RADICALES LIBRES DEFINICIÓN Y FUENTES

El O2 apareció en la atmósfera terrestre hace aproximadamente 2.2 billones de años como producto de desecho de la fotosíntesis realizada por cianobacterias. Los primeros organismos que aparecieron en la tierra fueron seres anaerobios que habitaban en una atmósfera rica en N2 y CO2, pero conforme el O2 se fue acumulando hasta los niveles actuales (21%) parte de estos organismos murieron y otros se restringieron a microambientes anóxicos. Sin embargo, una parte de los organismos se adaptaron a esta nueva situación y desarrollaron una serie de defensas para protegerse del O2 dando lugar así a seres aerobios (Halliwell, 2006).

Estos nuevos seres aerobios comenzaron a aprovechar el oxígeno terrestre para generar energía en sus mitocondrias en forma de ATP mediante la cadena de

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transporte de electrones. Esta energía permitió la evolución de estos organismos a seres pluricelulares mucho más complejos (Lane, 2003).

El primer investigador que trató el tema de la toxicidad del O2 fue Rebeca Gerschman y Dan Gilbert en 1954. La toxicidad del oxígeno radica en su capacidad para generar radicales libres. Dos años más tarde, Harman D describió el papel que juegan los radicales libres en el envejecimiento (Gerschman et al., 1954; Harman, 1956).

Se define radical libre como toda molécula o fragmentos de moléculas que contienen uno o más electrones desapareados en su última capa de valencia, lo que le confiere cierto grado de reactividad. Son altamente inestables pero capaces de existir de manera independiente. El radical libre más simple es el radical de hidrógeno (H•_{), que contiene un protón y un electrón (Halliwell, 1993).}

El termino ROS hace referencia a todas las especies derivadas del O2 que son más reactivas que la molécula de O2 en sí misma. El término incluye por tanto, especies radicales (anión superóxido) y no radicales (H2O2). Así, todos los radicales libres de oxígeno son ROS pero no todos los ROS son especies radicales. Algunos autores han tratado de evadir esta confusión terminológica haciendo referencia a estas moléculas como especies derivadas de oxígeno o simplemente oxidantes. Sin embargo, la molécula de H2O es derivada del oxígeno, pero no más reactiva que ésta. Además, los ROS en ocasiones pueden actuar como reductores según las condiciones del ambiente en el que se encuentren. Es por todo esto que en la literatura se acepta ampliamente el término ROS para referirse a los radicales libres del oxígeno, incluyendo el H2O2 (Halliwell, 2015).

Otra clase de radicales libres son las especies reactivas de nitrógeno o RNS que, junto con los ROS juegan un papel muy importante en los sistemas biológicos.

La principal consecuencia de los radicales libres es el daño de biomoléculas, como lípidos, ADN y proteínas. Sin embargo, en ocasiones, pueden tener un papel beneficioso, aspecto que se detallará a lo largo de este apartado.

Cada radical presenta un potencial de oxidación diferente de acuerdo con su reactividad. Los más importantes se detallan a continuación.

51 - Anión superóxido

El anión superóxido (O2─) se genera tras la adición de un electrón a la molécula diatómica de oxígeno (Miller et al., 1990). Se considera como el radical libre de oxígeno primario, ya que es capaz de interaccionar con otras moléculas y dar lugar a radicales libres de oxígeno secundarios. Su producción ocurre principalmente en los complejos I y III de la mitocondria y es incapaz de atravesar membranas debido a su carga, por eso su daño se restringe al compartimento donde ha sido generado. Sin embargo, a través de una reacción de dismutación, el O2─ es rápidamente convertido en H2O2 que sí puede penetrar las membranas biológicas (Cross and Templeton, 2006). El O2─ no reacciona directamente con polipéptidos, azúcares o ácidos nucleicos pero sí puede interaccionar con otras moléculas generando otros radicales de forma directa o a través de procesos catalizados por enzimas o metales.

- Radical hidroxilo

El radical hidroxilo (─_{OH) tiene elevada reactividad y una vida media in vivo de} aproximadamente un nanosegundo, lo cual hace que reaccione con moléculas muy cercanas a su lugar de origen. Puede ser originado por la reacción de Fenton, al reaccionar el Fe2+ _{con el H2O2. Presenta una gran habilidad para iniciar la} peroxidación lipídica (Pinchuk et al., 1998) e interaccionar con las bases del ADN dañándolas o produciendo rotura en sus cadenas. Un ejemplo es la formación de la base modificada 8-hidroxi-desoxiguanosina (8-OHdG) que resulta de su interacción con la base guanina (Valko et al., 2006).

- Peróxido de hidrógeno

El peróxido de hidrógeno (H2O2) es capaz de atravesar membranas biológicas, lo que le confiere un importante papel en la señalización celular, por ejemplo, es capaz de activar factores de transcripción como el NFκβ (Packer and Cadenas, 2007). Su principal fuente de producción son los peroxisomas. Estos orgánulos mantienen muy finamente los niveles de H2O2, de manera que cuando existe una disminución de las enzimas encargadas de su descomposición (catalasa y peroxidasa), el H2O2 puede ser liberado al citoplasma, lo que contribuye a aumentar el estrés oxidativo celular (Valko et al., 2007) o puede convertirse en ─_{OH,que es mucho más reactivo.}

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- Óxido nítrico

El óxido nítrico (NO) es generado por el endotelio vascular y su función principal es vasodilatador (Anderson, 1996). Es altamente reactivo, ya que se oxida rápidamente en presencia de oxígeno convirtiéndose en dióxido de nitrógeno (NO2). Juega un papel importante en la señalización celular y está implicado en procesos de neutrotransmisión, regulación de la presión sanguínea, mecanismo de defensa, relajación muscular y regulación del sistema inmune. El NO es generado por la enzima óxido nítrico sintasa y tiene una vida media de unos pocos segundos en medio acuoso. Debido a su solubilidad tanto en medio acuoso como lipídico, el NO es capaz de difundir a través del citoplasma y la membrana plasmática (Anderson, 1996).

- Peroxinitrito

El peroxinitrito (ONOO─_{) es generado en procesos inflamatorios, a partir de la} reacción del anión superóxido y el óxido nítrico (Anderson, 1996). El metabolismo de ambos en la matriz mitocondrial está condicionado por la limitada difusión y rápida reacción entre ambos para producir ONOO. El ONOO─ _{es un poderoso} oxidante que apenas difunde desde el espacio intramitocondrial. Puede dañar la célula iniciando la peroxidación lipídica en la membrana o modificando proteínas en sus residuos tirosina (Keller et al., 1998).

- Radical peroxil

En los organismos, se forma el radical peroxil (ROO⦁_{) derivado de la adición de un} radical oxígeno a un lípido. Este radical es altamente reactivo, aunque depende de la naturaleza del grupo R. Lo más interesante de los radicales peroxil es la diversiad de reacciones biológicas en las que pueden participar como, por ejemplo, en roturas del ADN y en modificaciones estructurales de proteínas. Asimismo, los radicales peroxil aumentan, de forma sinérgica, la inducción de daño en el ADN por O2─.

A nivel metodológico, la cuantificación exacta de los diferentes oxidantes es difícil porque presentan una vida media muy corta y rápidamente reaccionan con otros compuestos formando nuevas moléculas.

53 El origen de los radicales libres es muy diverso. Pueden ser generados en el interior de la célula por las denominadas fuentes endógenas, o tener su origen en fuentes exógenas.

Entre las fuentes exógenas destacan muchos agentes ambientales, entre ellas destaca la exposición a la radiación UV, el tabaquismo o la ingesta de dietas ricas en grasas (Sies et al., 2005). Determinados xenobióticos, como compuestos clorados, metales iónicos o fármacos como los barbitúricos, también son capaces de inducir radicales libres en la célula (Valko et al., 2006). Un ejemplo sería el compuesto 2- butoxietanol, el cual es capaz de provocar cáncer en ratones mediante su generación indirecta de radicales libres (Wallace, 1997).

Aunque la exposición del organismo a los ROS de fuentes exógenas es elevada, la exposición a las fuentes endógenas es más importante y amplia. La generación de radicales libres en el organismo es un proceso continuo y dura toda la vida de la célula o del organismo. Diversos procesos celulares son causantes de la generación de radicales libres, entre ellos destacan procesos como la explosión o estallido respiratorio. Este proceso comienza con el reconocimiento por parte de diversas células del sistema inmune de un agente externo. Estas células producen una rápida liberación de ROS, como H2O2 y O2─ por parte de la enzima NADPH oxidasa, que tienen por objetivo la destrucción del agente externo (Dahlgren and Karlsson, 1999). Además, diferentes procesos metabólicos como el sistema enzimático del citocromo P450 también son responsables de la generación de ROS, generalmente debido al consumo de NADPH (Zangar et al., 2004).

Sin embargo, la principal fuente endógena de radicales libres es la mitocondria. La cadena de transporte de electrones está situada en la membrana interna mitocondrial, es la principal fuente de ATP en la célula, y por tanto, esencial para la vida. El NADPH producido en diferentes procesos celulares como la glucolisis, oxidación de ácidos grasos y el ciclo de Krebs cede sus electrones a la cadena de transporte, transformándose así de NADPH en NADP+. El NADPH actuaría así como primer dador de electrones, los cuales van avanzando por la cadena por medio de reacciones de oxidación reducción entre donantes y aceptores de electrones, pasando sucesivamente por los complejos de NADH deshidrogenasa, succinato deshidrogenasa, citocromo bc1 y citocromo c. Esta energía es utilizada para

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bombear protones a través de la membrana interna mitocondrial, lo que genera un gradiente electroquímico, que en última instancia será utilizado por la ATP sintetasa para dar lugar a ATP a partir de ADP y Pi (fosfato inorgánico). En el complejo citocromo c, el oxígeno molecular capta 4 electrones provenientes de la cadena de transporte y 8 iones de H, generando así dos moléculas de H2O (Halliwell, 1993) (Figura 6). La mayor parte del oxígeno que se consume es transformado en agua, pero el 1-3% restante da lugar a especies reactivas de oxígeno, en especial a O2─, implicado en la fisiopatología de diversas enfermedades (Kovacic and Jacintho, 2001; Valko et al., 2001). El O2─ es generado por los complejos I y II de la cadena de transporte, pero debido a su carga no es capaz de atravesar las membranas, y es en el espacio intermembrana o bien en la matriz mitocondrial, donde es transformado en H2O2 por parte de la enzima superóxido dismutasa (SOD).

Figura 6. Cadena de transporte de electrones mitocondrial. (David W. Ball, 2011)