La formación de complejos de inclusión amido cumarinas sustituidas con mono-6-amino-6- desoxi-β-ciclodextrina permite mejorar los aspectos biológicos de las ACS en relación la actividad tripanocida. Asimismo, la encapsulación de las ACS en hidrogeles supramoleculares preparados a partir de bloques homopoliméricos de ácido algínico conjugado con mono-6-amino-6-desoxi-β- ciclodextrina, permite la liberación controlada de los biocompuestos.
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3.- Objetivos.Objetivo general.
• Estudiar la relación estructura-actividad y formación de complejos de inclusión de amido cumarinas sustituidas (ACS), en cuanto a su actividad tripanocida y evaluar la liberación de ACS encapsuladas en hidrogeles supramoleculares.
Objetivos específicos.
• Caracterizar el mecanismo de oxidación y la capacidad antioxidante de las amido cumarinas sustituidas (ACS).
• Determinar los parámetros de inclusión de los complejos formados con mono-6-amino-6- desoxi-β-CD de las ACS y la difusión pasiva en membrana paralela artificial.
• Determinar la actividad citotóxica de ACS y complejos de inclusión frente a las formas epimastigote y tripomastigote del parásito de Trypanosoma cruzi Dm28c y células murinas RAW 264.7 y estudiar los posibles mecanismos tripanocida asociados a estrés oxidativo.
• Obtener y caracterizar las fracciones homo- y heteropoliméricas del alginato de sodio del alga parda Durvillaea antarctica y conjugar el bloque homopolimérico GG con 6-NH2-β- CD.
• Preparar hidrogeles supramoleculares a partir del glicoconjugado de bloques homopoliméricos y estudiar la encapsulación y liberación de las ACS en los hidrogeles supramoleculares en función a la temperatura y pH.
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4.- Metodología.4.1.- Materiales y equipos.
Las cumarinas utilizadas en este trabajo se sintetizaron y caracterizaron en el grupo del Dr. Eugenio Uriarte Villares de la Universidad de Santiago de Compostela, España102. Esta serie contiene el grupo amida en la posición 3 u 8 de la estructura básica de la cumarina con diferentes sustituyentes y grupo hidroxilo en la posición 4 ó 7 (Figura 14).
Figura 14.- Estructura de amido cumarinas sustituidas (ACS) en estudio: A) serie de 3-amido cumarinas y
B) serie de 8-amido cumarinas.
Los cultivos celulares de Trypanosoma cruzi en los estadíos tripomastigote y epimastigote y células de mamífero tipo macrófagos RAW 264.7, se obtuvieron en el Programa de Farmacología Molecular y Clínica del Instituto de Ciencias Biomédicas (ICBM) de la Universidad de Chile.
Se utilizaron dos muestras físicamente diferentes del alga parda Durvillaea antarctica (Durvillaceae, Phaeophyceae, Ochrophyta) colectadas en las zonas de Bahía El Aguila, Punta Arenas, Región de Magallanes (53° 28’ S, 70° 47’ O) y Seno Otway, San Isidro, Región de Magallanes (52° 53’ S, 71° 07’ O), identificadas por el Dr. Andrés Mansilla, Departamento de Ciencias y Recursos Naturales de la Universidad de Magallanes, Punta Arenas.
Los reactivos dihidrocloruro de 2,2′-azobis(2-amidinopropano) (ABAP), piridina anhidra (py), perclorato de tetrabutilamonio (PTBA), bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)- 2,5-difenil-2H- tetrazolio (MTT), éster metílico de tetrametilrodamina (TMRE), nifurtimox (NFX), fluoresceína (Fl), diacetato de 2’,7’-dihidrodiclorofluoresceína (H2DCF-DA), 5,5-dimetil-1-pirrolina-N-óxido (DMPO), dimetilformamida (DMF), ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxilico (trolox), nitrito de
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sodio (NaN3), n-dodecano (C12H26), 1,1,2,2-tetracloroetano (C2H2Cl4), fosfato dibásico de sodio (Na2HPO4), fosfato monobásico de sodio (NaH2PO4),clorhidrato de 1-etil-(3-3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), dimetil sulfóxido ((CH3)2SO), peróxido de hidrógeno 30% (H2O2), ferricianuro de potasio (K3[Fe(CN)6]), cloruro de potasio (KCl), cianuro de potasio (KCN), ferrisulfato de amonio (FeNH4SO4), dodecilsulfato de sodio (SDS), fosfato diácido de potasio (KH2PO4)
y fosfatidilcolina, se adquirieron en Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA). Cloruro de sodio
(NaCl), cloruro de calcio (CaCl2), carbonato de sodio (Na2CO3), carbonato ácido de sodio (NaHCO3), ácido clorhídrico fumante 37% (HCl), acetona técnica e hidróxido de sodio (NaOH) se adquirieron en HES Ltda. (Santiago, Chile). β-ciclodextrina (β-CD), cloruro de p-toluensulfonilo (p-Ts), trifenilfosfina (PPh3) y N-hidroxisuccinimida (NHS) se adquirieron en AK Scientific Inc. (Palo Alto, CA, EUA).
En el desarrollo del trabajo experimental se utilizó un oxígrafo con electrodo tipo Clark Yellow Springs Instrument, Yellow Spring, (Ohio, EUA), un espectrofotómetro de placa BioTek modelo Synergy HT (Vermont, EUA), espectrofotómetro de placa PerkinElmer EnSpire (Shelton, CT, EUA) y una campana de flujo laminar. Las centrifugaciones se realizaron usando centrifugas Kubota modelo KS-3000P (Tokio, Japón), Hettich modelo Universal 32 (Tuttlingen, Alemania) y una microcentrifuga Heraeus modelo Biofuge 13 (Buckinghamshire, Inglaterra). Se emplearon un evaporador rotatorio Büchi modelo R-110 (Glatthalde, Suiza), un pH-metro Hanna modelo pH-21 (Hanna Instruments, Woonsoket, RI, EUA), incubadora Memmert BE 500 (Frankfurt, Alemania) y un liofilizador Christ Alpha 1-2 (Osterode am Harz, Alemania).
4.2.- Caracterización espectroscópica.
Los extractos purificados y productos sintetizados se caracterizaron por espectroscopía de IR- TF en pastillas de KBr, en un espectrofotómetro Bruker modelo IFS 66ν (Billerica, MA, EUA). La caracterización por espectroscopía de RMN 1H y 13C mono y bidimensional se efectuó en un equipo Bruker Advance 400 (Billerica, MA, EUA), equipado con una sonda inversa de banda ancha de 5 mm de diámetro de gradiente z, operando a una frecuencia de trabajo de 400,13 MHz (1H) y 100,62 MHz (13C). Las muestras de polisacárido se prepararon realizando previamente tres intercambios isotópicos con agua deuterada (99% D2O) y se utilizó como patrón interno la sal de sodio del ácido 3-(trimetilsilil)-1-propiónico-2,2,3,3-d4 (0,75 %) (TMSP-D4). Los espectros de los productos sintetizados a partir de β-CD se registraron en dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6). Los espectros de resonancia de espín electrónico (REE) se registraron en la banda X (9,7 GHz) usando un espectrómetro ECS 106 (Bruker, Coventry, RU) con una cavidad rectangular y modulación de campo de 50 kHz, equipado con un resonador de alta sensibilidad a temperatura
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ambiente. Los espectros se registraron a una frecuencia de microondas 9,81 GHz, potencia de microondas 20 mW, amplitud de modulación 0,91 G, ganancia del receptor 59 db, constante de tiempo 81.92 ms y un tiempo de conversión de 40,96 ms.
4.3.- Caracterización electroquímica de amido cumarinas sustituidas por voltamperometría.
Se estudió el comportamiento anódico de las amido cumarinas sustituidas (ACS) mediante voltamperometría cíclica (VC) y voltamperometría de pulso diferencial (VPD). El estudio por VC de los compuestos se realizó en DMF, se utilizó como electrolito de soporte perclorato de tetrabutilamonio (PTBA), en un potenciostato Metrohm 797 VA con un convertidor 797 VA Stand y un procesador 797 VA. Se trabajó a concentraciones de muestra de 1 mM y de 0,1 M de electrolito de soporte. Los barridos se efectuaron a velocidades entre 50 y 2500 mV/s en todo el rango de potencial permitido por el electrodo de trabajo (carbón vítreo). Además, se utilizó un electrodo auxiliar de platino y como electrodo de referencia Ag/AgCl (KCl 3 M). El electrodo de trabajo se pulió antes de cada medición con alúmina al agua de 0,3 y 0,05 μm, y luego se lavó con abundante agua.
El método de voltamperometría de pulso diferencial (VDP) se llevó a cabo bajo las mismas condiciones anteriormente descritas, con barridos de potencial entre 0,0 - 1,7 V y una velocidad de barrido de 20 mV/s., empleando una amplitud del pulso de 50 mV durante 0,5 s y una altura del paso de 4 mV.
4.4.- Caracterización de especies radicalarias generadas por oxidación electroquímica.
Los radicales se generaron mediante un proceso de oxidación electrolítica in situ en las mismas condiciones experimentales que las de VC y VDP, cada espectro se obtuvo después de 100 barridos. Los radicales generados se atraparon mediante la adición de 50 µL de una solución 200 mM de N-tert-butil-α-fenilnitrona (PBN)103. Los espectros REE se simularon usando el programa EPR-WinSIM Versión 0.98 104.
4.5.- Determinación de la capacidad de absorción de radicales oxígenos (ORAC-FL).
Los análisis ORAC-FL se llevaron a cabo en un lector de placas EnSpire multimodo de Perkin- Elmer, utilizando placas de 96 pocillos de poliestireno blanco Nunc (Copenhague, Dinamarca). La fluorescencia se leyó desde la parte superior, con una longitud de onda de excitación de 485
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nm y una emisión de 528 nm. La reacción se llevó a cabo en tampón de fosfato 75 mM (pH 7,4). Se adicionaron 150 µL de solución de FL (40 nM, concentración final) y 25 µL de ACS en metanol (intervalo de concentración entre 0,3 μM a 2 μM) en cada pocillo de la placa. La mezcla se incubó durante 15 minutos a 37 ºC, luego se añadieron 25 µL de una solución de dihidrocloruro de 2,2'- azo-bis (2-metilpropionamidina) (ABAP) (18 mM, concentración final). La fluorescencia se registró cada 1 minuto durante 180 min y se utilizó como control FL y ABAP usando metanol en lugar de la solución antioxidante en cada ensayo18, 105.
Se preparó una curva de calibrado de trolox (0,5 μM a 2,5 μM) como antioxidante de referencia. La capacidad de inhibición se expresó como valores de ORAC-FL. Todas las mezclas de reacción se prepararon por triplicado y se realizaron al menos tres ensayos independientes para cada muestra. El área bajo la curva de decaimiento de fluorescencia (ABC) se calculó integrando la disminución de la fluorescencia. El procesamiento de datos se realizó con el programa Origin Pro 8.5 SR2 (Origin Lab Corporation,
W
ashington, EUA). Los índices ORAC-FL se calcularon de acuerdo con la ecuación (1):𝑂𝑅𝐴𝐶 − 𝐹𝐿 = (𝐴𝐵𝐶𝐶𝐴𝑆−𝐴𝐵𝐶𝐶𝑂𝑁𝑇𝑅𝑂𝐿) (𝐴𝐵𝐶𝑇𝑅𝑂𝐿𝑂𝑋−𝐴𝐵𝐶𝐶𝑂𝑁𝑇𝑅𝑂𝐿)×
[𝑇𝑅𝑂𝐿𝑂𝑋]
[𝐶𝐴𝑆] (ecuación 1)
Donde: ABCACS=área bajo la curva en presencia de ACS
ABCCONTROL=área bajo la curva del control
[TROLOX]=concentración de trolox, [ACS]=concentración de cumarina amido sustituida
4.6.- Reactividad frente al radical hidroxilo.
La actividad de eliminación del radical hidroxilo de cada derivado se estimó utilizando la técnica de atrapamiento de espín por REE. La generación del radical se realizó a través de la reacción de Fenton no catalítica y se utilizó 5,5-dimetil-1-pirrolina-N-óxido (DMPO) como atrapador de espín 106.
Los resultados se obtuvieron comparando la disminución de la intensidad de las señales de aducto de espín DMPO-OH en el espectro de REE por presencia del compuesto antioxidante en relación con el control y se expresaron como porcentaje de eliminación de radical hidroxilo.
En un tubo se mezclaron 100 μL de DMF y 50 μL de NaOH (25 mM), luego se adicionaron 50 μL de DMPO (30 mM de concentración final) y 50 μL ACS (20 mM en DMF). Finalmente, se agregó 50 μL de peróxido de hidrógeno (30%). La mezcla se agito y se puso en la celda REE, los espectros de REE se registraron luego de cinco minutos de adicionado el peróxido de hidrógeno.