Procedimiento experimental.

A continuación, se describe la composición de los medios más comúnmente utilizados en los registros de Ca2+, tanto para luminiscencia como fluorescencia.

- Medio extracelular Ca2+ 1mM: NaCl 145mM, KCl 5mM, MgCl2 1mM, CaCl2 1mM, glucosa 5-10mM, HEPES

10mM; pH 7,4 (NaOH).

- Medio extracelular libre de Ca2+: NaCl 145mM, KCl 5mM, MgCl2 1mM, EGTA 0,2mM, glucosa 5-10mM,

HEPES 10mM; pH 7,4 (NaOH).

- Medio intracelular de permeabilización libre de Ca2+_{: NaCl 10mM, KCl 130mM, MgCl}

2 2mM, H2KPO4 1mM,

- Medio intracelular libre de Ca2+_{: NaCl 10mM, KCl 130mM, MgCl}

2 2mM, H2KPO4 1mM, EGTA 0,2mM,

succinato 5mM, glutamato 5mM, malato 5mM, ATP-K+ 1mM, ADP-K+ 20µM, HEPES 20mM; pH 7,0 (KOH).

- Tampones intracelulares de Ca2+ libre 100nM (37ºC): NaCl 10mM, KCl 130mM, MgCl2 1,96mM, H2KPO4

1mM, CaCl2 224µM, EGTA 1mM, succinato 5mM, glutamato 5mM, malato 5mM, ATP-K +

1mM, ADP-K+ 20µM, HEPES 20mM; pH 7,0 (KOH).

- Tampones intracelulares de Ca2+ libre 100nM (22ºC): NaCl 10mM, KCl 130mM, MgCl2 1,96mM, H2KPO4

1mM, CaCl2 190µM, EGTA 1mM, succinato 5mM, glutamato 5mM, malato 5mM, ATP-K+ 1mM, ADP-K+

20µM, HEPES 20mM; pH 7,0 (KOH).

Para poder realizar las medidas de [Ca2+] mediante bioluminiscencia, se requiere que previamente la sonda de AEQ se reconstituya con su grupo prostético, la celenteracina. Este proceso se llevó a cabo a temperatura ambiente (15-20ºC) y en oscuridad. La celenteracina, lipofílica, difunde a través de las membranas celulares y se asocia a la AEQ. En los distintos experimentos, según el tipo de orgánulo donde se realizan los registros de bioluminiscencia, el protocolo de reconstitución varía. Para los registros de Ca2+ en citosol, zona submembrana plasmática y mitocondria, las células sembradas en cristales de 13mm de diámetro se incubaron en medio extracelular Ca2+ 1mM conteniendo 1µM de celenteracina wt, durante 1 hora. Para los registros de Ca2+ en el retículo endoplásmico, la reconstitución de la celenteracina se llevó a cabo en algunos casos depletando los depósitos de Ca2+ y en otros casos sin depletarlos. El proceso de vaciamiento, o depleción, de Ca2+ del retículo se realizó por un tratamiento de 10 minutos con terc-butil-benzohidroquinona (BHQ) 10µM, inhibidor reversible de la ATPasa del retículo sarco/endoplásmico (SERCA), en medio extracelular libre de Ca2+. Tras ese tiempo se realizaron dos lavados con medio extracelular libre de Ca2+ y la incubación final en ese mismo medio suplementado con BHQ 10µM. En ambos casos, bien con depleción o sin ella las células se incubaron con celenteracina i entre 1,5-2 horas. Finalmente para los registros de Ca2+ en gránulos de secreción se procedió a una depleción más drástica de los depósitos de Ca2+ incubando las células durante 10 minutos con ionomicina 10µM (ionóforo de Ca2+), monensina 10µM (ionóforo que intercambia Na+ por H+ a través de membranas biológicas) y BHQ 10µM en medio extracelular libre de Ca2+. De esta forma, se abole totalmente el gradiente y se vacían de Ca2+ los SG. El resto del proceso es similar al visto para la reconstitución del ER, salvo que la reconstitución se realiza incubando 1-2 horas con celenteracina wt.

Tras el periodo de reconstitución se dispusieron las células en la cámara de perfusión, termostatizada a la temperatura deseada, la cual se fijó previamente (37ºC o 22ºC). Se selló el cubreobjetos con una película de grasa de silicona, y se dispuso la cámara en el fotomultiplicador, refrigerándose antes de comenzar los experimentos. Se perfundió medio extracelular Ca2+ 1mM, o bien en células depletadas medio extracelular libre de Ca2+, y se inició el registro de luminiscencia. En el caso de registros con VAMP-mAEQ tras perfundir 2 minutos con medio extracelular libre de Ca2+, seguidamente se pasó a medio externo La3+ 0,5mM (suplementado con LaCl3). De esta forma se consumió la AEQ anclada a la parte externa de la membrana plasmática para evitar su interferencia con las medidas de [Ca2+]. Tras esto se perfundió medio extracelular libre de Ca2+ durante 3-4 minutos, lavando así el La3+ restante que pudiera interferir en la medida.

En el caso de experimentos en células intactas sin depleción tras perfundir el medio extracelular Ca2+ 1mM durante 2 minutos se probaron los diferentes agonistas o medios utilizados. En los experimentos de células intactas depletadas, y en concreto en las medidas en los SG, se perfundió medio extracelular libre de Ca2+ durante 4-5 minutos para lavar el BHQ de la reconstitución, y seguidamente se perfundió medio extracelular Ca2+ 1mM. Cuando la señal se estabilizó, proceso que puede durar desde 10 a 30-40 minutos según la temperatura de trabajo fijada, se procedió a perfundir los diferentes agonistas o medios. Para obtener la luminiscencia total necesaria en los cálculos de [Ca2+], al final del experimento se perfundió una solución de Ca2+ 10mM con digitonina 20-100µM, un glucósido detergente, que solubiliza lípidos y precipita con colesterol, capaz de crear poros en la membrana externa celular sin dañar significativamente orgánulos internos, al menos en tratamientos cortos. Los experimentos en células permeabilizadas se realizaron con una depleción previa. Tras el lavado del BHQ se perfundió durante 1 minuto un medio intracelular de permeabilización libre de Ca2+ con digitonina 20-100µM, según el orgánulo y tipo celular del experimento. Seguidamente se procedió al lavado del resto de la digitonina con un medio intracelular libre de Ca2+ generalmente durante 5 minutos. Por último, se perfundieron tampones intracelulares de Ca2+ libre 100nM probando tras estabilizarse la señal diferentes agonistas. En este caso la luminiscencia total se obtiene perfundiendo la solución de Ca2+ 10mM al final del experimento.

4.4

Cálculo de la concentración de calcio a partir de los datos de