purificado y las fracciones constituyentes y actividad óptica por polarimetría.
El peso molecular del extracto alcalino y sus fracciones constituyentes obtenidas por hidrólisis parcial se determinaron mediante el análisis del extremo terminal reductor. Para esto se utilizó como patrón de calibración ácido D-glucurónico. La curva de calibración se construyó en el rango de concentración de 0 a 100 μg/mL en un volumen de 0,5 mL. A cada solución se incorporaron 0,5 mL de una solución de ferricianuro de potasio 0,05% p/v y 0,5 mL de una solución de cianuro de potasio 0,06% p/v preparada en carbonato de sodio 0,53%. Los tubos de reacción cerrados se calentaron en un baño termostatizado a 100 ºC por 20 minutos. Posteriormente, los tubos se dejaron enfriar y se adicionaron 2,5 mL de una solución de ferrisulfato de amonio 0,15% p/v. Luego de 15 minutos se midió la absorbancia a 690 nm. Para los análisis de los polisacáridos obtenidos se prepararon soluciones de concentración de 2 mg/mL y se trataron de igual forma que las muestras utilizadas para la construcción de la curva de calibración. De esta forma el peso molecular en promedio en número se calculó mediante la ecuación 8.
mol
g
x
C
C
M
n o198
]
[
]
[
Donde [C0] corresponde a la concentración de la solución preparada (2 mg/mL) y [C] es la concentración obtenida de la curva de calibración para las distintas fracciones medidas a 690 nm, bajo las mismas condiciones experimentales. El factor de corrección 198 corresponde al peso molecular de la unidad repetitiva del ácido urónico 129.
La rotación de la luz polarizada se determinó mediante polarimetría en un equipo Perkin-Elmer 241 (Waltham, Massachusetts, EUA) empleando la línea D del sodio a 25 °C. La rotación especifica se determinó mediante la ecuación 9
[𝛼]
𝐷𝑇=
∝𝑀−𝛼𝑆𝐶∗𝑙
∗ 100
Donde αM corresponde al ángulo de rotación de la muestra, αS es el ángulo de rotación del solvente, C es la concentración en g en 100 mL y L es el camino óptico de la cubeta.
4.24.- Síntesis del glicoconjugado poliguluronato de sodio con NH2-β-CD.
La conjugación de poliguluronato de sodio (F3) con mono-6-amino-β-CD se realizó a través de la formación de un enlace amida entre el grupo amino de la mono-6-amino-6-desoxi-β-CD y el grupo carboxilato del homopolímero en presencia de N-hidroxisuccinimida y 1-etil-(3-3-
(ecuación 8)
33
dimetilaminopropil) carbodiimida, según la metodología de Han 130, 131. La fracción 3, obtenida en el fraccionamiento del extracto alcalino y NH2-CD se disolvieron en agua destilada a temperatura ambiente y se agregaron carbodiimida EDC y succinimida NHS. Se utilizó una relación en peso de 1:1 entre F3 y NH2-CD y una relación molar de 2:2:1 entre F3:EDC:NHS con referencia a los grupos carboxilatos presentes en F3. El pH se controló a valor 3,8-4,0 utilizando HCl 0,1 M. La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 12 h con agitación constante y posteriormente, se trató con una solución de THF-hexano (4:1). La fase acuosa se concentró al vacío, se dializó durante 48 h contra agua destilada y se secó por liofilización. El producto obtenido se caracterizó por IR-TF y RMN 1H y 13C.
4.25.- Determinación de las capacidades de hinchado y efecto de estímulos de pH y temperatura de hidrogeles supramoleculares de poliguluronato de sodio con NH2-β-CD.
Los hidrogeles se generaron por adición del glicoconjugado sobre una solución de cloruro de calcio al 0,1 M, manteniendo el hidrogel supramolecular en la solución durante 2 horas y luego, se secaron en estufa a 40 ºC hasta sequedad. Los hidrogeles secos se adicionaron sobre una solución de tampón fosfato pH 7,0/DMSO en una relación 80/20 y se determinó el incremento de la masa del gel en función del tiempo, eliminando el agua adsorbida mediante el uso de papel filtro previo a cada medición. El seguimiento de las capacidades de hinchado se llevó a cabo durante 72 horas a temperatura ambiente. Las capacidades de hinchado se midieron mediante el método gravimétrico de acuerdo con la ecuación 10.
(ecuación 10)
donde WH corresponde a la masa del hidrogel hinchado y Ws a la masa del hidrogel seco 60 Para la determinación del efecto de pH y temperatura se repitieron los experimentos de determinación de las capacidades de hinchado, pero esta vez los estudios se realizaron en tres medios distintos que emularon zonas distintas del tracto gastrointestinal. El primer medio emuló el estómago en condiciones de vaciado gástrico y para ello se ajustó el pH de agua destilada con ácido clorhídrico llevándolo a un valor de 1,5. En este medio los geles se mantuvieron por 2 horas, lo que constituye el tiempo de residencia promedio de los alimentos en el estómago. El segundo y tercer medio preparados emularon las zonas relativas al intestino delgado, duodeno, yeyuno e íleon. Estos medios se ajustaron con bicarbonato y carbonato de sodio a pH 6,5 y 8,0, respectivamente, considerando que la basicidad de los jugos biliares tiene una concentración máxima de 0,2 M de carbonato de sodio que le otorgan la basicidad. En estos medios los hidrogeles se mantuvieron por 2,0 y 2,5 horas, respectivamente. En cada medio se determinaron
I. H. =WH− WS WS
34
las capacidades de hinchado de los hidrogeles en estudio a temperatura ambiente en una incubadora Memmert.
4.26.- Estudios de liberación controlada
Sobre una disolución del glicoconjugado se adicionó una solución de las amido cumarinas sustituida seleccionadas en DMSO (concentración final 6 mM). La mezcla se mantuvo en agitación constante a temperatura de 37 °C durante 24 horas. Luego, los hidrogeles se prepararon tal como se describió en el punto 4.25.
Los hidrogeles se sumergieron en una mezcla agua/DMSO en una relación 80/20 a los medios de pH controlados descritos en la sección 4.26 y se tomaron alícuotas de 1 mL a distintos tiempos durante las 72 horas de estudio sin control de pH y 6,5 horas con control de pH. Las alícuotas obtenidas se analizaron mediante espectroscopía UV. Para la determinación de la concentración se llevó a cabo la preparación de curvas de calibrado de las amido cumarinas sustituidas. Se determinó el porcentaje de liberación de ACS mediante la ecuación 1187.
% 𝐶𝐴𝑆. 𝐿𝑖𝑏. = [𝐶𝐴𝑆]𝐿
[𝐶𝐴𝑆]𝑇𝑥100
donde [ACS]L y [ACS]T son las concentraciones liberada y totales de amido cumarina sustituida en los hidrogeles supramoleculares, respectivamente.
4.27.- Aplicación del modelo matemático semi-empírico de Peppas-Korsmeyer.
Se realizó la aplicación del modelo difusional de Peppas-Korsmeyer 132 a los datos obtenidos de los procesos de hinchado y de liberación de ACS. Mediante el análisis monoexponencial de los datos se determinó la constante k y el coeficiente cinético n (ecuación 12).
𝑀𝑡
𝑀∞
= 𝑘𝑡
𝑛 (ecuación 12)
donde t es el tiempo de hinchado o liberación, Mt es la cantidad de solvente absorbido o de fármaco liberado en el tiempo t, M∞ es la cantidad total de agua absorbida o de fármaco liberado, k es una constante cinética que depende de las características estructurales del hidrogel obtenidas durante la preparación del mismo y n es el exponente difusional.