ESTUDIO DEL CALCIO VESICULAR EN CÉLULA ÚNICA DE LINEAS NEUROENDOCRINAS PC12 E

INS-1. SUBPOBLACIÓN VESICULAR.

Hasta ahora se ha estudiado la dinámica de Ca2+ vesicular en población celular de líneas neuroendocrinas, mediante sondas de aequorina dirigidas a los SG. Estos estudios han permitido establecer los principales mecanismos de captación y liberación de Ca2+ en los SG de estos cultivos celulares, así como proponer un papel para el Ca2+ granular en el proceso de secreción inducido por la activación de VOCC. Este modelo considera un balance global de la respuesta de la población vesicular, si bien en las respuestas observadas predomina probablemente la componente de las subpoblaciones IRP, RRP y en menor grado SRP (Slow Releasable Pool), más próximas a la membrana plasmática (García et al., 2006; Álvarez & Marengo, 2011). Sin embargo, en este estudio en poblaciones celulares resulta difícil explicar con profundidad el origen de ciertas respuestas bifásicas observadas tras determinados estímulos. Para considerar la contribución individual de otras subpoblaciones de gránulos de secreción, como RVP (Reserve Vesicle Pool), fue preciso llevar a cabo estudios de dinámica de Ca2+ vesicular en célula única, mediante sondas de Ca2+ fluorescentes dirigidas a los SG.

El principal inconveniente de las sondas de Ca2+ fluorescentes es su sensibilidad a pH ácido, medio propio de las vesículas de secreción. Como se discutió en el primer apartado, las únicas sondas que se expresaron correctamente en los SG fueron VAMP- RGECO1, VAMP-GEMGECO1, VAMP-GEXGECO1, NPY-GEMGECO1 y NPY- GEXGECO1. Pese a que todas estas sondas de Ca2+ basadas en GECO deberían en principio estar parcialmente saturadas en el rango de [Ca2+] de los SG, en base a sus valores tabulados de Kd, se consideró que el entorno ácido vesicular podría reducir su afinidad por Ca2+ y por tanto aumentar su Kd, de tal manera que fuera posible realizar mediciones de Ca2+ significativas en el interior de los SG.

El laboratorio del Dr. Campbell así lo recoge en un estudio de medición de Ca2+ en endosomas de línea celular MIN6, orgánulos con una matriz de acidez similar a la encontrada en los SG (Albrecht et al., 2015). En ese estudio, la sonda de Ca2+ dirigida a endosomas TiVAMP-GEMGECO1 experimentó un aumento en la Kd aparente de dos órdenes de magnitud al pasar de pH 7,0 (460nM) a pH 5,4 (17880nM).

En los registros en célula única con la sonda de Ca2+ VAMP-RGECO1, en contra de lo que cabía esperar al pasar al entorno ácido vesicular, la intensidad de la señal fluorescente se minimizó considerablemente lo cual, junto a una escasa modificación de la Kd aparente, llevó a desestimar el uso de esta sonda de Ca2+. Otro inconveniente fue que si bien el tratamiento con glicerol a las células que expresaban VAMP-RGECO1 mejoró la distribución de la sonda en los SG, la señal fluorescente presentaba siempre una baja intensidad. Este problema ha sido abordado por diversos autores, resultando en modificaciones genéticas que, además de mejorar la intensidad de la señal fluorescente, aumentaron la propia Kd de la sonda de Ca2+ (Akerboom et al., 2013; Wu et al., 2013; 2014). Sin embargo, estos nuevos constructos presentaron una mayor dependencia frente al pH, y además, en estos mismos estudios se mostró que el RGECO1 exhibe una significativa foto-activación al excitarse en el rango de longitudes de onda del azul y del verde, generando posible artefactos de medida, problema añadido que cuestiona el uso de esta sonda de Ca2+.

El principal inconveniente del uso de las sondas ratiométricas de GEMGECO1 y GEXGECO1 fue la excitación a longitudes de onda próximas al UV. Debido al consecuente fotoblanqueo de la sonda, los tiempos de experimentación se acortaron a máximo 8-10 minutos siendo inviable realizar estudios de dinámica de Ca2+ vesicular en célula única a partir de cierto aumento y resolución confocal y resultando por tanto imposible una diferenciación más exhaustiva de las subpoblaciones vesiculares. No obstante, fue posible explorar la dinámica de Ca2+ vesicular en diferentes regiones celulares concéntricas seleccionadas: el entorno inmediato granular por debajo de la membrana plasmática, una región vesicular intermedia, y una región interna caracterizada generalmente por un cúmulo de fluorescencia de los SG.

Los experimentos de captación de Ca2+ vesicular en células únicas depletadas que expresaban VAMP-GEMGECO1, VAMP-GEXGECO1 y NPY-GEMGECO1 tanto en la línea celular PC12 como células INS-1, demostraron que este proceso es similar al registrado en población celular con las correspondientes sondas de AEQ dirigidas a los SG, si bien no se observa el pico transitorio inicial de [Ca2+]SG. Este hecho refuerza la hipótesis de la diferente compartimentalización de las sondas de AEQ dirigidas a los SG y el consumo de aequorina inicial de estas mismas sondas en los compartimentos con mayor nivel de Ca2+ mencionado en el apartado anterior. Nuestros datos han mostrado que este proceso de captación de Ca2+ está mediado principalmente a través de ATPasas de tipo SERCA, observándose una disminución parcial de la captación tras el tratamiento con BHQ en todas las regiones seleccionadas. Esta disminución no fue tan drástica como en experimentos similares realizados en población celular, probablemente debido a la saturación de la sonda de Ca2+ en algunos compartimentos durante el rellenado de Ca2+ en condiciones control.

Los experimentos de despolarización con alto K+ desencadenaron aumentos transitorios de la [Ca2+]SG y, como se observa tras la inhibición con BHQ, fueron mediados igualmente a través de la SERCA. Estas repuestas de Ca2+ vesicular, tratadas desde una visión global, fueron reflejo del comportamiento descrito en población celular, con las salvedades existentes entre la línea celular PC12 y las células INS-1, sin observarse además diferencias significativas de comportamiento con respecto al tratamiento de depleción de Ca2+ previo. Por otra parte, el ATP puede actuar a través de receptores P2X o P2Y, cuyo nivel de expresión varía según el tipo celular. En la línea celular PC12 indiferenciada se ha descrito que el ATP desencadena entrada de Ca2+ a través de receptores P2X mayoritariamente, cobrando importancia la participación de la liberación de Ca2+ de depósitos internos, vía P2Y, conforme los cultivos celulares de PC12 se diferencian en neuronales (Sela et al., 1991; Arslan et al., 2000). En la línea celular INS-1 la diferencia de expresión entre ambos receptores P2X y P2Y no es tan marcada (Petit et al., 2009). En el presente trabajo solo se ha evaluado la estimulación con ATP en registros de célula única con la línea celular PC12 expresando tanto VAMP-GEMGECO1 como NPY-GEMGECO1, observándose que produce un aumento transitorio de la [Ca2+]SG, al igual que la despolarización con alto K+.

Atendiendo a las diferencias entre las regiones seleccionadas, en células PC12 e INS-1 depletadas y posteriormente rellenadas de Ca2+, conforme se produjo un alejamiento de la membrana plasmática apareció una disminución progresiva en el nivel de captación de Ca2+ vesicular así como una cinética mas lenta del proceso. Esa disminución fue mas marcada en los registros con la sonda VAMP-GEMGECO1 frente a la sonda NPY- GEMGECO1, en la cual no se aprecian diferencias significativas entre las regiones intermedia y cercana a la membrana plasmática. Este hecho puede ser atribuible a la presencia de una componente de la sonda VAMP-GEMGECO1 localizada en la parte externa de la membrana plasmática, sensible a los cambios en la [Ca2+] externa, a pesar de la selección minuciosa de las regiones vesiculares. No obstante, sí parecen mantenerse las diferencias entre estas regiones y la región vesicular mas interna. Una explicación a este cambio en la cinética de captación vesicular de Ca2+ con la distancia de la membrana plasmática puede darse en base a la progresión de la onda de Ca2+ a lo largo de la célula. En las regiones próximas a la membrana plasmática tanto la activación de la entrada de Ca2+ capacitativa como la inducida por despolarización con alto K+ o la entrada de Ca2+ a traves de receptores de ATP generaría una zona de alta [Ca2+]. Las vesículas de esa zona podrían experimentar una mayor y más rápida captación de Ca2+, la cual tanto en células PC12 como células INS-1 predomina sobre la liberación debido a la gran entrada de Ca2+ a través de los VOCC. Puesto que el gradiente de [Ca2+] disminuiría conforme nos alejamos de la membrana plasmática, el proceso de captación de Ca2+ de vesículas de zonas mas internas sufriría un decremento en amplitud maxima y cinética del mismo.

No obstante, podría plantearse además un segundo mecanismo relacionado con el proceso de maduración que sufren las vesículas a lo largo de su recorrido hacia la secreción. Dentro de la matriz granular el calcio puede encontrarse libre como Ca2+ o bien unido a diferentes moleculas como ATP, cromograninas, etc (Borges et al., 2012). Dentro de la fracción de calcio ligado, a su vez se puede considerar un subcompartimento estructural de intercambio muy lento, y otro subcompartimento que se encuentra unido a cromograninas y otros componentes de afinidad próxima a la fracción de Ca2+ vesicular libre, disponible de intercambio y con un tamaño que puede depender de las variaciones en la [Ca2+]C (Álvarez, 2012).

Esta bi-compartementalización (o tri-compartimentalización) del calcio total vesicular podría tomar parte en el proceso de reducción de fuerza osmótica, necesario para la acumulación de catecolaminas en los SG. La acumulación de catecolaminas es un proceso realizado a través de transportador vesicular de monoaminas (VMAT) en sinergia con la acumulación de H+ a través de la bomba de H+ vacuolar V-ATPasa, y por tanto con el proceso de acidificación que sufren las vesículas a lo largo de su recorrido hacia su secreción. En las vesículas con un pH cercano a 6,4 presente en el GC (Llopis et al., 1998) originalmente existiría una mayor proporción de Ca2+-libre que daría lugar a una menor y más lenta captación de Ca2+ vesicular a través de la SERCA. Conforme fuera aumentando la fuerza osmótica por acumulación de catecolaminas, la proporción de Ca2+-libre disminuiría progresivamente, incrementándose el nivel y la cinética de la captación de Ca2+ vesicular.

Pese a que se requieren investigaciones posteriores, el uso de las sondas de Ca2+ fluorescentes en el estudio de la dinámica de Ca2+ en los SG de célula única descrito en el presente trabajo establece un interesante punto de partida para elucidar el papel del Ca2+ vesicular entre las diferentes subpoblaciones de gránulos de secreción y su contribución al proceso de exocitosis.