Constructos con Colágeno tipo I.

Extracción y purificación de Colágeno tipo I.

En la síntesis de los constructos con Colágeno tipo I, se hizo la extracción ácida y purificación del Colágeno tipo I, se realizó de acuerdo con el procedimiento del grupo del doctor Mantovani (165), con la ayuda de pinzas quirúrgicas se extrajeron los tendones de la cola de 10 ratas (Figura 4.2 A y B), se limpiaron sumergiéndolos primero en acetona pura y luego en isopropanol al 70% vol/vol (Figura 4.2C), se hidrataron durante 48h a 4 C con una solución de ácido acético (AA) 0.02N en una proporción de 1:5 con respecto al volumen total de ácido acético. La solución formada se homogenizó por medio de una licuadora doméstica, con la adición de hojuelas de hielo para evitar el sobrecalentamiento de la solución y por tanto la denaturación del colágeno. La solución resultante se concentró por liofilización durante 48h en recipientes grandes para la obtención de bloques, a partir de estos bloques se prepararon soluciones licuando en modo pulsátil 4g del liofilizado en 1L de AA 0.02N, previamente refrigerado (Figura 4.2D). La solución viscosa obtenida en la licuadora se ultracentrifugó a 4°C y 30.000xg durante 45 min, en la fracción sobrenadante se encuentra la mayor concentración de colágeno tipo I, por lo cual los sobrenadantes de la ultracentrifugación se recogieron en vasos de precipitados previamente refrigerados, se degasificaron con bomba de vacío durante 15 min y la solución degasificada se dializó, sirviéndola en bolsas de diálisis selladas y puestas en un erlenmeyer en agitación magnética, se aseguró que el volumen del solvente para la diálisis siempre fuera 4 veces el volumen de la solución a dializar. La primera diálisis se hizo con AA 0.02N durante 1h y a 4°C, la segunda con una solución de cloroformo al 1% durante 1h y a 4°C, finalmente durante una semana con AA 0.02N, con cambio de solvente cada dos días, para obtener así una solución ácida y estéril de colágeno tipo I, que se conservó en frascos de vidrio previamente esterilizados. La descripción detallada de este procedimiento se encuentra en el anexo 5.

104 Figura 4.2. Extracción de colágeno tipo I de cola de rata. A) Rompiendo la punta de la cola con movimientos giratorios. B) Se tracciona la punta desprendida para retirar los tendones. Este procedimiento se repite hasta que el fragmento restante sea demasiado corto. Los tendones se conservan en H2O ultrapura. C) Limpieza de los tendones en

acetona pura y luego en isopropanol 70% vol/vol. D) Solubilizacion de el colágeno en Acido Acetico 0.02N. Posteriormente el colágeno se purifica por medio de ultracentrifugación y liofilización.

Síntesis de los constructos con colágeno tipo I.

Debido a que el método de extracción usado, el colágeno obtenido es ácido, de esta forma se mantiene conservado a 4°C. Antes de usarse se neutraliza con la adición de NaOH 0.1N, el gel neutralizado se dividió en alícuotas de 80 l en microtubos de PCR y se liofilizó durante 24 horas, formándose una esponja con un volumen equivalente a los 80 l de colágeno sin liofilizar. Cada esponja obtenida se expuso a la radiación UV durante 6h (3h por una cara del tubo y 3h por la otra cara) en cabina de flujo laminar para aumentar el número de entrecruzamientos y fijar el tamaño de poro, de esta forma se almacenaron a temperatura ambiente en los mismos microtubos que fueron liofilizadas, hasta su uso.

Para la inclusión de las células en la esponja de colágeno se diseñó un sistema de siembra de células que consiste en unos discos de acrílico con pozos sobre los cuales se coloca la esponja de

105 colágeno liofilizado e irradiada y sobre ella las células troncales de médula ósea, detalladamente: se fabricaron discos de acrílico de 1.2 cm de diámetro a los cuales se les perforó un pozo de 3 mm de diámetro externo y 2 mm de profundidad en el centro del disco (Figura 4.3 A y B), cada disco se colocó en un pozo de una caja de cultivo multipozos. Se extrajo de cada microtubo de PCR la esponja de colágeno (Figura 4.3 C y D), y se colocó en el pozo del disco (Figura 4.3E), haciéndole presión suave para comprimirla (Figura 4.3F).

A la esponja inmersa en el pozo se le adiciona la suspensión de CTMO en una concentración de 400.000 cél por cada 7 l de medio de cultivo (Figura 4.4 A, B y C). Se dejó en reposo durante 1 h a 37°C y 5% de CO2 para permitir la difusión celular a través de la esponja de colágeno

(Figura 4.4D y E). Transcurrido el tiempo de difusión se trasladó la esponja de colágeno sembrada con CTMO al sistema de cultivo celular (Figura 4.4F). Para el cultivo celular de la esponja de colágeno sembrada con las CTMO, se usó la técnica de Trowell modificada por Saxen (180) que consiste en poner el constructo sobre mallas metálicas perforadas que a su vez están inmersas en medio de cultivo y que permiten la difusión de este medio por capilaridad hacia el constructo, en una interfase líquido-gas; para proteger los constructos se depositaron en reservorios hechos con hidrogel PEGDA (Figura 5.5A, B y C), para la fabricación de estos reservorios se usaron nuevamente los moldes de PP pero en esta parte de los experimentos se cambió la forma piramidal por una redonda (para lo que se diseñó un nuevo troquel redondo).

Los reservorios de hidrogel fueron elaborados colocando uno de los moldes con forma redonda dentro de un microtubo de PCR, este molde llega hasta 1/3 de la altura del microtubo, se adicionaron 20 l de hidrogel al 10% sobre el molde y se indujo la polimerización con un período corto de 3´30´´ (tres minutos y treinta segundos) para que el gel sólo alcance cierto grado de polimerización, se rompió el microtubo que contiene el molde por la parte inferior con la ayuda de un bisturí y se sacó el molde del microtubo empujándolo con la ayuda de un palillo, se introdujo el émbolo troquel cuyo extremo inferior tienen la misma forma del molde y se colocó todo el sistema molde con hidrogel polimerizado y émbolo troquel en un nuevo microtubo y se volvió a polimerizar durante 5 minutos más (2.5 minutos por una cara del microtubo y 2.5 minutos por la otra cara del microtubo); se sacó el émbolo troquel y el molde del microtubo, por la ruptura del molde con un bisturí se liberó el reservorio de hidrogel. Se fabricaron varios reservorios para tener disponibles siempre que fuera necesario, conservándolos en PBS suplementado con antibióticos y antimicóticos y en refrigeración hasta su uso. Se realizó

106 el cultivo celular de la esponja de colágeno sembrada con CTMO durante tres periodos distintos una, dos y tres semanas, al cabo de las cuales se sembraron sobre ella los fragmentos de ectodermo embrionario disecados de acuerdo con el procedimiento descrito en el capítulo anterior. Se cultivó el grupo celular (esponja con CTMO + fragmentos de ectodermo) durante 3 días más, con cambio de medio día de por medio, hasta su implantación.

Figura 4.3. Preparación de la esponja para cargarla con las CTMO. A, B) Disco de acrílico con un pozo de 3mm de diámetro por 2mm de profundidad. El pozo se utiliza para alojar la esponja seca antes de cargarla con 400.000 CTMO. C) Esponja de colágeno obtenida por liofilización de 80µl de una solución al 0,5% p/v neutralizada. La esponja se irradia con UV para lograr un mayor entrecruzamiento de las cadenas. D) La estructura de la esponja tiene poros de aproximadamente 100µ de diámetro. E, F) Cargado de la esponja en el pozo. Barras de escala a, e y f, 6 mm, b 3mm y d 200µm.

Figura4.4. Carga de la esponja con CTMO. A) Pellet de CTMO. B,C) Carga de la esponja de colágeno con 400.000 CTMO. El pellet se resuspende en 7µl de α-MEM. D, E) Los discos con la esponja cargada se colocan en una caja

multipozos y se cubren con α-MEM y se incuba por una hora a 37°C y 5% de CO2 antes de trasladar las esponjas

cargadas los reservorios cónicos de hidrogel que se han colocado en una malla de acero. La malla tiene unos agujeros que permiten estabilizar los conos. F) Reservorios cónicos de hidrogel sobre la malla de acero.

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