El GGPP constituye un precursor central para producción de diversos grupos de isoprenoides plastídicos que presentan funciones dentro del metabolismo tanto primario
como secundario de las plantas (Figura 3). En el metabolismo plastídico, el GGPP es precursor de los carotenoides y productos derivados de ellos como las hormonas ácido abcísico (ABA) y estrigolactonas (SL), las clorofilas, los tocoferoles, las filoquinonas, las giberelinas, las plastoquinonas y otros diterpenos. En este apartado se va a detallar la síntesis de todos estos compuestos dejando los carotenoides para el capítulo siguiente por su importancia en la tesis.
4.1. Diterpenos.
Estos compuestos presentan una estructura compuesta por 20 átomos de carbono derivada del GGPP que es transformado en primer lugar por la acción de diferentes diterpeno sintasas. Dentro de este apartado se engloban las giberelinas y fitoalexinas y varios diterpenos volátiles como el TMTT. La síntesis de este último se inicia con la formación del alcohol geranillinalol mediante la actividad reductasa de la terpeno sintasa TPS04 (Figura 3). Se ha determinado que esta enzima ejerce su función en el citosol lo que implica la síntesis de GGPP citosólico o su importe desde el cloroplasto (Herde et al., 2008). Estudios del laboratorio de la profesora D. Tholl sugieren que la segunda opción es la más favorable porque cuando tratan las plantas con fosmidomicina, observan una reducción en los niveles de TMTT (Tholl y Lee, 2011).
Las giberelinas (GAs) constituyen un conjunto de hormonas vegetales cuyas funciones principales son la estimulación del crecimiento mediante el aumento de la elongación celular y, en algunos casos, la división celular. Además, son capaces de inducir ciertos cambios en el desarrollo como el cambio entre la dormancia y la germinación de la semilla, las fases de crecimiento juvenil y adulta y el desarrollo vegetativo y reproductivo (Davière y Achard, 2013). Estos compuestos son ácidos carboxílicos derivados de terpenoides tetracíclicos. La biosíntesis y su regulación está ampliamente revisada en (Hedden y Thomas, 2012). El primer paso de esta ruta consiste en una primera ciclación del GGPP para formar ent‐copalildifosfato (CPP), paso catalizado por la enzima CPP sintasa (CPS) (Figura 3). A continuación, el CPP se vuelve a ciclar para formar el ent‐caur‐16‐eno mediante la acción de otra terpeno sintasa, la ent‐caureno sintasa (KS). Estos dos primeros pasos ocurren en el plasto pero la conversión del ent‐caureno a las formas bioactivas implica una serie de oxidaciones que se llevan a cabo por dos tipos de oxigenasas localizadas en el retículo endoplasmático: las citocromo P450 monooxigenasas y las dioxigenasas dependientes de 2‐oxoglutarato (ODDs). En primer lugar, seis oxidaciones consecutivas dan lugar a GA12. Estos pasos oxidativos están controlados por dos monooxigenasas la primera de las cuales se localiza también en las membranas plastídicas y constituye el punto de unión con el RE. GA12 es un punto de ramificación en la ruta según sufra una hidroxilación en C20 o dos en C13 y C20. La naturaleza de la actividad GA13ox, que genera GA53, no se ha identificado aun. Sin embargo, las oxidaciones en C20 son ampliamente conocidas. Esta serie de oxidaciones están controladas por una actividad ODD, GA20ox, la cual cataliza la conversión en paralelo de GA12 y GA53 en GA9 y GA20 respectivamente en tres pasos oxidativos. Por último, otra actividad ODD, la GA3ox, cataliza una 3β‐hidroxilación de las hormonas biológicamente activas GA9 y GA20 dando lugar a GA4 y GA1 con actividad biológica también. La regulación de la concentración de estas hormonas es esencial para el buen funcionamiento de las plantas. Igual que con otras hormonas, existen mecanismos de desactivación de GAs que regulan su homeostasis y permiten una rápida reducción en los niveles cuando se requiere. El más importante consiste en la 2β‐hidroxilación de las moléculas
bioactivas así como de sus precursores, reacciones controladas por otra actividad ODD, las GA2ox. Las ODDs suelen estar codificadas por familias génicas. En Arabidopsis se han identificado cinco genes GA20ox, cuatro GA3ox y siete GA2ox que constituyen los mejores sitios de regulación de la ruta y se consideran marcadores del contenido hormonal (Curaba et al., 2004; Eriksson et al., 2006).
4.2. Los derivados del fitol: clorofilas, tocoferoles y filoquinona.
La reducción completa del GGPP da lugar a la cadena de fitol, un hidrocarburo saturado de 20 átomos de carbono que forma parte de muchos prenil lípidos incluyendo las clorofilas, los tocoferoles y las filoquinonas. La enzima responsable de esta actividad es la geranilgeranil reductasa (GGR) la cual se ha demostrado que es capaz de catalizar la reducción del GGPP a fitil‐PP tanto libre como unido a la molécula de clorofila in vitro (Figura 3) (Keller et al., 1998). El silenciamiento de esta actividad en plantas de tabaco y arroz provoca una disminución de los niveles de clorofilas (Chl‐phy), tocoferoles y filoquinona a costa de una acumulación demoléculas de clorofila conjugadas con una cadena insaturada de GGPP (Chl‐GG) (Tanaka et al.,
1999; Zhou et al., 2013). Estos resultados sugieren que la enzima GGR tiene actividad multifuncional y comparmentalizada dentro del cloroplasto según dónde ocurra la biosíntesis de cada uno de los isoprenoides prenilados con fitol.
4.2.1. Clorofilas.
Las clorofilas son pigmentos fotosintéticos. Se encuentran en los centros de reacción y los complejos antena donde captan la energía lumínica y la transfieren al centro de reacción (Malkin y Niyogi, 2000). Consisten en un macrociclo tetrapirrólico formado por un anillo de porfirina, un catión Mg+2 y la cadena de fitol. El anillo de porfirina se forma a partir de la unión de cuatro anillos pirrólicos derivados cada uno del aminoácido ácido glutámico, y constituye la parte de la molécula responsable de la absorción de la energía lumínica. Las clorofilas a y b se diferencian en la situación del anillo pirrólico II con un grupo metilo o un grupo formilo respectivamente (Figura 3) (Tanaka et al., 2011). La cadena hidrófoba de fitol permite la integración de estas moléculas en las membranas tilacoidales donde ejercen su función. El último paso en la biosíntesis de este compuesto consiste en la prenilación del anillo con la molécula de fitil difosfato, paso catalizado por la enzima clorofila sintasa (CHLG). Esta enzima es capaz de usar como sustratos GGPP o fitil‐PP pero prefiere la cadena de fitil‐PP (Oster et al., 1997; Soll y Schultz, 1981).
4.2.2. Tocoferoles (vitamina E).
Los tocoferoles, en especial el α‐tocoferol, son potentes antioxidantes (Munné‐Bosch, 2005). Constituyen junto con el ascorbato y el glutatión, un sistema de defensa no enzimático contra el estrés oxidativo en las plantas (Szarka et al., 2012). Estas moléculas protegen de la fotoinhibición y del estrés foto‐oxidativo ya que son capaces de reparar/eliminar los radicales oxidados o ROS asociados a la fotosíntesis en las membranas cloroplastídicas, generados después de diferentes estreses abióticos (sequía, salinidad, temperaturas extremas, alta intensidad de luz, toxicidad química) y limitar el grado de peroxidación de lípidos de los ácidos grasos poliinsaturados. Además de su función antioxidante, estas moléculas forman parte de
una red compleja de señalización modulada por ROS, antioxidantes y las hormonas ABA, ácido salicílico y jasmónico (Munné‐Bosch, 2005; Munné‐Bosch et al., 2007; Falk y Munné‐Bosch, 2010).
Los tocoferoles están formados por un anillo polar de cromanol unido a una cadena isoprenoide hidrofóbica, la cadena de fitol. Según el grado de metilación del anillo, se distinguen varios tipos de tocoferoles entre los que destacan el α‐tocoferol y γ‐tocoferol. La estructura y biosíntesis de estos compuestos en las plantas está ampliamente revisada en (Hussain et al., 2013). Estos compuestos son sintetizados en la membrana interna del cloroplasto mediante una ruta conservada en plantas y algunos organismos fotosintéticos incluyendo las algas y la mayoría de cianobacterias. En las plantas, los tocoferoles se acumulan en plastos incluyendo los cloroplastos de tejido fotosintético, amiloplastos de semillas o cromoplastos de los frutos. El contenido y composición de tocoferoles varía ampliamente en función de la especie vegetal y el órgano donde se acumulen pero por lo general el α‐tocoferol es predominante en hojas verdes mientras que las semillas son ricas en γ‐tocoferol. La biosíntesis de estos compuestos requiere dos sustratos, el homogentisato (HGA) y la cadena de fitol. El HGA se sintetiza en la ruta citosólica del shikimato y es la base del anillo de cromanol. Esta molécula se prenila con la cadena de fitol mediante un paso controlado por la enzima homogentisato fitiltransferasa (HPT) para producir 2‐metil‐6‐fitil‐1,4‐benzoquinol, el precursor de todos los tocoferoles. A continuación la molécula sufre una ciclación y varias metilaciones en el anillo aromático. En función del número y posición de los radicales metilo, se generan los distintos tocoferoles entre los cuales el α‐tocoferol y γ‐tocoferol presentan la posición 3 del anillo de benzoquinol metilada (Figura 3).
4.2.3. Filoquinonas (vitamina K1).
La filoquinona (2‐metil‐3‐fitil‐1,4‐naftoquinona) es una prenilquinona compuesta por un anillo de naftoquinona y una cadena isoprenoide derivada del fitil difosfato que sintetizan todos los organismos capaces de realizar la fotosíntesis oxigénica. La biosíntesis de este compuesto ocurre principalmente en la membrana interna del cloroplasto (Schultz et al., 1981) aunque pruebas recientes en Arabidopsis demuestran que ciertos pasos de la ruta ocurren en los peroxisomas (Reumann, 2013). La unidad de naftoquinona deriva del chorismato, que se produce en la vía del shikimato y forma parte también de la estructura de la ubiquinona. La prenilación del 1,4‐dihidroxy‐2‐naftoato (DHNA) y una posterior reacción de metilación sobre el anillo dan lugar a la filoquinona (Figura 3). En las plantas, este compuesto se encuentra principalmente en los cloroplastos de tejido fotosintético donde actúa como transportador de electrones en el recambio de quinona/semiquinona en el fotosistema uno (PSI) (Malkin y Niyogi, 2000).
4.3. Plastoquinonas.
La plastoquinona‐9 (2,3‐dimethyl‐6‐solanesyl‐1,4‐benzoquinone) pertenece también a la familia de las prenilquinonas. Su estructura consiste en un anillo de cromanol (al igual que los tocoferoles) que se prenila con una cadena isoprenoide. La longitud de esta cadena suele ser normalmente de 45 átomos de carbono (derivado del SPP) aunque en algunas plantas se hanidentificado otros homólogos con una cadena más corta si bien en menores cantidades. La biosíntesis de la plastoquinona implica la condensación del HGA con el SPP en un paso controlado por la homogentisato solanesiltransferasa (HST) y una reacción posterior de metilación sobre el anillo aromático, reacciones que tienen lugar en la membrana interna del cloroplasto (Figura 3) (Soll et al., 1985).
La PQ‐9 existe en un equilibrio entre las formas oxidada y reducida. El plastoquinol (PQH2‐9) es un potente transportador de electrones y protones en la cadena de transporte
fotosintético entre el fotosistema II (PSII) y el complejo de citocromo b6f (Müh et al., 2012). Sin
embargo, esta molécula también posee propiedades antioxidantes. Estructuralmente similar al tocoferol, es un potente inhibidor de la peroxidación de lípidos de membrana, es capaz de atrapar los iones superóxido y del oxígeno singlete que se generan entre otros motivos después de un estrés lumínico en los órganos fotosintéticos (Kruk y Trebst, 2008). Además, el estado redox del “pool” de PQ‐9 se ha demostrado que es capaz de regular la expresión de genes nucleares y plastídicos involucrados en la fotosíntesis (Pfannschmidt et al., 2009).
Una última reacción de ciclación sobre la forma reducida de la plastoquinona da lugar al plastocromanol‐8 (PC‐8), un homólogo del γ‐tocoferol con una cadena isoprenoide más larga formada por 8 unidades de IPP (Figura 3). Este compuesto se encuentra en grandes cantidades en aceites de semillas de algunas plantas y en bastante menor proporción en hojas. Debido a su estructura, sus propiedades antioxidantes son considerables. Se acumula en las hojas de Arabidopsis sometidas a un estrés lumínico y durante el envejecimiento (Kruk y Trebst, 2008) y participa en la inhibición de la peroxidación de lípidos en las semillas durante los procesos de desecación y quiescencia (Mène‐Saffrané et al., 2010).
Las plastoquinonas se encuentran en la membrana interna del cloroplasto asociadas al PSII y de forma libre en las membranas tilacoidales formando un pool fotoactivo. Además, están presentes en los plastoglóbulos quizás en forma de almacenamiento hasta su uso en los tejidos fotosintéticos (Piller et al., 2012).