SECRECIÓN EN LAS LINEAS NEUROENDOCRINAS PC12 E INS-1 REGISTROS EN CÉLULA ÚNICA.
D). Los resultados obtenidos de la inhibición con BHQ, tanto en el proceso de rellenado
1. LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DE LAS SONDAS BIOLUMINISCENTES Y FLUORESCENTES.
Para el estudio de la dinámica de Ca2+ de los gránulos de secreción (SG) en población celular en nuestro laboratorio, se han sintetizado y utilizado diferentes sondas de Ca2+ basadas en aequorina tanto ancladas a la cara interna de la membrana (VAMP-mAEQ) como solubles en la matriz densa de los SG (CgA-mAEQ y NPY-mAEQ). Para verificar la correcta localización de estas sondas en las vesículas de secreción se estudió la distribución celular mediante imagen en microscopía confocal de las sondas fluorescentes VAMP-EGFP, CgA-EGFP y NPY-EGFP respectivamente.
Resultados previos en nuestro laboratorio así como de otros autores demostraron la localización tanto de VAMP-EGFP como VAMP-mAEQ en vesículas de secreción, fundamentalmente LDCV (Large Dense Core Vesicles) en las líneas celulares neuroendocrinas MIN6 (Mitchell et al., 2001; 2003), PC12 (Moreno et al., 2005; 2010; SantoDomingo et al., 2010), INS-1 e INS-1E (Iezzi et al., 2005; SantoDomingo et al., 2010) y cromafines (Allersma et al., 2004; SantoDomingo et al., 2008). Por otra parte, tanto CgA como NPY se localizan exclusivamente en LCDV (Wegrzyn et al., 2007) y de ahí el uso extendido de las sondas fluorescentes CgA-EGFP y NPY-EGFP en la visualización de los SG (Kaether et al., 1995; Lang et al., 1997; Inomoto et al., 2007; Ravier et al., 2008; Moreno et al., 2010). Las imágenes de microscopía confocal de células INS-1 e INS-1E expresando VAMP-EGFP, CgA-EGFP y NPY-EGFP, mostraron un patrón granular típico con una pequeña fracción fluorescente asociada a la membrana plasmática en el caso de la expresión de VAMP-EGFP. No obstante, es difícil excluir la presencia de una mínima porción de estas sondas en otros compartimentos de la vía de secreción, bien retículo endoplásmico (ER) y/o complejo de Golgi (GC).
En el análisis funcional los niveles de concentración de Ca2+ ([Ca2+]) obtenidos con CgA-mAEQ y NPY-mAEQ fueron similares a los obtenidos con VAMP-mAEQ, y diferentes a los de cualquier otro compartimento celular susceptible de almacenar Ca2+.
El uso de las sondas CgA-mAEQ y NPY-mAEQ, dirigidas a la matriz de los SG, supuso además una ventaja experimental con respecto a VAMP-mAEQ dirigida a la cara interna de la membrana de los SG, ya que suprimió la necesidad de dar el pulso previo de La3+ que elimina la luminiscencia de la aequorina anclada en la parte externa de la membrana plasmática. Aunque el La3+ es en principio un catión impermeable a la membrana celular, no se puede excluir completamente que pequeñas cantidades del mismo puedan acceder al interior de la célula e interferir con los flujos de Ca2+ (Szász et al., 1978). La eliminación completa de la luminiscencia de la membrana plasmática requiere una incubación con concentraciones de La3+ en el rango de milimolar durante más de 5 minutos, lo que alarga considerablemente el tiempo de experimentación.
Otro objetivo del presente trabajo ha sido la posibilidad de realizar un estudio de la dinámica de Ca2+ de los SG mediante registro de fluorescencia en célula única. Se diseñaron para este propósito las sondas VAMP-rtPericam, CgA-rtPericam y NPY- rtPericam y las sondas VAMP-GEMGECO1, VAMP-GEXGECO1, VAMP-RGECO1, CgA-GEMGECO1, CgA-GEXGECO1, CgA-RGECO1, NPY-GEMGECO1, y NPY- GEXGECO1.
Las imágenes de microscopía confocal de células PC12 expresando la sonda VAMP- rtPericam, mostraron una señal fluorescente de un posible patrón granular pero de muy baja intensidad y sin señal en la membrana plasmática. Una de las principales desventajas de la sondas de Ca2+ basadas en YFP es su sensibilidad a variaciones de pH (Rudolf et al., 2003; Day & Davidson, 2009). Sin embargo, la alcalinización del medio vesicular con FCCP no desencadenó aumento de la señal fluorescente a diferencia de lo observado en células PC12 expresando VAMP-EGFP (SantoDomingo et al., 2008) y la adición de GPN descartó que la señal se debiera a un componente lisosomal.
En vista de estos resultados, podría ocurrir que la sonda VAMP-rtPericam se empaquetara en el ER pero que perdiera la funcionalidad durante el proceso de formación de las vesículas en el GC. No obstante, bloqueando el transporte proteico al GC mediante la incubación de las células PC12 con BrA tampoco se observó aparición de fluorescencia en el ER.
Algunos autores han propuesto que determinados sensores basados en la proteína cp- Venus, y por tanto cp-YFP, no se expresan correctamente en ER y, de ahí, que tampoco en otros compartimentos de la propia vía de secreción (Palmer & Tsien, 2006). En cuanto al origen de la señal apreciada en las imágenes de confocal, nuestra opinión es que lo más probable es que fuera debida a fenómenos de auto-fluorescencia de los SG en los cultivos celulares.
Al estudiar la expresión de NPY-rtPericam en células PC12 las imágenes de microscopía confocal mostraron una fuerte señal correspondiente a un patrón reticular, sin presencia de ningún patrón de tipo granular en contra de lo que cabría esperar. Por otra parte, en células PC12 que expresaban el constructo NPY-EGFP se observó una pequeña pero no despreciable población (20-30%) con este mismo patrón reticular. Se ha propuesto que la aparición de este patrón reticular y similares podría deberse a un plegamiento aberrante de la propia EGFP (Nagai et al., 2002). Otros autores, sin embargo, afirman que dicho patrón reticular puede tener un origen mitocondrial en base a la existencia de una posible secuencia de inicio de traducción kozak-2, dentro de la secuencia codificante del propio NPY humano. La traducción de dicha señal kozak-2 generaría un péptido para la localización en el espacio intermembrana de la mitocondria (Kaipio et al., 2005). En la consiguiente expresión de NPY-EGFP, el porcentaje de población celular con EGFP distribuida con patrón granular o mitocondrial dependería del propio tipo celular. En base a los resultados de colocalización del NPY-EGFP con el colorante de mitocondria MitoTracker Deep Red obtenidos, apoyamos esta segunda hipótesis. Las implicaciones celulares que conllevan la aparición del fragmento NPY- mitocondrial no se conocen con claridad, si bien determinados autores coinciden en que dicho proceso se desencadena en condiciones patológicas (Kaipio et al., 2009). Se ha observado que el fragmento NPY-mitocondrial despolariza la mitocondria (Brun et al., 2006), y también se ha sugerido que pueda actuar abriendo el poro de transición de permeabilidad (PTP). En cualquiera de los casos, la homeostasis del Ca2+ mitocondrial se vería afectada, conllevando en último término a la apoptosis celular (Tsujimoto et al., 2006). La supresión de la secuencia kozak-2 del NPY eliminó la localización mitocondrial, obteniéndose una ausencia total de expresión del constructo NPY- rtPericam así como la desaparición del porcentaje de población celular que expresaba NPY-EGFP con patrón reticular. Se garantizó así que las medidas de [Ca2+] con este
Por otra parte, de los constructos con sondas de Ca2+ GECO desarrollados en el presente trabajo y expresados en las líneas celulares PC12 e INS-1, tan solo VAMP-RGECO1, VAMP-GEMGECO1, VAMP-GEXGECO1, NPY-GEMGECO1 y NPY-GEXGECO1 mostraron un patrón adecuado de distribución subcelular en los SG. Ninguna de las sondas fluorescentes de Ca2+ con la secuencia de direccionamiento Cromogranina A (CgA) se expresaron correctamente, al contrario que las sondas CgA-EGFP y CgA- mAEQ. A diferencia de las señales de localización VAMP y NPY, CgA tiene un alto peso molecular (50KDa) y los constructos de rtPericam y GECO generados con esta secuencia de localización (entorno a los 100KDa) puede que se empaqueten con mayor dificultad a lo largo de la vía de secreción. Además, se ha descrito que tanto CgA como CgB tienden a autoagregarse en entornos ácidos y a altas [Ca2+] como las que están presentes en el lumen del complejo trans-Golgi (Taupenot et al., 2003), lo que podría dificultar aun más el correcto empaquetamiento de estas sondas de Ca2+. De hecho, bajo nuestras condiciones experimentales, la tasa de expresión del constructo CgA-EGFP fue ligeramente menor, comparada con la expresión de VAMP-EGFP y NPY-EGFP tanto en la línea celular PC12 como en células INS-1.
Las imágenes de células PC12 expresando VAMP-RGECO1 mostraron un patrón granular poco definido con una baja intensidad de fluorescencia. Se han descrito problemas similares con constructos de RGECO1 dirigidos al ER, sugiriendo que puede deberse a interacciones competitivas de los dominios proteicos CaM y M13 con proteínas endógenas de la vía de secreción (Wu et al., 2014). Con el fin de solventar el problema del empaquetamiento celular del constructo VAMP-RGECO1, se optó por administrar un medio suplementado con glicerol a los cultivos celulares que expresaran dicha sonda de Ca2+. In vitro se sabe que el glicerol estabiliza la conformación de las proteínas e incrementa la tasa de replegamiento en el análisis electroforético (Sawano et al., 1992). In vivo el grupo del Dr. Kopito demostró que en células HEK que presentaban la mutación ∆F508, más común en la fibrosis quística, el tratamiento celular con glicerol al 10%(v/v) revertía este fenotipo ya que aumentaba la tasa de plegamiento y expresión del canal de Cl- asociado a la mutación (Sato et al., 1996). Con este mismo planteamiento, se han podido subsanar a nivel celular diferentes patogenias asociadas a plegamiento aberrante de proteínas (LaConte et al., 2014).
En el presente trabajo la incubación con un medio celular suplementado con 5%(v/v) de glicerol mejoró de forma reversible tanto la tasa de expresión como la distribución granular de la sonda VAMP-RGECO1 en células PC12. Si bien es cierto que la mejora fue superior con la incubación en un medio con 10%(v/v) de glicerol, también aumentó la toxicidad asociada al mismo.
Frente a los resultados observados con la sonda VAMP-RGECO1, los constructos VAMP-GEMGECO1, VAMP-GEXGECO1, NPY-GEMGECO1 y NPY-GEXGECO1 mostraron una distribución granular con una alta tasa de expresión, tanto en la línea celular PC12 como en células INS-1. De forma similar a lo visto en la expresión de VAMP-EGFP, los constructos con la señal de localización VAMP (VAMP- GEMGECO1 y VAMP-GEXGECO1) presentaron una señal asociada a la membrana plasmática, en algunos casos más intensa que la observada en los ensayos con la sonda VAMP-EFGP. La localización de estas sondas en compartimentos acídicos se ha puesto de manifiesto con el constructo TiVAMP-GEMGECO1, dirigido a endosomas en células MIN6 (Albrecht et al., 2015). El tratamiento previo con glicerol no supuso una mejora significativa tanto en la localización como en la funcionalidad observada en los registros de Ca2+ obtenidos.