La importancia que juega la determinación de la edad en el manejo de la vida silvestre fue ya descrita inicialmente por Alexander (1958). Una revisión de la metodología de data- ción puede encontrarse en Madsen (1967), aunque posteriormente Morris (1972) aportó una revisión más extensa para los mamíferos.
Al igual que con el sexo, se observa una estrecha relación entre las diferentes clases de edad y los parámetros demográficos y poblacionales antes mencionados, por lo que es igual- mente necesario establecer unos criterios válidos y fiables para realizar una correcta identifi- cación y datación de edad.
La distribución por edades es un componente básico que nos informa no sólo del estado poblacional, sino que permite, además, conocer el tipo de crecimiento poblacional y estimar las tendencias que experimentaría una población en base a la distribución de la mortalidad y natalidad, según la edad, mediante la elaboración de tablas de vida.
2. 3. 1. PESO CORPORAL Y OTRAS MEDIDAS BIOMÉTRICAS
Conforme un animal crece, su tamaño aumenta, al menos hasta que se alcanza la edad adulta. Este incremento de tamaño se ve reflejado, tanto en el aumento de masa, como en el crecimiento de sus diferentes estructuras corporales, por lo que se puede obtener una idea aproximada de la edad a través de estos indicadores biométricos (Morris, 1972).
Si el crecimiento está directamente relacionado con el incremento en masa, el peso cor- poral puede ser un indicativo de la edad, especialmente para especies con rangos de vida re- lativamente cortos (Lu, 2000). Sin embargo, se trata de un parámetro que puede variar en fun- ción de diversas variables, como pueden ser las condiciones ambientales, la región geográfica, la estación del año, la edad, la dieta, el estado nutricional o la condición física del animal (Bai- ley, 1968, Frylestam, 1980a).
En el caso de la liebre, se ha considerado un criterio poco preciso, pues su uso como in- dicador directo de la edad se limita al corto intervalo de tiempo en el que las liebres crecen de forma continua. En trabajos realizados con liebres europeas, se ha determinado que el peso de los lebratos al nacer ronda los 110-120 gramos. Pielowski (1971) da un valor de unos 107g y Peroux (1995) de 120g, con una tasa de crecimiento muy elevada durante los primeros días, que luego se ralentiza hasta los 7-8 meses, cuando se alcanza el peso prácticamente definiti- vo. Después, el crecimiento en peso se prolongaría hasta los 4 años aproximadamente, pero con una tasa muy inferior y con oscilaciones estacionales acusadas (Pielowski, 1971). Una vez alcanzada la madurez en el desarrollo, la variabilidad individual es importante, lo que lo con- vierte en un criterio poco fiable, pues, liebres con la misma edad pueden tener pesos conside- rablemente distintos (Broekhuizen & Maaskamp, 1979). Las hembras son más pesadas que los machos en todas las especies de liebres. En Lepus europaeus esta diferencia se ha cifrado en torno a un 10% (Peroux, 1995: Hembras: 4kg; Machos: 3,6kg aprox.). Desgraciadamente, los datos de este tipo sobre la liebre ibérica son muy escasos.
Obtener una curva patrón de crecimiento de la liebre en función del tiempo es de gran utilidad, pero de muy difícil consecución, sobre todo con liebres no criadas en cautividad, pues requiere inevitablemente, del marcaje individual de juveniles, y el posterior control sis- temático de los ejemplares a lo largo de un largo período. De hecho, no se dispone de ningu- na curva calculada para la liebre ibérica, L. granatensis, mientras que para la liebre europea, L. europaeus, sí se han descrito algunas aproximaciones realizadas bajo diversas condiciones y en diferentes lugares (Pilarska, 1969; Pielowski, 1971; Peroux, 1995). Las curvas resultan- tes de estos estudios difieren ligeramente, sugiriendo que, las variaciones locales y el compo- nente genético de las poblaciones, producen ciertas variaciones y cambios en las tasas de cre- cimiento (Bray et al., 2002).
El pesado de los ejemplares se realiza mediante dinamómetro de precisión en terre- no (Pesola 0-2500/5000 gramos) y con báscula de precisión en el laboratorio (1 gramo de precisión).
Figura 2.2. Medición de la longitud de la extremidad Figura 2. 3. Medición de la longitud del pabellón delantera (radio-ulna). auricular.
Figura 2. 4. Material de laboratorio empleado Figura 2. 5. Liebre en el laboratorio. en el manejo de las muestras.
2. 3. 2. ESTADO DE OSIFICACIÓN DEL CARTÍLAGO EPIFISAL DE LOS HUESOS LARGOS
El crecimiento longitudinal de los huesos largos se produce en los discos cartilaginosos, presentes entre los extremos terminales (epífisis) y la región central (diáfisis) del hueso (Fi- guras 2.6 y 2.7). Cuando se detiene el crecimiento, los discos se osifican completamente, de- sapareciendo la línea que separa ambas regiones, que quedan de esta forma sólidamente fu- sionadas (Morris, 1972).
En el caso de la liebre, en los individuos más jóvenes, esos discos cartilaginosos forman un pronunciado abultamiento entre la diáfisis y la epífisis, en la parte distal de la extremidad delantera (ulna y radio), a una distancia aproximada de 1 cm. por encima del punto de articu- lación. (Figura 2.6). Este abultamiento es fácilmente detectable a través de la piel, lo cual per- mite hacer una rápida discriminación de las liebres en dos grupos: jóvenes y liebres cuyo de- sarrollo ha terminado (supuestamente adultas), en función de la presencia o no de ese abultamiento. Este método se ha venido en llamar Método de Stroh (Stroh 1931).
La aplicación de este método puede hacerse de forma “visual” o por “palpación”, sin que se requiera para ello de ningún tipo de procesamiento de la muestra y siendo el único método aplicable directamente en terreno.
Figura 2. 7. Extremo proximal de la pata delantera de dos ejemplares de L. granatensis. El de la izq. es un in- dividuo joven, como lo de muestra el cartílago de cre- cimiento. A la derecha un adulto en el que ha desapa- recido completamente el cartílago presente en la epífisis del hueso.
Figura 2. 6. Extremo terminal de la pata delantera de tres ejemplares de L. granatensis. El ejemplar de
la izq. es un adulto. El ejemplar de la derecha es un joven, en el que se pueden apreciar los cartílagos y el abultamiento que producen en el hueso. El ejemplar del centro es un individuo en una fase intermedia.
Diversos autores han estudiado la desaparición de este abultamiento en L. europaeus, ayudándose con técnicas de radiografía con rayos-X, llegando a la consideración general de que ésta se produciría en un periodo en torno a los 7-9 meses. En esos trabajos se han distin- guido hasta 9 estados diferentes de osificación (Bujalska et al., 1965; Broekhuizen & Maas- kamp, 1979). En L. granatensis, se ha descrito que la aplicación de éste método mediante pal- pación, permite diferenciar jóvenes y adultos de hasta 7-9 meses de edad (Saenz de Buruaga et al., 1991), aunque esta afirmación se basa más en lo documentado por otros autores para al liebre europea, que por lo investigado con la propia especie.
La técnica que se emplea para la aplicación de este método resulta muy sencilla de apli- car en laboratorio, y consiste básicamente en la limpieza de los huesos (por cocción o mace- ración) y su posterior examen visual (Figuras 2.6, 2.7).
Palpación: se trata de detectar la presencia del abultamiento cartilaginoso en todos aque- llos ejemplares capturados, mediante la palpación de la región distal externa de la pata delan- tera. De esta forma se clasifican las liebres en dos grupos (con y sin abultamiento cartilagi- noso).
Visual: se procede a practicar una incisión en la piel de forma que se pueda determinar de forma visual si, efectivamente, se mantiene o no la zona de crecimiento cartilaginoso. De esta forma se comprueba el grado de fiabilidad del método de detección y se puede tener una primera consideración de la edad de las liebres estudiadas.
2. 3. 3. PESO SECO DEL CRISTALINO
El peso del cristalino (PC) es uno de los métodos más precisos y más empleados para la determinación de la edad en mamíferos. El principio en el que está basada esta técnica, es que el cristalino es una estructura ectodérmica, que aumenta paulatinamente de peso y tamaño a lo largo de la vida por la continua proliferación y elongación de fibras epiteliales. Su peculiar posición en el cuerpo, hace además, que apenas sufra desgaste y, por tanto, su masa es pro- porcional a su edad (Morris, 1972). Su validez como criterio, se ve reforzada, por el hecho constatado de que las condiciones nutricionales no influyen en el desarrollo del cristalino tras el parto (Friend & Severinghaus, 1967). Este hecho permitiría diferenciar los individuos por clases de edad, en función del peso de esta estructura corporal.
En todo caso, su tasa de crecimiento cae notablemente, cuando se detiene el crecimien- to corporal (Lord, 1959) por lo que, una vez alcanzado el máximo desarrollo, el valor de es- te criterio como indicativo de la edad absoluta, debe ser tomado con precaución, haciéndose necesario conocer el patrón de crecimiento en peso, en función de la edad para la especie en cuestión.
La técnica ha podido ser empleada en diferentes grupos animales, entre los que se en- cuentran algunas especies de liebres, habiéndose utilizado fundamentalmente, como criterio cualitativo para la diferenciación de ejemplares jóvenes (cuyo desarrollo aún no ha finaliza- do) de adultos. En algunos casos se ha llegado a dar incluso, un valor cuantitativo al peso del cristalino, a partir del cual se produce la diferenciación (Tabla 2.1).
Especie Lugar Peso critico cristalino Referencia L. timidus Noruega < 0.250mg > 0.250g Walhovd, 1965
Escocia < 0.235mg >0.235 Flux, 1970
Finlandia < 0.250mg > 0.250g Kauhala & Soveri, 2001 L. europaeus Dinamarca < 0.230mg > 0.230 Andersen & Jensen, 1972
Polonia < 0.275mg > 0.275g Cabon Raczynska. & Razciski, 1972 Alemani < 280mg > 0.280g Broekhuizen & Maaskamp, 1979 Austria < 275mg > 275mg Suchentrunk et al., 1991
L. capensis China < 180mg > 180mg Lu, 2000
Tabla 2. 1. Peso seco del cristalino. Valores críticos discriminatorios entre adultos y jóvenes reportados en la litera- tura para especies del género Lepus.
Así por ejemplo, Broekhuizen & Maaskamp (1979) trabajando con L. europaeus en Ale- mania, consideran liebres adultas (mayores de 8 meses) aquellas que tienen un cristalino con un peso seco mayor a 280 mg, y Cabon-Raczynska & Raczynski (1972) en torno a los 270 mg. Una vez superado este valor crítico, la relación entre el peso del cristalino y la edad no es tan fácil de determinar, puesto que, como comentábamos anteriormente, el desarrollo de los individuos se ralentiza asintóticamente, y está influenciado, además, por diversos factores, lo que provoca una variación individual considerable. Este hecho, hace necesario un patrón control obtenido a par- tir de animales de edad conocida en condiciones naturales, lo cual no es fácil de conseguir. Pa- ra L. europaeus se han descrito algunos patrones como se puede ver en la siguiente figura:
Figura 2. 8. Curva de crecimiento en peso del cristalino para L. europaeus. Las curvas fueron obtenidas a partir de ejemplares de edad conocida.
Hasta el momento no existe este tipo de patrón conocido para L. granatensis. El peso del cristalino, en todo caso, está fuertemente influenciado, por una serie de factores metodológi- cos relacionados con el manejo y la conservación de los mismos (Pelton, 1970), entre los que podemos destacar: (1) el tiempo de fijación, (2) la concentración del producto empleado para ello (Friend, 1967 a, b), (3) el tiempo y la temperatura de secado (Cabon-Raczynska & Raczynski, 1972), (4) el grado de descomposición que presente la muestra (Montgomery, 1963 Rongstad, 1966) y (5) el hecho de haber sido o no congelados (Montgomery, 1963, Pel- ton, 1970).
Dada la variedad de metodologías, descritas en la literatura, para la aplicación de este cri- terio (revisión en Morris, 1972), se deben estandarizar todos los procesos de fijado, secado y pesado de las muestras. Siempre que se pueda se aplicará el método en fresco pero, dado que muchas de las muestras son tomadas en la época de caza, un gran número de ellas tendrán que ser congeladas antes de proceder a su manejo.
El procedimiento empleado es el siguiente:
Figura 2. 9. Estado de conservación de los dos cristalinos de un mismo individuo (Lg 173) que han sido sometidos a dos tratamientos diferentes. A la izquierda ha sido fijado en fresco, mientras que el de la derecha fue congelado durante varios días antes de ser fijado.
• Se extraen los globos oculares y se fijan en formol al 10% durante un periodo variable, de al menos 7 días. El formol evita la descomposición de los tejidos preservando y fi- jando las proteínas, con lo que endurece la estructura y evita su posible deterioro. Se ha estimado, que el período mínimo para la fijación de los cristalinos en Lepus es de 7 días (Montgomery, 1963).
• Una vez fijados, los cristalinos son extraídos con ayuda de un bisturí y pinzas, separa- dos del humor vítreo, secados ligeramente en papel de filtro.
• El estado de conservación en que se encuentran (Translúcido u Opaco) hacen referen- cia a la apariencia externa de la lente una vez fijada. Si no ha sufrido ningún tipo de al- teración, aparece translúcida, con la superficie lisa, brillante y forma esférica. Si, por el contrario, ha sufrido algún tipo de alteración, aparece opaca, de color blanquecino apa- gado, y con la superficie rugosa. (Figura 2.9).
• Posteriormente son secados en una estufa a 80ºC durante un periodo de 4 a 6 días. El secado es el proceso crítico para la determinación final del peso del cristalino (Cabon- Raczynska & Raczynski, 1972). Diversos autores recomiendan diferentes tiempos y distintas temperaturas para secar lentes de lagomorfos.
2. 3. 4. ANILLOS DE CRECIMIENTO ÓSEO DE LAS MANDÍBULAS
Los métodos de estimación de edades vistos hasta ahora describen únicamente la edad relativa de las liebres (adultas-jóvenes). Existen otra serie de métodos que tratan de determi- nar la edad absoluta de los ejemplares (número de años de vida), y que están basados funda- mentalmente en el estudio de los anillos de crecimiento óseo, que se forman en algunas es- tructuras corporales (Morris, 1972). Uno de los métodos, que ha sido empleado en el estudio de la estructura de edades de algunas especies de lagomorfos, ha sido el del análisis de los ani- llos de crecimiento de las mandíbulas (ver una revisión en Kovacs & Ocsênyi, 1981).
Este método está basado en el crecimiento estacional diferencial del hueso mandibular, con un mayor desarrollo durante las épocas favorables, lo que produce la formación de capas claras y oscuras, separadas por líneas de adhesión distinguibles mediante una correcta tinción (Morris, 1972). Se puede calcular la edad absoluta del animal contando esas líneas.
Investigaciones en animales de edad conocida, como L. europaeus en Dinamarca y Sue- cia (Frylestam & Schantz, 1977), y en L. timidus japonesas (Ohtaishi et al., 1976), han de- mostrado que éste puede ser un método adecuado para la determinación de la edad absoluta. No obstante, las condiciones ambientales del lugar donde se localiza la población en estudio, tienen una gran importancia, puesto que, lo que permite una distinción clara de las bandas, es el hecho de que el crecimiento óseo se ralentiza de forma notoria, o incluso se detiene, en las épocas desfavorables ambientales, invierno generalmente, lo que se traduce en capas óseas más finas y compactas que las que se forman en épocas mas favorables, como el verano. Si los inviernos no son muy marcados (caso de gran parte de la Península Ibérica), el descenso de la tasa de crecimiento es mucho menos notorio, y por lo tanto el método tiene una menor aplicabilidad, puesto que las líneas de crecimiento son menos reconocibles.
Esta es la razón por la que Broekhuizen & Maaskamp, (1979) no fueron capaces de ob- tener resultados fiables, al intentar aplicar esta técnica en cuatro ejemplares de edad conoci- da de L. europaeus holandesas. Ellos achacaron, la falta de resultados, a su escasa experien- cia con la técnica pero, en realidad, probablemente se debiera, a que el invierno holandés no sea lo suficientemente riguroso como para producir líneas de adhesión lo suficientemente marcadas.
Por otro lado, las técnicas aplicadas en el proceso de preparación, descalcificación y tin- ción son diferentes en cada caso (Ohtaishi et al., 1976; Sullins & Mckay, 1976; Frylestam & Schantz, 1977; Henderson & Bowen, 1979; Kovacs & Ocsênyi, 1981) y tienen igualmente una gran importancia, pues, la obtención de resultados fiables, aplicando una metodología funda- mentalmente visual como ésta, está muy condicionada a la aplicación de un riguroso proto- colo, que asegure un correcto tratamiento de las muestras (Morris, 1972).
El protocolo de tinción tiene los siguientes pasos:
1.- Limpieza del hueso: Una vez extraída la mandíbula del cuerpo del animal, se limpia
eliminando al máximo los restos de tejido muscular y tendones. La limpieza final se consigue macerando las mandíbulas en agua corriente, durante un periodo aproximado de un mes, en el que se cambia el agua semanalmente. Una vez limpias, se dejan secar y se rotulan conve- nientemente en la cara interior del hueso.
2.- Decalcificación: el siguiente paso consiste en la eliminación de las estructuras cálci-
cas del hueso. Para ello, la mandíbula se introduce en ácido nítrico (HNO3) al 5% durante 4 horas. Para asegurarnos que el hueso esta convenientemente decalcificado, es conveniente atravesarlo con una alfiler entomológico. Si atraviesa la estructura sin problema, esta correc- tamente decalcificado
Figura 2. 10. Zona de la mandíbula seleccionada para la extracción de los cortes histológicos.
Las flechas indican la sección que es seleccionada y las líneas de puntos indican las zo- nas más propicias para realizar las observaciones de anillos de crecimiento (Kovacs & Ocsên- yi, 1981).
3.- Aclarado: el hueso decalcificado es lavado y aclarado en agua destilada durante 24
horas, cambiando de agua en varias ocasiones. Es conveniente hacerlo concienzudamente pa- ra eliminar todos los restos de ácido que, de lo contrario, pueden decolorar la tinción.
4.- Corte: las muestras son fijadas en un gel (Freezing agent) y cortadas mediante un mi-
crotomo de precisión (cortes de 15 y 20 micras). Los cortes se realizan de forma transversal a partir de la región central del hueso mandibular, entre el primero y segundo molar (Figura 2.10).
5.- Tinción: Una vez obtenidos los cortes se tiñen con Hematoxilina de Erhlich durante
20 minutos, se aclaran con varios lavados en agua corriente durante 40 minutos y son monta- dos en portaobjetos para ser observados a microscopio óptico.