3. Las prenil transferasas 3.1 Introducción
3.2. Estructura tridimensional y mecanismos de regulación de la longitud de la cadena carbonada
Todas las trans‐prenil transferasas presentan una estructura primaria con siete dominios conservados que corresponden a un 30% de la secuencia (Vandermoten et al., 2009). Entre ellos, destacan los motivos FARM y SARM (según las siglas en inglés de primer y segundo motivo rico en ácido aspártico). Estos motivos están formados principalmente por la sucesión de varios residuos de ácido aspártico según la secuencia DD(X)nD (D indica aspártico, X indica
cualquier residuo y n=2 o 4).
Las trans‐prenil transferasas son típicamente activas como homodímeros pero también pueden estar formando heterodímeros. La función y la estructura de las homodiméricas se conocen ampliamente. La primera enzima de este tipo que se cristalizó fue la FPPS de Gallus gallus (Tarshis et al., 1996). Esta enzima presenta una conformación compuesta por trece α‐ hélices unidas mediante “loops”. Diez de ellas forman un conjunto helicoidal que deja una gran cavidad central donde se localiza el sitio catalítico y se encuentran los motivos FARM y SARM situados uno enfrente del otro en paredes opuestas de la cavidad. A partir de la elucidación de la estructura cristalina de otras prenil transferasas se ha comprobado que esta conformación se conserva en toda la familia. Además se han detectado estos motivos estructurales de α‐ hélices en otras enzimas de la síntesis de isoprenoides como la escualeno‐hopaleno sintasa, la pentaleneno sintasa y una proteína farnesil transferasa lo que ha permitido nombrar esta conformación como la “conformación terpenoide sintasa” y sugiere una posible relación evolutiva entre todas las enzimas que la comparten (Wendt et al., 1997; Lesburg et al., 1997; Dunten et al., 1998).
A pesar de catalizar reacciones con el mismo mecanismo y presentar motivos estructurales y dominios catalíticos altamente conservados, por lo general cada enzima sintetiza una cadena carbonada de una longitud concreta. Estudios de mutagénesis dirigida y al azar en combinación con cristalografía de rayos‐X han permitido identificar algunos residuos claves en la determinación de la longitud del producto de reacción. Por ejemplo, los residuos Phe112 y Phe113 en N‐terminal con respecto al FARM situados en la base de la cavidad
catalítica son esenciales (Tarshis et al., 1996). En concordancia con este descubrimiento, se han identificado más residuos con la misma función de sellar la base de la cavidad catalítica en otras prenil transferasas que catalizan la formación de cadenas de diferente longitud. En base a la distancia tridimensional entre el FARM y los mismos se justifica la longitud de la cadena del producto principal que sintetizan (Chang et al., 2006). Por otro lado, los trabajos del laboratorio del profesor Nishino a finales de la década de los 90 ampliamente revisados en (Wang y Ohnuma, 1999) han demostrado que la región que contiene desde el quinto aminoácido en N‐terminal al FARM hasta el final de este motivo es clave en la determinación de la longitud de la cadena carbonada del producto siendo los aminoácidos 5º y 4º anteriores al FARM los más relevantes. Esta región se denomina la región CLD (de las siglas en inglés “chain‐lengh determination”). Así por ejemplo en Arabidopsis, los aminoácidos cuarto y quinto anteriores al FARM de la FPPS están conservados y son tirosina y fenilalanina (aminoácidos aromáticos y voluminosos) mientras que en la GGPPS son dos serinas (GGPPS6‐10), una serina y una metionina (GGPPS2‐4, 11) o una serina y una alanina (GGPPS1), en todos los casos aminoácidos mucho más pequeños. En base al tamaño de la región CLD se puede justificar por qué la FPPS cataliza la síntesis de cadenas de 15 átomos de carbono mientras que en la reacción gobernada por la GGPPS se generan principalmente cadenas de 20 átomos de carbono. Por su parte, la enzima solanesil difosfato sintasa (SPPS) que cataliza la formación de cadenas de 45 átomos de carbono tampoco presenta aminoácidos aromáticos en las posiciones cuarta y quinta lo que apoya esta regla. En acuerdo con esta regla (Sitthithaworn et al., 2001) consiguieron revertir la actividad de la enzima GGPPS de Scoparia dulcis en FPPS sustituyendo los aminoácidos 5º y 4º anteriores al FARM (serina y metionina respectivamente) por los de la FPPS (cisteína y prolina). Sin embargo, no sólo estos residuos son los únicos relevantes y esta regla no es la única que describe la especificidad de las trans‐prenil transferasas. Otros estudios han resaltado la importancia de otros aminoácidos localizados N‐ terminal al FARM o en otras hélices (Lee et al., 2005). Además se han descrito más factores más allá del volumen de los aminoácidos como la formación de enlaces de hidrógeno o puentes salinos entre residuos u otros aspectos estéricos que podrían estar influyendo en la forma de la cavidad catalítica (Lee et al., 2005).
De todos modos, la determinación de la cadena de los productos de las prenil transferasas no es algo absoluto puesto que muchas de ellas exhiben lo que se conoce como promiscuidad catalítica, sintetizan más de un producto a la vez en cantidades menores o a veces iguales a la del producto principal de reacción. Por ejemplo, la enzima GGPPS11 de Arabidopsis además de GGPP (94.5%) es capaz de producir pequeñas cantidades de FPP (2.1%) y GPP (3.4%) en ensayos in vitro (Wang y Dixon, 2009), situación similar a la que ocurre con una isoforma FPPS de maíz cuya actividad produce fundamentalmente FPP pero también pequeñas cantidades de GPP y GGPP (Cervantes‐Cervantes et al., 2006).
A diferencia de las enzimas homodiméricas, el estudio y la información acerca de las prenil transferasas heterodiméricas no es tan amplio habiéndose identificado sólo algunos ejemplos en algunos organismos procariotas y eucariotas. En las plantas la única que se conoce está relacionada con la formación de GPP y se ha identificado en especies ricas en monoterpenos como Mentha piperita, Antirrhinum majus y Humulus lupulus (Burke et al., 1999; Burke y Croteau, 2002; Tholl et al., 2004; Wang y Dixon, 2009). Esta GPPS heterodimérica está constituida por dos tipos de subunidades diferentes: una subunidad
grande (LSU) que es homóloga (75% de identidad) a las GGPPS homodiméricas y una subunidad pequeña (SSU) que presenta sólo un 15% de identidad y carece de los motivos FARM y SARM. La SSU es inactiva por si sola pero en interacción con la LSU se consigue una conformación catalíticamente activa que además favorece la síntesis de GPP en contra de GGPP, el producto de la actividad de la LSU sola (Wang y Dixon, 2009). A partir de la resolución de la estructura cristalina de la GPPS de Mentha piperita (Chang et al., 2010) se ha demostrado que a diferencia con las homodiméricas donde la cavidad catalítica es única, la cavidad catalítica de la LSU presenta una arquitectura de dos espacios. El tamaño del primero sólo permite albergar moléculas de C10 (GPP). Sin embargo, la segunda cavidad adyacente permite albergar prenil fosfatos de cadena más larga como C15 (FPP) y C20 (GGPP). Mediante un mecanismo mediado por interacciones entre las dos subunidades, la SSU es capaz de restringir la actividad hacia la formación específica de GPP evitando la conexión entre ambas cavidades (Chang et al., 2010). En concreto, se ha determinado la existencia de un “loop” regulatorio en la SSU que controla la liberación de los productos de la LSU (Hsieh et al., 2010).
3.3. Geranil difosfato sintasa (GPPS).
La GPPS cataliza la síntesis de GPP, el precursor de la mayoría de monoterpenos (Figura 1). En plantas se han identificado GPPS homodiméricas y heterodiméricas. En Arabidopsis, los primeros estudios que apuntaron hacia la existencia de una GPPS homodimérica datan del año 2000 (Bouvier et al., 2000). En este primer trabajo, se clonó una proteína que era capaz de producir específicamente GPP in vitro y se encontró en los plastos de estructuras secretorias especializadas donde se acumulan monoterpenos volátiles pero también en cloroplastos de parénquima fotosintético permitiendo quizás la síntesis de monoterpenos de novo en respuesta a estreses bióticos o abióticos. Además, los autores encontraron dos metioninas en su secuencia de aminoácidos, Met1 y Met102, las cuales demostraron que permitían la traducción in vitro de dos isoformas, una GPPS completa plastídica y otra isoforma truncada que podría dirigirse al citosol.En un trabajo posterior, se demostró que la falta total de actividad GPPS era letal. Las silicuas de plantas mutantes en heterocigosis presentaban un porcentaje elevado de embriones abortados lo que permitió concluir que esta actividad era esencial durante el desarrollo del embrión. Sin embargo, un silenciamiento parcial de la expresión del gen dio lugar a plantas enanas con una reducción de los niveles endógenos de giberelinas de más del 50% quedando abierta la pregunta de cuál era la verdadera función de esta proteína dentro de la biosíntesis de isoprenoides (van Schie et al., 2007).
Aunque Bouvier y colaboradores demostraron que en Arabidopsis la enzima hasta el momento denominada GPPS producía GPP in vitro (Bouvier et al., 2000), estos resultados se cuestionaron en un trabajo más reciente donde se demuestra que esta enzima es capaz de catalizar la formación de cadenas isoprenoide mucho más largas (C25‐C40) en ensayos in vitro cuando la concentración de IPP supera la de los posibles sustratos alílicos DMAPP, GPP y FPP. En este trabajo se resuelve la estructura 3D de la proteína y se demuestra que la cavidad catalítica es suficientemente grande como para albergar productos de cadena media/larga. En consecuencia, se la renombra como una poliprenil difosfato sintasa (PPPS) (Hsieh et al., 2011).
Finalmente en un trabajo publicado en 2012 se ha demostrado que la función de esta proteína está relacionada con la biosíntesis de ubiquinona en la mitocondria (Ducluzeau et al., 2012). Los autores han mostrado que esta enzima se localiza en el cloroplasto y en la mitocondria en células de Arabidopsis y es capaz de complementar el mutante de S. cervisae
coq1 que carece de la actividad mitocondrial hexaprenildifosfato sintasa necesaria para la
formación de la cadena isoprenoide de 30C de la ubiquinona (UB‐6) en este microorganismo. Se confirma con este trabajo que la función in vivo de esta PPPS es catalizar la formación de solanesil difosfato (C45) que constituye la cadena isoprenoide de la ubiquinona (UB‐9) en Arabidopsis puesto que las líneas de silenciamiento generadas en (van Schie et al., 2007) presentan sólo un 20% de los niveles silvestres de este isoprenoide. La función cloroplastídica queda sin embargo por determinar. Para unificar con la nomenclatura usada en la tesis, a partir de aquí nos referiremos a esta isoforma como SPPS3.
En el árbol filogenético de la Figura 2 se han comparado las secuencias homólogas a estas enzimas en varias plantas y se ha visto que las que pertenecen a angiospermas y las que pertenecen a gimnospermas (en azul claro y rosa respectivamente) se separan en dos grupos diferentes. En el grupo de angiospermas se demostró inicialmente una actividad GPPS para las enzimas de Arabidopsis y tomate (Bouvier et al., 2000; van Schie et al., 2007). Sin embargo, y como se ha descrito, en estos ensayos in vitro la relación IPP/DMAPP empleada fue baja y al aumentar las cantidades de IPP, ambas enzimas son capaces de producir cadenas de isoprenoide más largas, incluyendo de C45 (Hsieh et al., 2011; Jones et al., 2013). De forma análoga, se ha confirmado una actividad similar para la enzima de maíz DPS3 que se encuentra en la misma clase filogenética que las anteriores (Ohara et al., 2010). De forma contraria a lo esperado para una GPPS, las enzimas inicialmente descritas como GPPS de Arabidopsis, tomate y arroz se localizan en la mitocondria y están relacionadas con la síntesis de ubiquinona (Ducluzeau et al., 2012; Ohara et al., 2010; Jones et al., 2013). En este grupo filogenético de angiospermas aparece sin embargo la enzima IDS3 de la conífera Picea abies, la única prenil transferasa de esta especie cuya expresión no coincide con la formación de monoterpenos, característica fundamental de este árbol (Schmidt y Gershenzon, 2008). Se ha comprobado que esta enzima, al igual que la GPPS de Quercus robur son capaces de producir cantidades similares de GPP, FPP y trazas de GGPP en ensayos in vitro (Schmidt y Gershenzon, 2008). Estos datos nos hacen plantearnos si todas las proteínas clasificadas en esta clase, más cercana filogenéticamente a las prenil transferasas de cadena larga, presentan actividad poliprenilfosfato sintasa quedando su función biológica por tanto por determinar. Por el contrario, la actividad GPPS del grupo de gimnospermas (en rosa) está confirmada. Además, en numerosas ocasiones, la expresión de los genes que codifican estas enzimas es paralela a la emisión de monoterpenos y otros isoprenoides volátiles (Schmidt y Gershenzon, 2008; Schmidt et al., 2010).
Aunque la existencia de una GPPS homodimérica en Arabidopsis es cuestionable, la actividad GPPS heterodimérica es quizás la principal responsable de la síntesis de GPP en este organismo. Se ha demostrado que la enzima catalogada inicialmente como una isoforma de la familia de GGPPS (GGPPS12) no presenta esta actividad in vitro (Okada et al., 2000) pero sin embargo presenta cierta homología de secuencias con las GPPS‐SSU descritas y posee dos motivos CxxxC (donde x puede ser cualquier aminoácido hidrofóbico) conservados en todas las GPPS‐SSU conocidas responsables de la unión de las dos subunidades. Esta preniltransferasa
en conjunto con la actividad GGPPS11 es capaz de modificar esta última favoreciendo la síntesis de GPP in vitro (Wang y Dixon, 2009). Según se observa en el análisis filogenético de la Figura 2, se diferencian dos clases de SSU. La de Arabidopsis junto con la de arroz, tomate y uva, entre otras, pertenecen a la subfamilia II (en azul). El papel de estas proteínas en la biosíntesis de monoterpenos no queda sin embargo del todo claro ya que su expresión no está finamente correlacionada con la formación de monoterpenos como es el caso de las enzimas de la subfamilia I (en azul), características de especies ricas en estos compuestos como Mentha piperita, Antirrhinum majus y Humulus lupulus (Burke et al., 1999; Burke y Croteau, 2002; Tholl et al., 2004; Wang y Dixon, 2009).
Figura 2. Árbol filogenético de prenil transferasas de cadena corta GPPS, FPPS y GGPPS y de cadena
larga, SPPS. En azul la subunidad pequeña (SSU) de las GPPS heterodiméricas de angiospermas. En rosa las GPPS/GGPPS típicas de gimnospermas. En verde las GGPPS y la subunidad grande (LSU) de las GPPS heterodiméricas de angiospermas. En rojo las SPPS típicas de plantas y en azul claro las proteínas inicialmente catalogadas como GPPS de angiospermas y otras cuya actividad SPPS se ha demostrado experimentalmente. En este grupo se encuentran proteínas estrictamente de la clase eucariota (como las de los animales).