Descripción de la sonda de calcio Aequorina.

Las medidas de Ca2+ en población celular realizadas en los experimentos del presente trabajo se llevaron a cabo gracias a la fotoproteína aequorina (AEQ), proveniente del cnidario Aequorea Victoria (Shimomura et al., 1962). En el propio cnidario la AEQ se encuentra presente junto a la proteína verde fluorescente (GFP) de modo que la energía liberada de la AEQ, como emisión de luz azul, sirve de excitación a la GFP que a su vez emite en el rango de luz verde. Este fenómeno se denomina Chemoluminiscence

Resonance Energy Transer (CRET) (Morise et al., 1974).

La apoproteína de la AEQ (Fig. 14) estructuralmente consta de 189 residuos de aminoácidos con un peso de unos 21Kda. Existen cuatro dominios proteicos, tres de ellos funcionales, denominados EF-Hand. Estos dominios tipo hélice-bucle-hélice son capaces de interaccionar con iones Ca2+. También presenta un sitio catalítico para la interacción con su grupo prostético, la celenteracina, responsable del proceso de bioluminiscencia (Shimomura & Inouye, 1996; Head et al., 2000; Deng et al., 2004). Tras la interacción de la AEQ con su grupo prostético, proceso denominado reconstitución, y en presencia de Ca2+ unido a la AEQ, ésta cataliza la reacción de peroxidación del propio grupo prostético. El producto generado, la celenteramida, se encuentra en un estado electrónico excitado y emite un fotón en el rango visible a 470nm al pasar al estado fundamental (Vysotski & Lee, 2004).

La velocidad de emisión de fotones es proporcional a la concentración de Ca2+ ([Ca2+]), en un rango de concentraciones determinado. Tras la reacción, una nueva unión de la apoproteína al grupo prostético es lenta (Ohmiya & Tsuji, 1993), considerándose la emisión de fotones como un proceso irreversible desde el punto de vista experimental. Esto da lugar a una desaparición progresiva de la sonda que se suele denominar “consumo” de la aequorina.

Fig. 14. Modelo estructural y funcional de la fotoproteína aequorina. Se puede visualizar en la parte arriba

izquierda el cnidario Aequorea Victoria, arriba a la derecha la representación estructural de la apoproteína, destacando los tres dominios funcionales EF-Hand (motivo hélice-bucle-hélice) interaccionando con tres iones Ca2+

(esferas azules, no representadas a escala). En la parte de abajo se representa el fenómeno de bioluminiscencia, en presencia de Ca2+.

Como sonda de Ca2+, la aequorina tiene una buena relación señal/ruido, y poca capacidad de tamponamiento. Carece de fototoxicidad a diferencia de otros indicadores de Ca2+, en su amplia mayoría fluorescentes, puesto que no necesita excitación previa. Además, presenta baja sensibilidad a cambios de pH (Blinks, 1990), frente a otras sondas basadas en la proteína verde fluorescente (GFP) y calmodulina (CaM) (Miyawaki et al., 1997), permitiendo medidas más fiables en entornos ácidos como el interior de los SG. El uso de quelantes de Ca2+ en la preparación de medios no tiene efectos directos sobre la funcionalidad de AEQ.

Por otra parte, el “consumo” de la sonda de AEQ supone una limitación temporal de los experimentos con AEQ. Además, la alta afinidad de la AEQ nativa (wtAEQ) por Ca2+ permite medidas fiables en el rango de [Ca2+] 0,1 – 5,0µM, por encima del cual la AEQ se consume prácticamente en su totalidad en pocos segundos.

Este era el principal inconveniente de la sonda y que limitaba su uso a registros de Ca2+ citosólico, siendo inviables medidas en otros orgánulos como las mitocondrias, el complejo de Golgi (GC), el ER y los SG entre otros, donde están descritos niveles de [Ca2+] de varios órdenes de magnitud superiores.

Inicialmente, desde los años 60 a los 80 del siglo pasado, para realizar registros de Ca2+ la AEQ era aislada de la Aequorea Victoria en medio libre de Ca2+ y micro-inyectada en las células de estudio como el axón gigante del calamar. Este sistema era tedioso y su uso limitado a ciertos tipos celulares, siendo no obstante un buen indicador de Ca2+ citosólico (Ridgway & Ashley, 1967; Ridgway et al., 1977). La clonación del cDNA que codifica para la AEQ (Inouye et al., 1985) ha supuesto un gran avance en el desarrollo de la técnica. Por una parte se sustituyó la microinyección de proteína por la transfección o infección que amplía el estudio a un mayor número de tipos celulares. Además, se puede modificar el cDNA, añadiendo secuencias diana de dirección hacia compartimentos subcelulares, tales como la mitocondria (Rizzuto et al., 1992), el ER (Montero et al., 1997a), la zona submembrana plasmática (Marsault et al., 1997), el GC (Pinton et al., 1998) y los SG (Mitchell et al., 2001), entre otros.

Realizar mutaciones en los dominios EF-Hand, permitió disminuir la afinidad por Ca2+. Una primera mutación se realizó en el tercer dominio EF-Hand, sustituyendo un residuo de aspartato por otro de alanina en la posición 119 (D119A), que permitió reducir la afinidad un orden de magnitud (Kendall et al., 1992). Así se amplió el rango de medida a 100µM (Montero et al., 1997a). Recientemente, en nuestro laboratorio se ha realizado con éxito una segunda mutación en el primer dominio EF-Hand, sustituyendo un residuo de asparagina por otro de leucina en la posición 28 (N28L), que ha permitido reducir aún más la afinidad hasta 2 órdenes de magnitud respecto a la AEQ nativa (De la Fuente et al., 2012; 2013). La utilización de variantes de celenteracina (wt, i, n…) que modifican la velocidad de emisión de fotones, permitió también ampliar los rangos de medida de [Ca2+] (Fig. 15) (Montero et al., 1997b).

Por último, modificando la temperatura de trabajo de 37ºC a 22ºC se hace más lenta la reacción, alargando el tiempo de medida, pero con el inconveniente de no ser la temperatura fisiológica (Álvarez & Montero, 2002).

Fig. 15. Curvas de calibración de la diferentes aequorinas. Se pueden observar las curvas de calibración de los

tipos de AEQ y celenteracinas comúnmente usados en este laboratorio, junto a la 28,119-mAEQ (o LAAEQ), recientemente calibrada, todas a 37ºC (De la Fuente et al., 2012).

De esta forma se solventa el problema de la saturación de la señal, consecuencia de las diversas magnitudes de [Ca2+] existentes en los diferentes orgánulos, disponiendo así de varios rangos de medida según el tipo de experimento. En el presente trabajo se han usado diferentes sondas de aequorina dirigidas a citosol (cyt-AEQ), mitocondria (mit- mAEQ), retículo endoplásmico (ER-LAAEQ), zona submembrana plasmática (SNAP25-mAEQ), y los gránulos de secreción. En estos últimos la sonda concretamente se ha localizado tanto anclada a la membrana granular con la AEQ en el lado interno de la misma (VAMP-mAEQ), como localizada en la matriz densa (CgA- mAEQ y NPY-mAEQ), como se ha descrito con anterioridad (Fig. 16).

El direccionamiento al ER se realizó con la secuencia de la cadena pesada de la inmunoglobulina IgM, el de la matriz mitocondrial con la secuencia que codifica la subunidad VIII del complejo Citocromo Oxidasa (COXVIII), y el de la membrana plasmática mediante SNAP25, una proteína t-SNARE que colabora en el proceso de exocitosis desde el anclaje a la membrana plasmática. Todas las aequorinas presentan

Fig. 16. Esquema de las diferentes sondas bioluminiscentes de aequorina utilizadas en el presente trabajo. En

orden descendente se encuentran las aequorinas mutadas dirigidas a los gránulos de secreción (SG), la aequorina citosólica, la aequorina mutada dirigida a la mitocondria, la aequorina mutada anclada a la cara interna de la membrana plasmática y finalmente la aequorina de doble mutación dirigida al retículo endoplásmico (ER). Las flechas muestran las mutaciones realizadas en los respectivos aminoácidos de forma esquemática.