirmar que estas interacciones ocurrían en los plastos de la célula vegetal se realizó un ensayo de BiFC en células de cebolla (Ohad et al., 2007). Con este abordaje se puede ensayar la interacción entre dos proteínas in vivo en base a la reconstrucción de una proteína fluorescente reportera como la YFP a partir de la unión de sus dos mitades unidas a proteínas capaces de interaccionar. La asociación de los dos fragmentos en los que se divide la YFP no ocurre espontáneamente sino que requiere la interacción entre dos proteínas o péptidos que
se hayan fusionado a cada uno de los fragmentos del fluoróforo. Si hay interacción de las proteínas fusionadas, los dos fragmentos del fluoróforo pueden interaccionar para formar una proteína que tiene las mismas propiedades espectrales que la YFP completa observándose señal fluorescente en el orgánulo celular donde se dé la interacción. Sin embargo si las proteínas fusionadas a los fragmentos de YFP no interaccionan, no se reconstituye la YFP y por tanto no se detecta fluorescencia.
Figura 26. Identificación de la interacción in vivo de GGPPS11 con PSY, GGR y SPPS2 mediante el ensayo
de Y2H‐SUS. (A) Crecimiento en medio selectivo de la cepa de levadura coexpresora de las proteínas indicadas. (B) Cuantificación de la interacción mediante un ensayo de actividad β‐galactosidasa a partir de las cepas de levadora coexpresoras de las proteínas indicadas. La actividad β‐galactosida se ha determinado usando o‐nitrofenilglucósido (oNP) como sustrato y se indica en nmol oNP min‐1OD‐1 normalizados por la densidad celular medida a 600 nm (Obrdlik et al., 2004). (C) Niveles de fitoeno en células de levadura coexpresoras de las proteínas indicadas. Los valores de B y C corresponden a la media y a la desviación estándar de 3 réplicas biológicas independientes. La cuantificación se ha realizado según se describe en (Welsch et al., 2010).
En nuestro ensayo se utilizaron los vectores pSPYNE(R)173 y pSPYCE(MR) que contenían los fragmentos N‐terminal (YFPN, aminoácidos 1‐173) y C‐terminal (YFPC, aminoácidos 156‐239) respectivamente de la secuencia codificante para la proteína YFP (Waadt et al., 2008). Como todas las proteínas cloroplastídicas codificadas por el genoma nuclear, la secuencia de aminoácidos de GGPPS11, PSY, GGR y SPPS2 presenta una región en N‐terminal de localización plastídica. Teniendo en cuenta esta característica, el clonaje se diseñó para que la fusión con la YFP ocurriera en el extremo C‐terminal de las proteínas quedando libre el péptido de tránsito que las llevara a los plastos de las células de cebolla. Se amplificaron por PCR la secuencia de nucleótidos codificante para estas proteínas (sin el codón de parada de la traducción) a partir de cDNA de Arabidopsis y se clonaron en los vectores pSPYNE(R)173 y pSPYCE(MR). La interacción se ensayó en células epidérmicas de cebolla donde se introdujo el material genético exógeno de forma transitoria mediante microbombardeo con partículas de oro. Puesto que la eficiencia de transformación con este método no es muy alta, se utilizó un tercer vector que permitía la sobreexpresión de la proteína reportera citosólica DSRed
UBC SPPS2-UBC GGR-UBC KAT1-UBC PSY-UBC GGPS11-UBC
A
ac ti v ida d lac Z fi to en o ( n g /m g D W )B
C
ac ti v ida d lac Z PSYUB GGRUB PSYUBfacilitándose así la detección de las células transformadas que presentaban fluorescencia roja. Se trabajó con la combinación donde GGPPS11 se ha fusionó al dominio C‐terminal de la YFP (GGPPS11‐YFPC) y las enzimas interactoras candidatas al dominio N‐terminal (PSY‐YFPN, GGR‐ YFPN, SSPP2‐ YFPN). Puesto que las enzimas GGPPS forman homodímeros (Kloer et al., 2006; Wang y Dixon, 2009), se usó también la construcción GGPPS11‐ YFPN como control positivo de interacción. Se mezcló el DNA con las partículas de oro y se bombardearon capas monocelulares de cebolla que se incubaron toda la noche a 22ºC y en oscuridad para analizar la señal fluorescente al día siguiente al microscopio confocal. Como se observa en la Figura 27, se reconstituyó la actividad YFP en los plastos con las tres interacciones testadas así como con la homodimerización de GGPPS11 mientas que no se observó fluorescencia en los controles negativos donde uno de los dos dominios de la YFP se sobreexpresó solo.
En conjunto nuestros resultados demuestran que GGPPS11 interacciona con PSY, GGR y SPPS2 in vivo y apuntan a la existencia de una canalización de GGPP en el cloroplasto para la biosíntesis de grupos específicos de isoprenoides mediante la formación de complejos multienzimáticos.
GGPPS11‐YFP
C+
YFP
C+
GGPPS11‐YFP
NPSY‐YFP
NGGR‐YFP
NSPPS2‐YFP
NYFP
NFigura 27. Identificación de la interacción in vivo de GGPPS11 con PSY, GGR y SPPS2 mediante el ensayo
de BiFC. Se microbombardearon células epidérmicas de cebolla con la combinación GGPPS11 fusionada al dominio C‐terminal de la YFP (GGPPS11‐YFPC) y las enzimas interactoras candidatas al dominio N‐ terminal (PSY‐YFPN, GGR‐ YFPN, SSPP2‐ YFPN). Se incluyó también un plásmido codificante para una proteína citosólica como marcador de células transformadas (DsRed). Se muestran imágenes de células representativas de microscopía confocal. Los paneles de la izquierda muestran la fluorescencia de la proteína YFP (verde), indicativo de una interacción positiva. En los de la derecha aparece la imagen obtenida de la superposición de la fluorescencia de la YFP (verde), del DsRed (roja) y el campo claro. El punteado verde fluorescente corresponde a los plastos (leucoplastos).