DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES PLASMÁTICOS DE GLUTATIÓN

Se utilizó el sistema comercial GSH/GSSG Ratio Detection Assay kit (Abcam). Su fundamento consiste en la unión de una molécula no fluorescente que se convierte en altamente fluorescente tras su reacción con el GSH. De esta manera es posible determinar la concentración de GSH y la de GSH total (GSSG reducido + GSH) de cada muestra cuantificando la fluorescencia específica (Excitación/Emisión= 490/250 nm).

Para la determinación de los niveles de GSH/GGSG se utilizaron muestras de plasma de todos los sacrificios y grupos experimentales. Las muestras fueron diluidas 1:10 en tampón Assay, proporcionado por el kit, y se cargaron 20 μL de muestra en cada uno de los 4 pocillos correspondientes. Se prepararan dos rectas patrón a partir de dos soluciones madre de GHS y GSSG. Las concentraciones de las rectas fueron para el GSH de 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.1563 μM; y para el GSSG de 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.1563 y 0.078 μM. Se prepararon 220 μL de cada disolución para cada ensayo y se mantuvieron en hielo hasta que se llenó la placa. Además, se prepararon soluciones de GSH Assay Mixture (GAM) y Total GSH Assay Mixture (TGAM).

La placa se dividió en dos mitades: una para la determinación de GSH, con su correspondiente recta patrón, y otra para la determinación de GSSG, también con su correspondiente recta patrón (Figura 17).

119 Figura 17. Diseño estándar de una placa para la determinación GSH/GSSG. B: blanco; m: muestra.

Se añadieron 50 μL de las muestras y de las soluciones estándar en los respectivos pocillos. En la mitad izquierda de la placa se añadieron 50 μL de la solución GAM y en la mitad derecha se añadieron 50 μL en la solución TGAM. Más tarde se introdujo la placa en el lector y tras una incubación de 30 minutos se midió la fluorescencia a Ex/Em= 490/250 nm.

Para el tratamiento de los resultados se representaron gráficamente las concentraciones de las rectas estándar respecto a la fluorescencia obtenida. Los valores de fluorescencia de las muestras se interpolaron en las rectas patrón calculando así, para cada muestra un valor (μM) de GSH y de GSH total (recta patrón de GSSG). Con los valores de GSH y GSH total para cada muestra se calcularon los siguientes parámetros: - GSSG = (GSH total - GSH)/2  GSH total = GSH + 2 GSSG - GSH/GSH total - GSH/GSSG - GSH total= GSH + GSSG 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B B m1 m1 m9 m9 B B m1 m1 m9 m9 B 0,1563µM _GSH 0,1563µM _GSH m2 m2 m10 m10 0,078 µM _GSSG 0,078 µM _GSSG m2 m2 m10 m10 C 0,3125 µM _GSH 0,3125 µM _GSH m3 m3 m11 m11 0,1563 µM _GSH 0,1563 µM _GSH m3 m3 m11 m11 D 0,625 µM _GSH 0,625 µM _GSH m4 m4 m12 m12 0,3125 µM _GSH 0,3125 µM _GSH m4 m4 m12 m12 E 1,25 µM _GSH 1,25 µM _GSH m5 m5 m13 m13 0,625 µM _GSH 0,625 µM _GSH m5 m5 m13 m13 F 2,5 µM _GSH 2,5 µM _GSH m6 m6 m14 m14 1,25 µM _GSH 1,25 µM _GSH m6 m6 m14 m14 G 5 µM GSH 5 µM GSH m7 m7 m15 m15 2,5 µM _GSH 2,5 µM _GSH m7 m7 m15 m15 H 10 µM _GSH 10 µM _GSH m8 m8 m16 m16 5 µM GSH 5 µM GSH m8 m8 m16 m16

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3.9. DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES PLASMÁTICOS DE MDA.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA (CLAE).

La técnica de detección mediante Cromatografía líquida (CLAE/VIS) fue realizada en colaboración con el departamento de Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Valencia.

La cromatografía líquida de alta eficacia se encuadra dentro de la cromatografía de elución. En ésta, un líquido (fase móvil) circula en íntimo contacto con un sólido u otro líquido inmiscible (fase estacionaria); al introducir una mezcla de substancias (analitos) en la corriente de fase móvil, cada analito avanzará a lo largo del sistema con una velocidad diferente que dependerá de su afinidad por cada una de las fases. Después de terminado el recorrido de la muestra por la columna, cada una de las substancias introducidas en el sistema eluirá con un tiempo diferente, es decir, separadas unas de otras. En concreto, la técnica utilizada para la determinación de malondialdehído (MDA) fue la cromatografía de reparto/adsorción en fase reversa. Ésta se basa en un reparto del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria, siendo ésta última de naturaleza apolar (cadenas hidrocarbonadas, grupos fenilo) produciéndose así interacciones inespecíficas (efecto solvófobo).

Para la determinación de los niveles de MDA se utilizó el método descrito por Wong y colaboradores (Wong et al., 1987), en el cual una molécula de MDA reacciona con dos moléculas de ácido tiobarbitúrico (TBA) produciendo un cromógeno rosado con un pico máximo de absorción entre longitudes de onda de 532-535 nm. Los resultados obtenidos se expresaron por mL de plasma.

Los reactivos utilizados en este método se elaboraron de la siguiente manera: - Tampón acetato sódico anhidro (AcONa) 2M pH 3,5, con TBA 0,2%. Para

preparar 1L de tampón se tomaron 118 ml de ácido acético glacial (PM = 60,05; δ =1,05g/ml; r=99,7%) y se añadieron 600 ml de agua. Se ajustó el pH hasta 3,5 con NaOH 10M. Una vez ajustado el pH, se añadieron 2 g de TBA y se mantuvo en agitación a 50-60ºC hasta la disolución del TBA. Se comprobó que se mantenía el pH y si no fue así, se volvió a ajustar. Finalmente se aforó el volumen a 1L y se guardó protegido de la luz a 4 ºC.

121 - Tampón KH2PO4 50 mM, pH 6,8. Para preparar 500 ml se pesaron 3,4 g de KH2PO4 y se añadieron unos 400 ml de agua, el pH se ajustó con KOH 1M hasta 6,8 y se aforó con agua hasta el volumen final. Se guardó a 4ºC. - Tampón KH2PO4 50 mM, pH 3,5. Para preparar 500 ml se pesaron 3,4 g de

KH2PO4 y se añadieron unos 400 ml de agua; el pH se ajustó con HCl 1M hasta 3,5 y se aforó con agua hasta el volumen final. Se guardó a 4ºC. Al tratarse de un método isocrático (el solvente conserva la misma concentración durante todo el tiempo de corrida) se necesitaron dos fases diferentes: la “fase de lavado” y la “fase de elución”. La fase de elución (fase B) está constituida por una mezcla de acetonitrilo/agua (70/30), ambos de máxima pureza. En relación a la fase de lavado (fase A), la sal que contiene esta fase es KH2PO4 50 mM, pH 6,8/acetonitrilo (83/17). Se pesaron 13.6 g de KH2PO4 y disolvieron en unos 1800 ml de agua. Se ajustó el pH de esta disolución hasta 6,8 con KOH 1M o, en su lugar, disoluciones de KOH de distinta concentración, y se enrasó el volumen hasta 2 L con agua. A estos 2 L de disolución se añadieron 410 mL de acetonitrilo y se agitó hasta su completa homogenización. Finalmente la solución de filtró (con bomba de vacío y filtro 0.22 µm de Milllipore) y desgasificó con un baño de ultrasonidos durante 20 minutos.

La identificación y cuantificación del MDA de las muestras analizadas se llevó a cabo mediante una curva patrón, por lo cual previamente al ensayo hubo que preparar diferentes concentraciones de MDA. Se partió de una solución comercial de MDA-bis (Merk Millipore) de una concentración 12.2 M y se obtuvo una dilución 10 mM (410 μL de MDA 12.2 M y 500 mL de agua desionizada). Se diluyó la solución anterior a la mitad, con lo que se obtuvo una nueva solución 5 mM y a partir de aquí se obtuvieron las necesarias para los puntos de la recta patrón: 50 µM (dilución 1/100 5 mM de MDA); 25 µM (dilución ½ 50 µM); 12,5 µM (dilución ½ 25 µM); 5 µM (dilución 1/5 25 µM); 2,5 µM (dilución s ½ 5 µM); 1,25 µM (dilución ½ 2,5 µM); y Blanco (25 µl de agua + 500 µl de tampón AcOH 2M pH 3,5 + TBA 0,2%).

Las muestras de plasma obtenidas durante los sacrificios de los animales fueron conservadas a -80ºC y protegidas de la luz desde su extracción hasta su utilización. Se utilizaron muestras de todos los grupos y sacrificios con una n=5. Antes de ser

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introducidas en el aparato de CLAE las muestras fueron preparadas como se describe a continuación.

Para cada muestra se prepararon eppendorfs con 500 µL de tampón AcOH 2M pH 3,5, TBA 0,2% a los cuales se les añadió 20 µL de muestra o patrón. Tras una agitación, las muestras se incubaron durante 60 minutos a una temperatura de +95ºC. En este tiempo se produce la hidrólisis de los lipoperóxidos y la consiguiente liberación de moléculas de MDA, que se conjugan con dos moléculas de TBA. Por tanto, estrictamente, se determina el aducto MDA-TBA2 como índice de peroxidación lipídica. Después de la incubación, las muestras se mantuvieron en hielo y se añadieron 500 µL de tampón KH2PO4 50 mM pH 6,8 a cada muestra o patrón. Tras una agitación las muestras se centrifugaron 5 minutos a 13.000g y a +4ºC y justo después se tomaron 200 µL de sobrenadante y se añadieron 200 µL de tampón KH2PO4 50 mM pH 3,5 y se agitó. Por último se tomaron 200 µL y se colocaron en una placa transparente de poliestireno de absorción en el visible para realizar el análisis por CLAE.

Las condiciones cromatográficas fueron las siguientes: Flujo de 1,2 mL/min; detección mediante detector uv-vis a 532 nm; columna C-18 Spherisorb de 15 cm de longitud y 5 µm de diámetro de partícula.

El método cromatográfico que se utilizó fue el isocrático, por ello solo se necesitó programar el tiempo que estarían pasando cada una de las fases líquidas correspondientes. Cada cromatograma fue de 30 min de duración y la secuencia de las fases móviles a través del CLAE fueron las que se muestran en la Figura 18.

La programación de muestras supone repetir cada secuenciación anterior tantas veces como muestras y patrones se deseen analizar, de tal manera que para cada muestra se obtiene un cromatograma (Figura 19).

Figura 18. Programación de la duración (minutos) de las fases A y B durante un cromatograma del análisis de MDA.

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3.10. DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES PLASMÁTICOS DE