Establecimiento y expansión de la colonia de ratas Lewis

La SEA FOUJ, que se construyó específicamente para la ejecución experimental de este proyecto consta de un área construida de 52 m2_{, dividida en tres zonas (Figura 1, anexo 1):} Zona negra: Área de acceso general, con carga biológica moderada (Figura 2, anexo1). Se subdivide en:

*Área de procesamiento de la información, de lavado y autoclavado de materiales, agua y alimentos.

*Depósito de alimento concentrado. *Depósito de viruta sin esterilizar.

*Primera exclusa, en la cual los investigadores y el personal operativo hacen el cambio de la ropa de calle por ropa completamente estéril y zapatos de uso exclusivo de la Sala.

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Zona gris: Área de acceso restringido; en esta se encuentra la segunda exclusa donde se complementan las barreras de bioseguridad con el uso de gorro, tapabocas, blusa y polainas estériles.

Zona Blanca: De acceso restringido (Figura 3, anexo 1), se subdivide en:

*Habítaculo, en el cual se encuentra el sistema micro-aislador ONE CAGE 2100 (Lab Products, Inc) con capacidad para 380 individuos entre ratas y ratones, en edad adulta.

El sistema micro-aislador ONE CAGE 2100 (Lab Products, Inc) con capacidad para 380 individuos entre ratas y ratones en edad adulta, permite establecer una barrera entre los animales y el ambiente; cuenta con sistemas de inyección y extracción de aire filtrado HEPA. Un sistema entrega y el otro retira el aire simultáneamente, manteniendo constantes el aporte de aire a las cajas que se conectan independientemente a los ductos de ingreso y salida de aire. La individualización del microambiente de cada cubículo elimina el riesgo de diseminación aérea de agentes infecciosos entre animales. A su vez, la zona blanca en donde se encuentra el microaislador cuenta también con un sistema de inyección y extracción de aire filtrado HEPA que produce 50 recambios de aire total por hora asegurando la buena calidad del aire dentro del habitáculo.

*Área de procedimientos invasivos, en el que se pueden manipular los animales (marcación de individuos, determinación de ciclo estral, control de cruces, muestreos, etc.) sin tensionar la colonia.

*Área de almacenamiento de jaulas limpias y desinfectadas, y de almacenamiento de comida y viruta debidamente esterilizadas.

*En esta zona, se hace el control de los factores medioambientales: luminosidad (12h luz/12h oscuridad), temperatura y humedad relativa. Los sistemas de aire acondicionado allí instalados tienen las siguientes especificaciones: Aire filtrado HEPA (99.9%) dentro de la zona blanca, con 40 recambios de aire total/hora y una presión positiva de 1.2 atmósferas. En el microaislador, aire filtrado HEPA, 45 recambios de aire total/hora en cada jaula.

La comunicación entre el área de lavado y esterilización de materiales a la zona blanca se hace a través de una miniexclusa (Figura 4, anexo 1), en la cual el efecto de una luz ultravioleta durante 15 minutos hace una esterilización superficial a los materiales o insumos, que ingresan a la zona blanca provistos de doble envoltura

58 El manejo de los procedimientos operativos estandarizados de la colonia de ratas en la SEA FOUJ (Anexo 2), permitió:

1. Conservar de la característica endogámica, por el estricto rigor en los cruces de acuerdo con los protocolos de apareamiento de cepas isogénicas. Los cruces para la colonia de fundación se realizaron cruzando en pareja a cuatro de los individuos importados, para formar las parejas reproductoras 1 y 2 quienes a su vez son la generación F1. De la progenie de F1 se organizaron tres parejas, quienes se convirtieron en la generación F2. De las parejas F2 se obtuvieron otras tres parejas, el mismo proceso se repitió durante la ejecución de la experimentación hasta llegar a F9.

2. Identificar los individuos disponibles para los cruces y los experimentos, a través de la revisión de la historia de cada individuo.

3. Realizar periódicamente parcial de orina y análisis de parásitos en heces y piel, a 3-6 individuos de la colonia, escogidos aleatoriamente, que permiten concluir que la colonia está libre de endoparásitos y ectoparásitos.

4. De acuerdo con los resultados de la evaluación microbiológica de superficies, techos, paredes y pisos dentro de la zona blanca de la SAE FOUJ se logró controlar la contaminación por bacterias y hongos; en los muestreos mensuales el conteo es < 2 UFC (menor que dos unidades formadoras de colonia).

5. En las evaluaciones de serología global, microbiología e histopatologías de órganos, los resultados negativos para la presencia de los microorganismos de la lista internacional de patógenos específicos, tales como Bordetella spp., Pasteurella spp., Streptobacillus moniliformis, Streptococcus (Streptoccoco ß haemolytic Grupo A), Helicobacter spp., Salmonella spp., Leisteria monocytogenes, Corynebacterium kutscheri, Pneumococci spp., Clostridium spp., Dermatophytes, Sarcoptes scabiei, Cestodes (parásitos intestinales), Spironucleus muris (parásitos intestinales), Giardia muris, Siphacia obvelata, Aspiculuris tetraptera, todos los artrópodos, todos helmintos y todos los protozoarios intestinales permitieron concluir que la calidad sanitaria de los individuos hospedados en la SEA FOUJ los clasifican dentro de la categoría de animales libres de patógenos específicos.

59 6. Los individuos de la población de ratas que participaron en esta investigación recibieron alimento concentrado para roedores Rodentina, elaborado por AGRINAL con registro ICA No. 6850AL, cuyo contenido es maíz, gluten de maíz, torta de soya, harina de arroz, harina de pescado y/o harina de carne, harina de trigo, grasa animal, alfalfa, melaza, carbonato de calcio, fosfato bicálcico defluorinado, cloruro de sodio, vitaminas A, D3, E, K y B12, biotina, pantotenato de calcio, niacina, ácido fólico, tiamina, piridoxina, sulfato de cobre, sulfato de manganeso, sulfato de magnesioEDDI, sulfato ferroso, sulfato de virginiamicina o flavomicina, BHT o etoxiquin y aminoácidos sintéticos (lisina y metionina). Su composición en nutrientes manifestado por el proveedor es:

Ceniza máxima 8,00 Fibra máxima 5,00 Grasa mínima 6,50 Humedad máxima 13,00 Proteína mínima 23,50

Antes de ser administrado a la colonia el alimento se esterilizó y para compensar la pérdida de nutrientes por el proceso de esterilización, una vez por semana el agua de bebida se suplementó con una mezcla de vitaminas y aminoácidos Promocalier L. Dentro de la bolsa usada para la esterilización se colocaron químicos de esterilización para asegurarse de que el proceso es efectivo y permitir la trazabilidad del suministro del alimento.

El agua de bebida fue agua del acueducto que se esterilizó en cantinas y se dispensó en los bebederos individuales. El agua se cambió cada dos días y una vez por semana se suplementó con una mezcla de vitaminas y aminoácidos para compensar la pérdida de nutrientes en el proceso de esterilización del alimento.

7. El análisis del perfil genético realizado a una muestra de la población, mostró que todas las muestras tienen un perfil genético idéntico a las ratas de la cepa LEW/SsNHsd.

8. Para la cama se utilizó viruta de pino pátula cernida y esterilizada cuyo productor certifica que no se le han aplicado inmunizantes. Se cambió una vez por semana y de la misma forma que con el alimento dentro de la bolsa usada para la esterilización se colocaron controles

60 químicos de esterilización, para asegurar la efectividad del proceso y permitir la trazabilidad del suministro.

9. El control del inventario de los individuos, se llevó de acuerdo con su número de identificación en los respectivos libros de registros ubicados dentro de la Sala. Para esto a cada individuo entre las 3-5 semanas de edad se le asignó un número y fue marcado en las orejas, por medio de perforaciones en forma de orificios y muescas, se hizo un orificio en la oreja derecha para indicar los números 1, 2 y 3, una muesca para los números 4, 5 y 6 y doble muesca para 7, 8 y 9. Cuando se hicieron en la oreja izquierda los orificios indican 10, 20 y 30, las muescas 40, 50 y 60 y las dobles muescas 70, 80 y 90.

Además a cada jaula se le puso una tarjeta con la indicación de los individuos presentes en ella, fecha de nacimiento, fecha de cruce sí es el caso, identificación de sus padres y de sus hijos sí los tenía. El inventario de los individuos de la Sala se controló por medio del programa mLIMS®, en el cual se depositó la información recolectada en los libros de registro de la Sala. El programa permitió entre otras funciones hacer fichas de pedigrí, disgregar los individuos por especie y cepa, mantener un registro actualizado de los movimientos de los individuos dentro del microaislador.

10. Los equipos de control de luz, humedad y temperatura permitieron la definición de los parámetros para la SEA FOUJ en ciclos 12h/12h (12 horas de oscuridad y 12 horas de luz), 22-24°C y 55-65% de humedad relativa.

11. Para todos los casos en los que se sacrificaron animales, se diseñó una cámara especial sellada o contenedor para la aplicación de dióxido de carbono como agente para la eutanasia para las ratas. Los individuos que debían ser sacrificados se introdujeron en una cámara por medio de la cual se dispensa el CO2 a una velocidad de 1-2 litros/min, incrementándose a 3

l/min en el momento que el animal pierde la consciencia, con el fin de reducir el tiempo para producir la muerte. La inhalación del gas induce hipoxia mediante la depresión de la corteza cerebral, regiones subcorticales y centros vitales del cerebro, así como del músculo cardíaco, induciendo de esta manera la pérdida de consciencia seguida de la muerte (97).