UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE
FACULTAD DE QUÍMICA Y BIOLOGÍA
Departamento de Ciencias del Ambiente
SÍNTESIS Y EVALUACIÓN BIOLÓGICA DE CUMARINAS CON ACTIVIDAD
TRIPANOCIDA POTENCIAL EN COMPLEJOS DE INCLUSIÓN E
HIDROGELES SUPRAMOLECULARES.
MAURICIO JAVIER MONCADA BASUALTO
Profesores guías: Betty Matsuhiro Yamamoto
Claudio Olea Azar
Trabajo de graduación presentado en conformidad a los requisitos para obtener el Grado Académico de Doctor en Química.
Santiago - Chile
© MAURICIO JAVIER MONCADA BASUALTO, 2018
Algunos derechos de autor reservados. Esta obra está bajo la Licencia de Creative Commons. Atribución No Comercial-Chile
SÍNTESIS Y EVALUACIÓN BIOLÓGICA DE CUMARINAS CON
ACTIVIDAD TRIPANOCIDA POTENCIAL EN COMPLEJOS DE
INCLUSIÓN E HIDROGELES SUPRAMOLECULARES
MAURICIO JAVIER MONCADA BASUALTO
Este trabajo fue elaborado bajo la supervisión de la Dra. Betty Matsuhiro de la Facultad de Química y Biología, de la Universidad de Santiago de Chile y el Dr. Claudio Olea de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, de la Universidad de Chile aprobado por la comisión de seguimiento.
____________________________ Dr. Betty Matsuhiro Yamamoto
Profesor Guía
____________________________
Dr. Claudio Olea Azar
Profesor Guía
________________________ _________________________
Dr. Alexis Aspée Lamas Dra. Margarita Aliaga Miranda Profesor comisión Profesor comisión_________________________ __________________________
Dr. Juan Pablo García-Huidobro Dra. Brenda Modak Canobra Profesor comisión Profesor comisión_______________________________
Dr. Bernardo Morales Muñoz Vicedecano de Investigación y Postgrado
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RESUMEN
La enfermedad de Chagas es una patología causada por el parásito protozoario Trypanosoma cruzi y afecta aproximadamente a 7 millones de personas en todo el mundo. Los fármacos disponibles nifurtimox (NFX) y benznidazol (BNZ) presentan baja eficacia y efectos adversos. Con el objetivo de encontrar agentes tripanocidas nuevos, se estudió una serie de amidocumarinas sustituidas (ACS) con o sin sustituyentes hidroxilo en posición 4 y 8. Se investigó el posible mecanismo de oxidación y acción tripanocida a través de Resonancia de Espín Electrónico (REE) y el aumento de la actividad por formación de complejos de inclusión de las ACS más activas con mono 6-amino-6-desoxi-β-ciclodextrina (6-amino-β-CD). Además, se evaluó el efecto de los complejos de inclusión en la difusión pasiva de las ACS en membrana artificial (PAMPA) y variaciones de potencial de membrana mitocondrial (Δ
Ψm
) del parásito.
Por otra parte, se prepararon hidrogeles supramoleculares a partir de homopoli-L -guluronato de sodio del alga Durvillaea antarctica conjugado con 6-amino-β-CD, mediante gelificación con ion calcio. Se investigó la liberación controlada de las ACS, las propiedades de hinchado y sensibilidad frente a pH del tracto gastrointestinal.
Se encontró que las ACS estudiadas mostraron un mecanismo de oxidación irreversible que implica la formación de especies radicalarias. También, presentaron actividad citotóxica moderada en células RAW 264.7 y alta actividad tripanocida contra las formas epimastigote y tripomastigote de T. cruzi, cuyo mecanismo de acción implica la formación de especies radicalarias y disfunción mitocondrial. La formación de complejos de inclusión aumentó casi en un 10% la actividad sobre el parásito de T. cruzi y la difusión pasiva en membrana artificial en relación con las ACS libres.
La formación de hidrogeles supramoleculares permitió la liberación controlada de las ACS frente a estímulos de pH. La menor liberación de los ACS ocurrió a pH 1,2, permitiendo la protección del compuesto bioactivo. La liberación máxima de ACS fue de 34% a pH 8, atribuible a la erosión de matriz polimérica.
Palabras claves: 3-amidocumarinas, complejos de inclusión, actividad anti T. cruzi, alginato de sodio, hidrogel supramolecular, homopoli-L-gulironato.
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ABSTRACT
Chagas disease is a pathology caused by the protozoan parasite Trypanosoma cruzi and affects approximately 7 million people worldwide. The available drugs nifurtimox (NFX) and benznidazole (BNZ) have low efficacy and adverse effects. To find new trypanocidal agents, it was studied a series of substituted amidocumarins (ACS) with or without hydroxyl substituents in position 4 and 8. The possible mechanism of oxidation and trypanocidal action were investigated through Electronic Spin Resonance (REE) and the increase in activity by formation of inclusion complexes of the most active ACS with mono 6-amino-6-deoxy-β-cyclodextrin (6-amino-β-CD). In addition, the effect of inclusion complexes on the passive diffusion of artificial membrane ACS (PAMPA) and mitochondrial membrane potential (ΔΨm) variations of the parasite were evaluated.
On the other hand, supramolecular hydrogels were prepared from homopoly-L-sodium guluronate of Durvillaea antarctica algae conjugated with 6-amino-β-CD, by gelation with calcium ion. The controlled release of the ACS, the swelling properties and sensitivity to pH of the gastrointestinal tract were studied.
It was found that the ACS showed an irreversible oxidation mechanism that implies the formation of radical species. In addition, they presented moderate cytotoxic activity in RAW 264.7 cells and high trypanocidal activity against the epimastigote and trypomastigote forms of T. cruzi, whose mechanism of action involves the formation of radical species and mitochondrial dysfunction. The formation of inclusion complexes increased almost 10% the activity on the T. cruzi parasite and the passive diffusion in artificial membrane in relation to free ACS.
The formation of supramolecular hydrogels allowed the controlled release of the ACS against pH stimuli. Where, the lowest release of the ACS occurred at pH 1.2, allowing the protection of the bioactive compound. The maximum release of ACS was 34% at pH 8, attributable to polymer matrix erosion.
Keywords: 3-amidocumarins, inclusion complexes, anti-T. cruzi activity, sodium alginate, supramolecular hydrogel, homopoly-L-guluronate.
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AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer a mis tutores Betty Matsuhiro y Claudio Olea que a través de distintos estilos han podido guiarme en los aspectos académicos que implican esta tesis. Pero ellos llegaron aún más allá, me ensañaron de distintos aspectos de la vida que me han ayudado a sobrellevar retos que ha impuesto la misma. Agradezco enormemente la dedicación, cariño y confianza que me han entregado. Sin darme cuenta les tome un cariño único que espero pudieran sentir a lo largo de estos años. Mis más sinceros respetos a ambos son excelentes académicos, investigadores y por sobre todo increíbles personas.
Agradezco la participación de la comisión evaluadora quienes con sus intervenciones en amenas conversaciones han permitido que este trabajo culminase de manera adecuada, cumpliendo con las condiciones necesarias para la obtención del grado de Doctor.
Agradezco con profundo cariño a los profesores Eugenio Uriarte, Lourdes Santana y María Matos de la Universidad de Santiago de Compostela, quienes siempre han tenido una excelente disposición para trabajar en conjunto. Además, de hacer mi estancia en su laboratorio una grata experiencia. Asimismo, quiero agradecer al Dr. Juan Diego Maya y su grupo de investigación por ayudarme a desarrollar los estudios de actividad tripanocida. También, agradezco al Dr. Andrés Mansilla de la Universidad de Magallanes por identificar y proporcionar las muestras de algas utilizadas en este trabajo.
Quiero agradecer a mis amigas de generación de doctorado Paulina y Carla, por esas tardes de risas, estudio y terapia; siempre con su infaltable café. Hemos pasado por todo y aun así estamos de pie para seguir en ese camino. ¡Gracias eternas por siempre estar ahí!
Agradezco a M. Carolina por su confianza y preocupación constante y a los chicos del grupo de radicales libres y antioxidantes: Gaby, Manuel, Karina PC, Naty, Andreita, Carolina S., Benja, Michel, Pancho Antártico., Alexis, Luis, Ale, Nía, Beita, J. C. con quienes compartimos almuerzos en conversaciones variadas, divertidas y generamos con algun@s una amistad que perdura de hace años. Agradezco por aguatar mi carácter y mi locura constante. También, mencionar todas esas personas que llegaron a trabajar por breves periodos al laboratorio que fueron muchísimos; fue muy grato el compartir con uds.
Agradezco al grupo de hidratos de carbono por esos almuerzos y cenas muy divertidas pese al poco tiempo que pude compartir con ustedes muchachos por la naturaleza de la investigación realizada, puede compartir muchas experiencias y puntos de vista diferentes. Especial cariño para Andrés y Fabián con quienes pude compartir mayor tiempo.
Quiero agradecer a mis amig@s (Semillitas del mal): Deborash, Yesi, Lore, Cristhy, Fabi y Carlitos; quienes siempre están presente, en todo momento y en todas mis conversaciones. Por
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esa capacidad única de reírnos pese a todo lo que pueda estar ocurriendo a nuestro alrededor. Siempre han sacado lo mejor de mí en estos casi 10 años de amistad y lo seguirán haciendo.Y los últimos serán los primeros, quiero agradecer a mi familia por soportar estos años en los que no puede compartir en eventos familiares, almuerzos y cenas en el 100 % por estar en actividades académicas. A mi mamá quien siempre me ha apoyado en todas las locuras me he querido desarrollar te adoro más de lo que sospechas.
Agradecimientos para la comisión nacional de investigación científica y tecnológica (CONICYT) por la beca de doctorado nacional y gastos operacionales. Sin su apoyo este trabajo no podría haber sido posible.
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TABLA DE CONTENIDOS
Página
1.- Introducción ... 1
1.1.- Las cumarinas. ... 1
1.2.- Actividades biológicas de las cumarinas ... 3
1.3.- Actividad antiparasitaria ... 5
1.4.- Tripanosomiasis americana ... 6
1.5.- Actividad tripanocida de cumarinas ... 7
1.6.- Complejos de inclusión con ciclodextrinas. ... 11
1.7.- Hidrogeles ... 14 2.- Hipótesis. ...19 3.- Objetivos...20 Objetivo general. ... 20 Objetivos específicos. ... 20 4.- Metodología. ...21 4.1.- Materiales y equipos. ... 21 4.2.- Caracterización espectroscópica. ... 22
4.3.- Caracterización electroquímica de amido cumarinas sustituidas por voltamperometría. 23 4.4.- Caracterización de especies radicalarias generadas por oxidación electroquímica. ... 23
4.5.- Determinación de la capacidad de absorción de radicales oxígenos (ORAC-FL). ... 23
4.6.- Reactividad frente al radical hidroxilo. ... 24
4.7.- Determinación de la actividad antioxidante celular (AAC). ... 25
4.8.- Determinación de permeabilidad paralela en membrana artificial (PAMPA). ... 25
4.9.- Síntesis de mono-6-amino-6-desoxi -β-ciclodextrina. ... 26
4.10.- Formación de complejos de inclusión. ... 27
4.11.- Determinación de la estequiometría de los complejos de inclusión. ... 27
4.12.- Determinación de la constante de asociación (KC) de los complejos de inclusión. ... 27
4.13.- Estudio termodinámico de los complejos de inclusión. ... 28
vi
4.15.- Estudio de la actividad en tripomastigotes Dm28c. ... 29
4.16.- Estudio de citotoxicidad en células de mamífero... 29
4.17.- Determinación del efecto en el consumo de oxígeno en T.cruzi ... 29
4.18.- Determinación del efecto sobre el potencial de membrana mitocondrial en epimastigotes Dm28c de T. cruzi. ... 30
4.19.- Análisis por IR-TF de las láminas de Durvillaea antarctica ... 30
4.20.- Extracción alcalina y purificación de los extractos del alga parda... 30
4.21.- Determinación de la relación ácido manurónico a ácido gulurónico (M/G) del extracto alcalino purificado. ... 31
4.22.- Fraccionamiento del extracto alcalino purificado mediante hidrólisis parcial. ... 31
4.23.- Determinación del peso molecular promedio numérico (Mn) del extracto alcalino purificado y las fracciones constituyentes y actividad óptica por polarimetría. ... 32
4.24.- Síntesis del glicoconjugado poliguluronato de sodio con NH2-β-CD. ... 32
4.25.- Determinación de las capacidades de hinchado y efecto de estímulos de pH y temperatura de hidrogeles supramoleculares de poliguluronato de sodio con NH2-β-CD. ... 33
4.26.- Estudios de liberación controlada ... 34
4.27.- Aplicación del modelo matemático semi-empírico de Peppas-Korsmeyer. ... 34
5.- Resultados y discusiones...35
5.1.- Caracterización electroquímica de amido cumarinas sustituidas (ACS). ... 35
5.2.- Caracterización de las especies radicalarias generadas, a través de espectroscopía de Resonancia de Espín Electrónico (REE). ... 41
5.3.- Determinación de la capacidad antioxidante de ACS. ... 46
5.4.- Actividad citotóxica y tripanocida de amido cumarinas sustituidas (ACS) frente a macrófagos RAW 264.7 y la forma tripomastigote y epimastigote de T. cruzi Dm28c. .. 50
5.5.- Determinación de especies radicalarias en medio parasitario por REE. ... 54
5.6.- Determinación de efecto sobre el consumo de oxígeno y potencial de membrana mitocondrial en epimastigotes de T. cruzi, por ACS. ... 57
5.7.- Determinación de permeabilidad paralela en membrana artificial (PAMPA). ... 59
vii
5.9.- Formación de complejos de inclusión y determinación de estequiometría de loscomplejos de inclusión. ... 61
5.10.- Determinación de la constante de asociación de los complejos de inclusión y parámetros termodinámicos de asociación... 62
5.11.- Actividad tripanocida y citotoxicidad de los complejos de inclusión de ACS. ... 66
5.12.- Tratamiento preliminar, extracción y purificación de alginato de sodio del alga parda Durvillaea antarctica ... 68
5.13.- Fraccionamiento de alginato de sodio del alga parda Durvillaea antarctica. ... 73
5.14.- Síntesis de glicoconjugado de homopoligulopiranuronato de sodio y mono-6-amino-6-desoxi-β-ciclodextrina. ... 79
5.15.- Preparación de hidrogeles supramoleculares de amido cumarinas sustituidas. ... 81
5.16.- Liberación de amido cumarinas sustituidas de hidrogeles supramoleculares. ... 83
5.17.- Discusión general ... 86
6.- Conclusiones ...88
Glosario ...89
Bibliografía ...91
viii
ÍNDICE DE TABLAS
Página
1.- Introducción ... 1
Tabla 1: Actividad tripanocida y capacidad antioxidante de derivados de 3- amido/carbamatocumarina 22. ... 9
Tabla 2: Actividad tripanocida e índice de selectividad de derivados de 3-carboxamido cumarinas
41. ... 10
Tabla 3: Potenciales de oxidación de amido cumarinas sustituidas determinado por voltametría de pulso diferencial. ... 40 Tabla 4: Constantes de acoplamiento hiperfino para los espectros de REE. ... 43 Tabla 5: Resultados obtenidos en ensayos de capacidad antioxidante de ACS. ... 50 Tabla 6: Porcentaje de viabilidad de tripomastigotes a 100 y 10 µM de ACS y valor de IC50 sobre
células murinas. ... 52 Tabla 7: IC50 de ACS sobre epimastigotes, tripomastigotes y células murinas e índice de
selectividad. ... 54 Tabla 8: Absortividad molar, porcentaje de asociación a membrana artificial y porcentaje de difusión en membrana. ... 59 Tabla 9: Constante de asociación de amido cumarinas sustituidas con 6-desoxi-6-amino-β-ciclodextrina determinada a 37°C. ... 63 Tabla 10: Constantes de asociación a diferentes temperaturas y parámetros termodinámicos de los complejos de inclusión de ACS en mono-6-amino-6-desoxi-β-ciclodextrina. ... 65 Tabla 11: Porcentaje de viabilidad de células murinas (RAW 264.7) y parásitos de T. cruzi Dm28c en la forma epimastigote por efecto de los complejos de inclusión... 66 Tabla 12: Porcentaje de asociación y difusión en membrana artificial. ... 67 Tabla 13: Rendimientos obtenidos de la fracción lipídica con n-hexano, del extracto de carbonato de sodio al 3% y del extracto purificado. ... 70 Tabla 14: Asignación de señales características de los espectros de IR-TF y segunda derivada del alga y el extracto alcalino purificado de Durvillaea antarctica. ... 71 Tabla 15: Bandas características de los espectros de IR-TF y segunda derivada de las fracciones obtenidas mediante hidrólisis ácida parcial de los extractos alcalinos. ... 75 Tabla 16: Porcentaje en masa de las fracciones obtenidas por hidrólisis parcial del extracto alcalino y peso molecular promedio. ... 76 Tabla 17: Asignación de las señales correspondientes a los espectros de RMN 1H y 13C de las
fracciones 2 y 3 obtenidas por hidrólisis parcial del alginato de sodio del alga Durvillaea antarctica. ... 79 Tabla 18: Porcentaje de liberación de ACS a pH y temperatura controlada de hidrogeles supramoleculares ... 84
ix
Tabla 19: Parámetros del modelo difusional de Peppas-Korsmeyer determinados para el proceso de hinchado y liberación de ACS seleccionadas de hidrogeles supramoleculares... 85x
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
1.- Introducción ... 1
Figura 1.- Estructura básica de cumarina y clasificación de cumarinas. ... 1 Figura 2.- Esquema general de la biosíntesis de la cumarina. ... 2 Figura 3.- Cumarinas naturales (dicumarol, clorobiocina y novobiocina) y sintética (warfarina) biológicamente activas. ... 3 Figura 4.- Derivados sintetizados de 3-fenilcumarinas con capacidad antioxidante. ... 4 Figura 5.- Hidroxicumarinas sintéticas con capacidad antioxidante, diseñadas para disminuir la apoptosis celular inducida por especies reactivas. ... 5 Figura 6.- Ciclo de vida del parásito Trypanosoma cruzi. ... 7 Figura 7.- Derivados sintetizados de 4-hidroxicumarina con actividad sobre el parásito de T. cruzi. ... 8 Figura 8.- Estructura de derivados sintetizados de 3-amido/carbamatocumarina con actividad tripanocida. ... 9 Figura 9.- Derivados sintetizados de 3-carboxamidocumarinas con actividad tripanocida. ... 10 Figura 10.- Estructura de amido cumarinas sustituidas (ACS) a evaluar. ... 11 Figura 11.- Representación esquemática de α, β y γ -ciclodextrina (izquierda a derecha) y la representación esquemática del aspecto de cono truncado de ciclodextrina. ... 12 Figura 12.- A) Estructuras químicas de las fracciones homopoliméricas y heteropoliméricas del ácido algínico. B) Modelo de gelación del bloque homopolimérico GG con ion Ca2+. ... 16
Figura 13.- Representación esquemática de la liberación de compuestos (ovalos amarillos) de polímero entrecruzado (líneas azules) conjugado con CDs (conos verdes). ... 17 Figura 14.- Estructura de amido cumarinas sustituidas (ACS) en estudio: A) serie de 3-amido cumarinas y B) serie de 8-amido cumarinas. ... 21 Figura 15.- Voltamograma cíclico de: A) ACS 1 y B) ACS 8 a diferentes barridos de velocidad. 36 Figura 16.- A) criterio de irreversibilidad de Nicholson-Shain [Epa vs log (v)], respuesta lineal y B) gráfico de log (Ipa) en función del [Log (v)], pendiente menor 0,5 para control difusional. ... 37 Figura 17.- Voltamograma de pulso diferencial para cumarinas no hidroxiladas: A) 2, B) 4 y C) 8. ... 38 Figura 18.- Voltamograma cíclico de: A) ACS 3 y B) ACS 9 a diferentes barridos de velocidad. 39 Figura 19.- Mecanismo de electro-oxidación descrito para 4-hidroxicumarina 141. ... 40
Figura 20.- Espectro de REE del aducto de espín formado entre PBN y el radical libre generado por la oxidación electroquímica del compuesto 5. A) experimental y B) simulado en DMF. ... 42 Figura 21.- Reacción entre atrapador de espín (PBN) y el radical libre. ... 43
xi
Figura 22.- Espectro de REE del aducto de espín formado entre PBN y el radical libre generado por la oxidación electroquímica del compuesto 9. (*) patrón hiperfino para el aducto PBN-cumarina... 44 Figura 23.- Espectro de REE del radical generado electroquímicamente para el compuesto 9. A) experimental y B) simulado. ... 45 Figura 24.- Mecanismo de oxidación propuesto para la amido cumarina sustituida no hidroxilada 1, determinado por REE. ... 45 Figura 25.- Mecanismo de oxidación propuesto para la amido cumarina sustituida hidroxilada 11, determinado por REE. ... 46 Figura 26.- Mecanismo de oxidación propuesto para la amido cumarina sustituida hidroxilada 9, determinado por REE. ... 46 Figura 27.- A) Perfil ORAC-FL para el compuesto 3; B) Área bajo la curva (ABC) en función de la concentración del compuesto 3. ... 47 Figura 28.- Espectros de REE para los ensayos de reactividad del blanco (azul) y ACS 5 (rojo), en buffer fosfato (pH = 7,4) y DMSO. ... 48 Figura 29.- Actividad antioxidante celular del compuesto 3 en la curva de formación ROS RAW 264.7 (A) expresada como la fluorescencia normalizada frente al tiempo. (B) CAA versus ClogD (teórico), a 10 μM. ... 49 Figura 30.- Porcentaje de viabilidad de tripomastigotes de T. cruzi Dm28c a concentración de 100 µM y 10 µM de ACS y estructura de nifurtimox utilizado como control positivo. Diferencia significativa en comparación con el control (ANOVA de una vía con post-prueba de Dunnett; (***: p> 0,01). ... 51 Figura 31.- Relación entre actividad antioxidante celular y actividad tripanocida contra la forma tripomastigote de T. cruzi, en presencia de ACS. ... 53 Figura 32.- Estructura de amido cumarinas sustituidas a incluir en 6-desoxi-6-amino-β-D- ciclodextrina. ... 53 Figura 33.- Espectros de REE de los aductos de espín generados en la forma epimastigote de T. cruzi (Dm28c) a temperatura ambiente: A) Espectro registrado con los epimastigotes incubados con el compuesto 2 y DMPO; B) Espectro registrado con los epimastigotes incubados con el compuesto 3 y DMPO; C) Espectro registrado con los epimastigotes incubados con menadiona y DMPO; D) Espectro del control (DMSO). El patrón hiperfino correspondiente al aducto de espin DMPO-OH ha sido marcado con (X). El (#) indica el aducto entre un radical centrado en carbono y DMPO y (+) indica el aducto DMPOX. ... 56 Figura 34.- Esquema de generación de especies radicalarias en epimastigotes de T. cruzi, generación de metabolitos y su interacción con el atrapador de espín DMPO. DMPO-CUM (sexteto de intensidad 1:1:1:1:1:1), DMPO-OH (cuarto de intensidad 1:2:2:1) y DMPOX (tripl ete de intensidad 1:1:1). ... 57 Figura 35.- Porcentaje de incorporación a la mitocondrial de la sonda fluorescente TMRE 50 mM, utilizando CCCP como control positivo. Los resultados son expresados como el promedio ± SD de tres experimentos independientes. Diferencia significativa en comparación con el control (ANOVA de una vía con post-prueba de Dunnett; (***: p> 0.01). ... 58 Figura 36.- Espectro de RMN 1H (400 MHz) de mono-6-amino-6-desoxi-β-CD en DMSO-d6. .. 61xii
Figura 37.- Determinación de la estequiometría de complejos de inclusión mediante método de variación continua. ... 62 Figura 38.- Representación gráfica de la ecuación de Benesi-Hildebrand para complejos de inclusión de amido cumarinas sustituidas y mono-6-amino-β-ciclodextrina a 25°C. ... 63 Figura 39.- Porcentaje de incorporación de la sonda fluorescente TMRE en la mitocondria de complejos de inclusión de ACS con mono-6-amino-β-CD. Los resultados son expresados como el promedio ± SD de tres experimentos independientes. Diferencia significativa en comparación con el control (ANOVA de una vía con post-prueba de Dunnett; (*: p> 0,05 ***: p> 0.01). ... 68 Figura 40.- A) Espectro de IR-FT y segunda derivada de Durvillaea antarctica recolectada en Bahía El Aguila, B) espectro de IR-FT y segunda derivada de Durvillaea antarctica recolectada en Seno Otway. ... 69 Figura 41.-Espectro de IR-FT y segunda derivada del extracto alcalino purificado de Durvillaea antarctica. ... 71 Figura 42.- Espectro de RMN 1H (400 MHz) del extracto alcalino purificado Durvillaea antarcticaen D2O. ... 72
Figura 43.- Espectros de IR-TF (A) fracción 1, (B) fracción 2 y (C) fracción 3 obtenidas de la hidrólisis parcial del extracto alcalino de Durvillaea antarctica. ... 74 Figura 44.- Espectros de RMN monodimensionales de la fracción 2 obtenida del extracto alcalino de Durvillaea antarctica. (A) Espectro de RMN 1H y (B) Espectro de RMN 13C. ... 76
Figura 45.- Espectros de RMN 2D A) COSY 1H/1H, B) HSQC 13C/1H y C) HMBC 13C/1H de la
fracción 2 de la hidrólisis parcial ácida del extracto alcalino de Durvillaea antarctica.... 77 Figura 46.- Espectros de RMN bidimensionales A) COSY 1H/1H, B) HSQC 13C/1H y C) HMBC 13C/1H de la fracción 3 de la hidrólisis parcial ácida del extracto alcalino de Durvillaea antarctica
... 78 Figura 47.- Esquema de síntesis de glicoconjugado del bloque GG con mono-6-amino-β-CD y formación de hidrogeles supramoleculares con las amido cumarinas sustituidas seleccionadas. ... 80 Figura 48.- A) espectro de IR-TF y B) espectro de RMN 1H del glicoconjugado de bloques GG con
mono-6-amino-β-ciclodextrina en D2O a 400 MHZ. ... 81
Figura 49.- Curva de hinchado de hidrogel supramolecular en una mezcla de tampón fosfato pH 7,0 y DMSO en relación 80/20. ... 82 Figura 50.- Curva de hinchado de hidrogel supramolecular a pH y temperatura controlada 37°C. ... 83 Figura 51.- Curvas de liberación de ACS 2 A) a temperatura controlada (37°C) y B) a pH y temperatura controlada. ... 84 Figura 52.- Diseño de cumarinas con actividad tripanocida potencial en función a los antecedentes obtenidos. ... 87
1
1.- Introducción
1.1.- Las cumarinas.
Las cumarinas constituyen una familia de lactonas ampliamente distribuidas en el reino vegetal, encontrándose en frutos, semillas y hojas de plantas superiores, siendo en las especies de rutáceas y umbelíferas donde se encuentran en mayor cantidad 1. Las cumarinas se aislaron por
primera vez en 1820 de frijoles de tonka (Dipteryx odorata) y se han utilizado en la medicina tradicional de pueblos originarios debido a sus múltiples propiedades 2.
La estructura básica de estos compuestos corresponde a 1-benzopiran-2-ona 3-5 y pueden ser
clasificados en cuatro categorías: cumarinas simples, cumarinas pirona-sustituidas, furanocumarinas y piranocumarinas (Figura 1). Las cumarinas simples contienen sustituyentes en el anillo de benceno, pudiendo estar hidroxilado, alquilado o alcoxilado. Las cumarinas pirona-sustituidas presentan sustituciones en las posiciones 3 ó 4 en el anillo de pirona. Las furanocumarinas contienen un anillo de furano unido a la estructura básica de cumarina, estas pueden ser lineales o angulares dependiendo de la posición del anillo de furano. Las piranocumarinas contienen un anillo de pirano y pueden existir en formas lineales o angulares dependiendo de la posición del anillo de pirano 6.
Figura 1.- Estructura básica de cumarina y clasificación de cumarinas.
La biosíntesis de la estructura básica de la cumarina se inicia desde L-fenilalanina que se transforma en ácido trans-cinámico por reacción con la enzima fenilalanina amoníaco-liasa. Luego, ocurre la hidroxilación en la posición 2 o bien en las posiciones 2,4 del ácido trans
-2
cinámico y posterior glicosidación (Figura 2). Finalmente, los glicósidos formados isomerizan a la forma E. La ciclación posterior de los mismos origina la cumarina o su derivado hidroxilado en posición 7 (umbeliferona). Otros derivados de la cumarina, tales como esculetina (6,7-dihidroxicumarina) o escopoletina (7-hidroxi-6-metoxicumarina) parecen derivar de la oxidación de la umbeliferona y no a partir del correspondiente derivado de ácido hidroxicumárico6.Figura 2.- Esquema general de la biosíntesis de la cumarina.
Se han identificado más de 1.300 cumarinas, principalmente como metabolitos secundarios en plantas superiores, hongos y bacterias. Desde la primera síntesis publicada en 1882, estos han sido utilizados en ciertos perfumes, acondicionadores de telas y en la industria farmacéutica, especialmente como anticoagulantes y antibióticos (Figura 3).
3
Figura 3.- Cumarinas naturales (dicumarol, clorobiocina y novobiocina) y sintética (warfarina) biológicamente activas.
Asimismo, se ha sintetizado un gran número de cumarinas bajo un diseño racional, que contienen en su mayoría grupos farmacofóricos en las posiciones C-3, C-4 y C-7 de la estructura básica de la cumarina. Estas presentan actividades biológicas, tales como: antimicrobianas, anti-VIH, anticancerígenas, anticoagulantes, antirretrovirales, inhibidoras de acetilcolina, antioxidantes, antiinflamatorias, inhibidoras de ADN-girasa y antiparasitarias 7.
Por otra parte, las cumarinas destacan por sus propiedades fluorescentes, ya que son altamente sensibles a cambios de polaridad y viscosidad del entorno, lo que ha permitido su aplicación como sonda en una amplia gama de sistemas, incluyendo mezclas de solventes y materiales heterogéneos 8.
1.2.- Actividades biológicas de las cumarinas
Se ha descrito que algunos derivados de cumarina pueden reducir la formación y/o estimular el sistema inmunológico para el atrapamiento de especies reactivas de oxígeno (EROs). Estos mecanismos proporcionan propiedades antioxidantes de protección; por ejemplo, efecto protector contra daño tisular. La similitud estructural entre las cumarinas y los flavonoides (compuestos descritos como antioxidantes) es probablemente la razón para la capacidad antioxidante que presentan los derivados de cumarinas, que puede incluir diferentes mecanismos moleculares. La naturaleza y posición de los grupos funcionales en la estructura básica de cumarina tienen una
4
gran influencia en la capacidad antioxidante de estos derivados, así como también en otras propiedades de interés farmacológico 9-11.Se ha demostrado que derivados con grupo hidroxilo en la posición 4 (cumarina pirona-sustituida) exhiben actividad anticoagulante, espasmolítica, anti-inflamatoria y citotoxicidad contra el virus VIH 12. Por otra parte, 5-hidroxicumarina, 7-hidroxicumarina, piranocumarina y
7,8-dihidroxi-4-metilcumarina muestran ser activas contra cáncer de mamas y leucemia 13. Otros
derivados de cumarinas han presentado actividad inhibitoria de enzimas tales como monoaminoxidasa (MAO)14. En particular, se ha descrito que sustituyentes cloruro y metoxilo
muestran alta actividad inhibitoria contra MAO-A y MAO-B, respectivamente 15-17.
Matos et al 18 estudiaron las propiedades antioxidantes de una serie de 3-fenilcumarinas (Figura
4), a través de resonancia de espín electrónico (REE), voltametría cíclica (CV) y capacidad de absorción de radicales oxígeno (ORAC-FL). Encontraron que el compuesto 9 presentó mayor capacidad antioxidante, pudiendo reducir la concentración de radicales hidroxilo y superóxido en un 100% y 71,5%, respectivamente. En cuanto a ORAC-FL, se encontró que este compuesto presenta un índice mayor que los antioxidantes naturales catequina (6,76) y quercetina (7,28), en relación a Trolox (derivado hidrosoluble de α-tocoferol).
Figura 4.- Derivados sintetizados de 3-fenilcumarinas con capacidad antioxidante.
Pérez-Cruz et al 19 estudiaron una serie de hidroxicumarinas con sustituyentes dadores y
aceptores de electrones. Los estudios electroquímicos de estos derivados mostraron que los procesos de oxidación ocurren a bajos potenciales, especialmente en cumarinas que presentaban el grupo catecol. Los resultados indicaron que los derivados monohidroxilados mostraron mayores valores de ORAC-FL, comparables con los flavonoides quercetina y catequina. Los estudios de REE mostraron la formación de radicales semiquinona en todos los compuestos. Finalmente, estudios in vitro revelaron que la mayoría de los compuestos presentan baja citotoxicidad. Los ensayos de citoprotección en células endoteliales de bovino indicaron que los compuestos 1 y 2 (Figura 5) de la serie estudiada mostraron mejores propiedades inhibitorias de
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la apoptosis celular inducida por peroxinitrito y peróxido de hidrógeno que los derivados dihidroxilados.Debido a las propiedades antioxidantes que presentan las cumarinas sustituidas, es posible el uso de estos compuestos como potenciales candidatos capaces de prevenir o minimizar la sobreproducción de especies reactivas de nitrógeno (ERNs) y EROs en estrés oxidativo relacionado a enfermedades tales como: cáncer, diabetes, Alzheimer y enfermedades parasitarias, entre otras 20, 21.
Figura 5.- Hidroxicumarinas sintéticas con capacidad antioxidante, diseñadas para disminuir la apoptosis celular inducida por especies reactivas.
1.3.- Actividad antiparasitaria
Las enfermedades parasitarias tropicales, especialmente las producidas por parásitos protozoarios, constituyen un problema importante de salud pública en muchos países. Estas se caracterizan por la generación de un entorno oxidativo, a través de la producción de EROs y ERNs, que pueden contribuir a lesiones cutáneas, a través de daño en el ADN de las células no infectadas. Por lo cual, las cumarinas y sus derivados pueden ser utilizados en el tratamiento de estas enfermedades 22. Los parásitos protozoarios de la familia de los tripanosomátidos son
responsables de una amplia variedad de enfermedades, algunas de ellas son la enfermedad del sueño (tripanosomiasis africana), leishmaniasis y enfermedad de Chagas (tripanosomiasis americana). Se ha descrito que la cumarina extraída de las hojas de Calophyllum brasiliense presentó alta actividad contra el parásito Leishmania amazonensis; los análisis estructurales sobre el parásito demostraron cambios ultraestructurales en la mitocondria. Se encontró que este organelo estaba más abultado y presentaba membranas concéntricas en la matriz mitocondrial, indicando un daño significativo 23.
Dentro de las enfermedades parasitarias destaca la tripanosomiasis americana (enfermedad de Chagas), reconocida por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como una de las 17
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enfermedades tropicales desatendidas del mundo y una de las más importantes parasitosis emergente en los países desarrollados, estrechamente relacionada con aspectos socioeconómicos-culturales deficitarios 24-28.1.4.- Tripanosomiasis americana
La enfermedad de Chagas es una patología causada por el parásito protozoario Trypanosoma cruzi (T. cruzi) que afecta aproximadamente a 7 millones de personas en todo el mundo y causa más de 7.000 muertes al año, según las estadísticas de la Organización Panamericana de la Salud y la Organización Mundial de la Salud) 29. A pesar de ser endémica en América Latina, la
enfermedad ha avanzado hacia América del Norte, Europa y varios países del Pacífico Occidental. Fuera de las regiones endémicas, la mayor carga se produce en los EE.UU., donde viven 300.000 personas con la enfermedad 30. El insecto Triatoma infestans (comúnmente
llamado vinchuca) es el principal vector en la región endémica sub-amazónica (sur de Sudamérica). En zonas no endémicas, la transmisión puede ocurrir a través de un trasplante de órganos, transfusiones de sangre, la transmisión congénita o como consecuencia de manipulación en el laboratorio31, 32. El ciclo de vida del T. cruzi es complejo, con varias formas de
desarrollo en los insectos vectores y huéspedes mamíferos. Los insectos se infectan al consumir sangre de animales o seres humanos infectados con T. cruzi (tripomastigotes). En el tracto digestivo del triatomino, los tripomastigotes se diferencian en epimastigotes (forma replicativa) y luego en tripomastigotes metacíclicos en la parte final del intestino. El ciclo biológico del parásito se inicia cuando un triatomino que contiene epimastigotes (forma replicativa no infectiva) en su intestino, se alimenta de sangre de mamífero. Simultáneamente, el insecto deposita sus heces cerca de la herida provocada por la picadura, permitiendo la entrada de los tripomastigotes metacíclico (forma infectiva no replicativa) a los tejidos del mamífero, siendo el primer contacto con las células del sistema inmune innato. Los macrófagos son infectados por los tripomastigotes sanguíneos y en el interior de estos se diferencian en amastigotes (forma replicativa intracelular). Luego de sucesivas replicaciones se transforman nuevamente en tripomastigotes, los cuales son capaces de provocar la lisis de la célula y comenzar así un nuevo ciclo de infección (Figura 6) 33, 34.
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Figura 6.- Ciclo de vida del parásito Trypanosoma cruzi.
Nifurtimox (NFX) y Benznidazol (BNZ) son los dos únicos fármacos disponibles para el tratamiento de la enfermedad de Chagas, pero tienen varios inconvenientes, tales como una baja eficacia, alta toxicidad y efectos secundarios múltiples. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de fármacos nuevos más eficaces y seguros para el tratamiento de esta enfermedad 35.
1.5.- Actividad tripanocida de cumarinas
Durante el curso de la infección y el desarrollo de la enfermedad de Chagas, EROs pueden ser producidas como consecuencia de la destrucción de tejidos causada por secreciones tóxicas del parásito (Trypanosoma cruzi), reacciones citotóxicas mediadas inmunológicamente y daño secundario en el miocardio 22, 36, 37. Estas especies provocan lesión oxidativa a través de
peroxidación lipídica, modificación de proteínas y daño al ADN 38. Figueroa-Guiñez et al. describe
que compuestos antioxidantes, tales como los flavonoides, estimulan el sistema inmunológico del huésped permitiendo la reducción de parásitos protozoarios en el sistema 39. También, se ha
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mediante la inhibición de la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), la cual es importante en la vía glucolítica del parásito 25. En función a lo anterior, Pérez-Cruz et al 40, sintetizaron una serie de 4-hidroxicumarinas (Figura 7) y evaluaron la capacidad antioxidante y actividad tripanocida, encontrando que los compuestos 2, 4 y 5 presentaron actividad apreciable contra la forma epimastigote, aunque esta fue menor que para NFX.En cuanto a la capacidad antioxidante, fue posible establecer que derivados con sustituyentes electroaceptores presentaron mayor reactividad contra el radical hidroxilo por REE. En esta serie se observó la disminución de la actividad tripanocida por la introducción de grupos metoxilo e hidroxilo en el anillo C, estableciendo una relación inversa entre la actividad tripanocida y la capacidad antioxidante.Figura 7.- Derivados sintetizados de 4-hidroxicumarina con actividad sobre el parásito de T. cruzi.
En base a estos estudios, Figueroa et al 22 sintetizaron una serie de
3-amido/carbamatocumarinas (Figura 8) evaluando la capacidad antioxidante y actividad anti-T. cruzi. De esta serie, los compuestos 3 y 5 que presentan un grupo hidroxilo en la posición 4 de la cumarina, mostraron capacidad antioxidante más alta que Trolox en el ensayo ORAC-FL. Estudios de REE de estos compuestos demostraron una alta reactividad contra el radical hidroxilo, la cual se correlacionó con la capacidad antioxidante determinada por ORAC-FL. En cuanto a la actividad tripanocida frente a las formas epimastigotes y tripomastigotes del parásito de T. cruzi (formas celulares replicativa y no replicativa, respectivamente), se encontró que los compuestos 3 y 4 presentaron la mayor actividad. Al comparar los compuestos 2 y 3, la presencia combinada del grupo hidroxilo en la posición 4 y de un grupo amino en la posición 3 aumentó el valor de ORAC-FL y la actividad tripanocida. Por otra parte, la introducción del grupo cloroacetamida (compuesto 5) disminuyó drásticamente ambas actividades. Sin embargo, este hecho no fue observado en el compuesto 4, donde sólo disminuyó el índice ORAC-FL, pero fue más activo como agente tripanocida. Además del bajo valor ORAC-FL, el compuesto 4 presentó citotoxicidad en macrófagos RAW 264.7, por lo cual se descartó como posible agente tripanocida. El mejor candidato de esta serie es el compuesto 3, que presentó baja citotoxicidad, alta actividad
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tripanocida y un interesante perfil antioxidante, lo que potenciaría el uso de este compuesto como un agente con múltiples objetivo.Figura 8.- Estructura de derivados sintetizados de 3-amido/carbamatocumarina con actividad tripanocida.
Tabla 1: Actividad tripanocida y capacidad antioxidante de derivados de 3-
amido/carbamatocumarina 22. Compuesto IC50* (RAW 264.7) µM Actividad tripanocida sobre epimastigote (%) Actividad tripanocida sobre tripomastigote (%) Índice ORAC-FL 1 > 100 48,7 ± 2,8 11,5 ± 0,9 4,200 ± 0,110 2 > 100 42,1 ± 2,1 8,6 ± 0,6 0,820 ± 0,030 3 > 100 65,7 ± 3,5 22,2 ± 2,1 4,360 ± 0,120 4 2,70 ± 0,17 53,7 ± 3,2 69,4 ± 4,4 0,065 ± 0,006 5 > 100 10,0 ± 0,6 5,8 ± 0,5 1,810 ± 0,040 NFX > 100 52,5 ± 2,2 36,9 ± 3,4 ---
*IC50: la mitad de la concentración inhibitoria máxima
Pese a que la potencia tripanocida del compuesto 3 es similar a nifurtimox en la forma epimastigote, ésta fue menor sobre la forma infectiva del parásito. Estos resultados condujeron a realizar modificaciones del compuesto 4 con la finalidad de disminuir la toxicidad en células mamíferas. Muñoz et al 41 diseñaron la síntesis de una serie de 3-carboxamidocumarinas (Figura 9). Los autores encontraron que los compuestos sintetizados presentaron una alta selectividad hacia células parasitarias y similar actividad sobre la forma epimastigote que NFX (Tabla 2). Adicionalmente, postularon que un mecanismo posible de acción tripanocida es la generación de estrés oxidativo en el parásito, mediante la determinación del potencial de la membrana mitocondrial (ΔΨm) del parásito. Este organelo es esencial para la supervivencia del parásito y la regulación de procesos relacionados con el balance energético y la modulación de la apoptosis42.
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Figura 9.- Derivados sintetizados de 3-carboxamidocumarinas con actividad tripanocida.
Tabla 2: Actividad tripanocida e índice de selectividad de derivados de 3-carboxamido cumarinas
41.
* Índice de selectividad: 𝐼𝐶50 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑅𝐴𝑊 264.7
𝐼𝐶50 𝑒𝑝𝑖𝑚𝑎𝑠𝑡𝑖𝑔𝑜𝑡𝑒𝑠 , mientras mayor él valor, mayor es la selectividad hacia células parasitarias
Por otra parte, Figueroa-Guiñez et
al
encontraron que algunas cumarinas son eficaces en la regresión de la enfermedad de Chagas mediante la inhibición de la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), al ser considerada bio-isóstero de NAD, la cual es importante en la vía glucolítica del parásito 43, 44. A pesar del potencial uso de las cumarinas y sus derivadoscomo agentes tripanocidas, su aplicación es limitada debido a que presentan baja solubilidad en agua, lo cual se relaciona con baja biodisponibilidad. Cabe destacar que, los compuestos bioactivos pueden ser modificados por factores propios del metabolismo tales como: cambios de
Compuesto IC50 (RAW 264.7)/µM IC50 (epimastigotes)/µM Índice de selectividad
1 122,20 ± 0,01 82,50 ± 0,03 1,48 2 100,48 ± 0,03 28,54 ± 0,01 3,52 3 121,80 ± 0,10 51,80 ± 0,10 2,35 4 72,50 ± 0,40 57,07 ± 0,50 1,27 5 72,09 ± 0,02 26,40 ± 0,30 2,73 6 51,20 ± 0,10 24,90 ± 0,03 1,06 7 192,97 ± 0,02 47,90 ± 0,20 4,03 8 > 100 66,24 ± 0,15 >1,51 9 180,75 ± 0,02 22,25 ± 0,25 8,12 10 >100 20,90 ± 0,10 >4,78 NFX 263,40 ± 2,54 17,40 ± 1,30 15,19
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pH, cambios temperatura y degradación enzimática. Una estrategia que permite aumentar la solubilidad y conservar las propiedades de compuestos bioactivos en medios fisiológicos es la formación de complejos de inclusión con ciclodextrinas 45.En base a los antecedentes anteriormente descritos, resulta de gran interés el estudio de una serie de cumarinas, que ha sido sintetizada con un diseño racional en función de los resultados obtenidos por Figueroa et al y Muñoz et al22, 41, por el grupo del Dr. Eugenio Uriarte Villares de la
Universidad de Santiago de Compostela, España. Esta serie contiene el grupo amida en la posición 3 u 8 del esqueleto básico de la cumarina con diferentes sustituyentes y grupo hidroxilo en la posición 4 ó 7, denominadas cumarinas amido sustituidas (ACS) (Figura 10).
Figura 10.- Estructura de amido cumarinas sustituidas (ACS) a evaluar.
1.6.- Complejos de inclusión con ciclodextrinas.
Las ciclodextinas son oligosacáridos cíclicos compuestos por unidades de D-glucopiranosa con enlace glicosídico α-(14), las que se obtienen mediante la degradación del almidón por la enzima ciclodextrina glucosiltransferasa. Se clasifican según el número de residuos glucopiranosilos que contienen 6, 7 u 8 en α, β y γ-ciclodextrina, respectivamente (Figura 11) 46.
CAS R1 R2 R3 R4 1 CH3 H H - 2 CH=CH2 H H - 3 CH=CH2 OH H - 4 O H H - 5 O OH H - 6 S H H - 7 S OH H - 8 O H H - 9 O OH H - 10 - CH3 OH O 11 - CH3 OH S
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Las moléculas de ciclodextrina tienen forma de cono truncado, como consecuencia de la conformación silla 4C1de las unidades de D-glucopiranosa (Figura 11). Los grupos hidroxilo estánorientados hacia el exterior de la cavidad, lo que otorga un carácter hidrofílico a la superficie; se observa que los grupos hidroxilo secundarios están situados en el borde más amplio y los grupos hidroxilos primarios se encuentran en el borde más estrecho. El interior de la cavidad tiene un carácter lipofílico, debido a la orientación del oxígeno del enlace glicosídico y grupos C-H 47.
Figura 11.- Representación esquemática de α, β y γ -ciclodextrina (izquierda a derecha) y la representación
esquemática del aspecto de cono truncado de ciclodextrina.
Las características estructurales de las ciclodextrinas (CDs) permiten la encapsulación parcial o total dentro de la cavidad hidrófoba de una amplia variedad de compuestos orgánicos, expulsando al mismo tiempo las pocas moléculas de agua de alta energía desde el interior. El tamaño de la cavidad de las CDs permite selectividad para la complejación de moléculas huésped. Las CDs tienen aplicaciones biomédicas muy atractivas debido a su baja toxicidad y baja inmunogenicidad 48, 49. Los complejos de inclusión se caracterizan por una estequiometría
definida y la ausencia de enlaces covalentes entre la molécula huésped y el anfitrión (CD). Existen varios tipos de interacciones involucradas en la formación de complejos de inclusión y su contribución relativa depende del tipo de huésped y CD. Estas fuerzas incluyen interacciones hidrofóbicas, reducción de la tensión de conformación, interacciones dipolo-dipolo, interacciones electrostáticas y fuerzas de van der Waals, entre otras 50. La capacidad para formar complejos de
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inclusión con una amplia variedad de moléculas huésped es una de las propiedades más interesantes de las CDs y ha sido la base para la mayoría de sus aplicaciones en la industria farmacéutica. Se utilizan principalmente para aumentar la solubilidad, mejorar la biodisponibilidad, modular la velocidad de suministro y estabilidad de fármacos 47. La evaluaciónde la formación de un complejo de inclusión y su caracterización es compleja y a menudo requiere el uso de diferentes métodos de análisis, cuyos resultados tienen que ser combinados y examinados conjuntamente, ya que cada método explora una característica particular del complejo de inclusión. Los diferentes métodos se basan generalmente en la detección de variaciones en propiedades físicas o químicas del huésped como consecuencia de la formación de complejo de inclusión. Las principales técnicas utilizadas para la caracterización de la formación de complejos de inclusión con CDs en solución incluyen técnicas espectroscópicas (resonancia magnética nuclear (RMN), fluorescencia, REE y dicroísmo circular) y electroanalíticas (polarografía, voltamperometría, potenciometría y conductimetría), entre otras 47, 51. Chen et al45
estudiaron la formación de complejos de inclusión de derivados de cumarinas simples con 2-hidroxipropil-β-CD (HP-β-CD) en agua y tampón fosfato salino (pH 7), encontrando un incremento en la solubilidad de los derivados de cumarina en función de la concentración de HP-β-CD en ambos medios. Estudios termodinámicos de la formación de estos complejos mostraron valores negativos de energía de Gibbs y entalpía, reflejando un proceso de formación espontáneo y exotérmico. Asimismo, las variaciones negativas de entalpia se atribuyeron a interacciones de tipo van der Waals entre el anfitrión y huésped. Por otra parte, Folch-Cano et al 52 realizaron
estudios de capacidad antioxidante y formación de complejos de inclusión de 3-fenil-4-hidroxi-7-metoxicumarina con β-CD, hepta-2,6-di-O-metil-β-CD (DM-β-CD)y HP-β-CD. Encontraron que las constantes de asociación determinadas para los complejos de inclusión con β-CD y HP-β-CD fueron altas y similares, lo cual indicó que 3-fenil-4-hidroxi-7-metoxicumarina está contenida en la cavidad hidrófoba y que el grupo hidroxipropilo no tiene efectos significativos en la estabilidad del complejo de inclusión. También encontraron que DM-β-CD presentó una constante de asociación mayor, atribuida a la ampliación de la región hidrófoba por la presencia de grupos metilo. Los parámetros termodinámicos de formación del complejo de inclusión con DM-β-CD mostraron valores negativos de energía de Gibbs y valores positivos de entalpia y entropía, que indican que la inclusión de 3-fenil-4-hidroxi-7-metoxicumarina es impulsada entrópicamente. El valor positivo de entropía se atribuye, por una parte, a la pérdida de grados de libertad del huésped y del anfitrión y, por otro lado, al aumento de la entropía del sistema por la liberación de moléculas de agua que rodean el sustrato. En cuanto a la capacidad antioxidante, se encontró que el complejo de inclusión con DM-β-CD presentó un valor levemente menor en comparación con derivado de 4-hidroxicumarina libre. La disminución en la capacidad antioxidante se atribuyó a que el grupo hidroxilo de la cumarina penetra en la cavidad de la CD causando un efecto protector del mismo. Este resultado es concordante con la geometría de los complejos de inclusión determinada por RMN en una y dos dimensiones. Otros estudios demostraron que la
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posición del huésped en los complejos de inclusión influye en la capacidad antioxidante del complejo formado 50, 53.En cuanto a la actividad tripanocida de complejos de inclusión con CD, se ha descrito que complejos de benznidazol con β-CD aumentan la solubilidad y biodisponibilidad del fármaco, los que presentaron menor toxicidad que el benznidazol libre en células humanas 54-57. Por lo cual,
resulta interesante estudiar el efecto de la inclusión de cumarinas sustituidas con CD en la actividad tripanocida y capacidad antioxidante.
La β-CD y sus derivados son los compuestos más utilizado para la formación de complejos de inclusión, debido al tamaño óptimo de su cavidad interna (7,8 Ȧ). Sin embargo, debido a la baja solubilidad acuosa, las β-CDs se han conjugado a varios polímeros con la finalidad de modificar las propiedades fisicoquímicas, mejorar la biocompatibilidad y mejorar la capacidad de administración de fármacos 58. El entrecruzamiento de redes poliméricas conjugadas con β-CDs
permite la generación de hidrogeles, los que son ampliamente utilizados como sistemas de liberación controlada de fármacos 59.
1.7.- Hidrogeles
Los hidrogeles son materiales poliméricos tridimensionales formados por polímeros solubles en agua que al entrecruzarse se vuelven insolubles. La principal característica de estas matrices es la capacidad de absorber hasta un 90% de agua o de algún otro solvente polar, incrementando varias veces su tamaño 60, 61. La capacidad de los hidrogeles de absorber agua se debe a grupos
funcionales hidrófilos unidos a la cadena principal del polímero, mientras que su resistencia a la disolución surge del entrecruzamiento de las cadenas de la red. El entrecruzamiento de polímeros por interacciones covalentes permite la preparación de hidrogel con alta resistencia mecánica y resistencia a la degradabilidad, pero con baja capacidad de hinchado, debido a la rigidez de la matriz polimérica. Los hidrogeles sintetizados a través de interacciones no covalentes entre las cadenas del polímero, presentan capacidades de hinchado más elevadas, pero con menor resistencia mecánica 62. Los hidrogeles se clasifican en diferentes grupos en función de su
estructura física (amorfo, semicristalino, con enlaces por puentes de hidrógeno), carga eléctrica de los polímeros constituyentes (aniónico, catiónico o neutro), entrecruzamiento (químico o físico) y origen (sintético o natural), entre otros 63, 64. Dentro de los polímeros sintéticos utilizados en la
preparación de hidrogeles se encuentran la polivinilpirrolidona (PVP), el ácido poliláctico (PLA), entre otros 65-67. Estos hidrogeles tienen una limitada aplicación como biomateriales, ya que
presentan baja biocompatibilidad y degradabilidad. Por otra parte, entre los polímeros naturales más utilizados en la síntesis de hidrogeles se encuentran los polisacáridos, tales como quitosano,
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ácido algínico, almidón, agarosa, celulosa, entre otros 68-70. El uso de productos naturales en lapreparación de hidrogeles ha tomado un rol relevante, debido a que generalmente estos confieren propiedades de biodegradabilidad y biocompatibilidad, propiedades fundamentales requeridas en las aplicaciones biofarmacéuticas 71. Uno de los biopolímeros más utilizados en la preparación de
hidrogeles es el ácido algínico, que es sintetizado en la pared celular de las algas pardas (Phaeophyceae)72, 73 y se encuentra en diferentes proporciones a lo largo de ella, en forma de
sales de calcio y magnesio 74. Este polisacárido es un copolímero lineal formado por dos ácidos
urónicos, el ácido L-gulurónico (G), cuyos residuos están unidos por enlaces α (1→4) y el ácido D-manurónico (M), cuyos residuos se encuentran unidos mediante enlaces β (1→4) 75-77. Estos
se encuentran formando bloques homopoliméricos (GG y MM) y bloques heteropoliméricos (MG) dentro del polímero (Figura 12 A) 78, la proporción de estos bloques influye en las propiedades
físicas del ácido algínico. La capacidad de gelificación del ácido alginico, es debida a los bloques GG, capaces de coordinar cationes divalentes mediante los grupos carboxilato, con la participación de los átomos de oxígeno de los grupos hidroxilo y del enlace glicosídico, en una estructura denominada caja de huevos (Figura 12 B) 79. De este modo aquellas muestras de ácido
algínico enriquecidas en bloques MM formarán geles flexibles, mientras que aquellas enriquecidas en bloques GG formarán geles rígidos en presencia de algunos iones divalentes 80.
El alginato de sodio es biocompatible, biodegradable, capaz de formar geles con elevadas capacidades de hinchado y sensibles a estímulos como el pH, lo cual lo convierte en un componente de interés para la preparación de sistemas de liberación controlada 81, 82. La
liberación controlada ocurre, generalmente, a través de difusión pasiva dentro de la matriz polimérica, la que es afectada por la naturaleza de los polímeros. El factor principal y que presenta la mayor repercusión en la velocidad de liberación controlada es el tamaño de poro (ξ) existente entre las redes que conforman la matriz del hidrogel 83-85. Los geles de alginato de calcio sufren
intercambio catiónico en presencia de iones sodio a pH básico, permitiendo disolver el gel. Debido a esta característica el alginato de calcio es un potencial transportador de drogas que sean absorbidas a nivel intestinal, donde se dan las condiciones adecuadas para disolución del gel y la liberación de la droga.
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Figura 12.- A) Estructuras químicas de las fracciones homopoliméricas y heteropoliméricas del ácido algínico. B) Modelo de gelación del bloque homopolimérico GG con ion Ca2+.
A pesar del amplio uso que tienen los hidrogeles como sistema de liberación controlada de fármacos, su uso es limitado. Debido a que el alto contenido en agua, esencial para la biocompatibilidad, permite que solo moléculas polares puedan ser incorporadas de manera efectiva en la fase acuosa del hidrogel y una vez que se administra al organismo, la liberación es generalmente demasiado rápida para fines terapéuticos 86, 87. Este hecho se explica por el
impedimento hidrodinámico insignificante para el movimiento de pequeñas moléculas hidrofílicas, debido a la baja microviscosidad de la red polimérica 88. Se ha demostrado que polímeros
conjugados con β-CDs (Figura 13) amplían la afinidad de los hidrogeles hacia moléculas apolares
89-92. La afinidad de la molécula huésped con la cavidad de β-CD dota a los hidrogeles de un
mecanismo único para controlar la carga y entrega de fármacos, denominándolos hidrogeles supramoleculares. Cabe destacar que la unión covalente de CDs a una estructura polimérica no disminuye la capacidad de formación de complejos, incluso puede mejorar particularmente cuando la molécula huésped puede interactuar simultáneamente con varias CDs 93 94. Las
estrategias utilizadas para la generación de hidrogeles supramoleculares incluyen la polimerización de monómeros que contienen CD con otros monómeros hidrófilos o por reacción de grupos hidroxilo de la CD con grupos que contienen la red polimérica. En el último enfoque, la
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estructura química de las CDs multivalente les permite ser utilizados como reactivos de entrecruzamiento multifuncionales 95. Por ejemplo, Cesteros et al 96 utilizaron poli (etilenglicol)(PEG) protegido con el grupo isocianato para obtener redes de hidrogel. Los hidrogeles se obtuvieron a través de la reacción entre los grupos hidroxilo de la CD con los grupos isocianato en la cadena del polímero. Obtuvieron un hidrogel supramolecular eficiente, el entrecruzamiento se produce a través de la participación de grupos hidroxilo del borde superior e inferior de la CD en forma aleatoria que conduce a la heterogeneidad en los sitios de unión 97.
Figura 13.- Representación esquemática de la liberación de compuestos (ovalos amarillos) de polímero entrecruzado (líneas azules) conjugado con CDs (conos verdes).
Kono et a l98 sintetizaron hidrogeles supramoleculares de carboximetilquitosano injertado con
β-CD, usando una carbodiimida soluble en agua como un agente entrecruzante en presencia de N-hidroxisuccinimida, usando como fármaco modelo ácido acetilsalicílico (AAS). Encontraron que los hidrogeles presentaron una liberación de AAS más lenta que los hidrogeles sin injerto de β-CD, lo cual fue atribuido a las interacciones de van der Waals entre el resto hidrófobo de AAS y la cavidad de β-CD y a los enlaces por puente de hidrógeno entre el resto polar de AAS y las moléculas de agua al interior del hidrogel. La formación de hidrogeles supramoleculares con quitosano se ha realizado con diferentes tipos de entrecruzamiento 99. Chiang et al100 conjugaron
alginato de sodio con β-CD, con diferentes grados de sustitución, a través de una reacción de amidación promovida por una carbodiimida con mono-6-amino-β-CD. Por otra parte, se generaron hidrogeles fotosensibles semi-interpenetrados entre el glicoconjugado obtenido y polietilenglicol terminado en diazobenceno, utilizando como fármaco modelo rodamina B. Encontraron que la fotosensibilidad de los hidrogeles fue acompañada por la degradación de los mismos, lo que permitió una rápida liberación de moléculas atrapadas. Por otra parte, Izawa et al
101 prepararon hidrogeles por interacción con ion calcio y alginato de sodio conjugado con
6-aminoetilamino-β-CD, utilizando ondansetrón (medicamento que impide náuseas), como fármaco modelo. Encontraron que los hidrogeles supramoleculares respondían a estímulos mecánicos para la liberación del fármaco. Se encontró, además, que la capacidad de carga del hidrogel supramolecular fue ocho veces superior que un hidrogel sin conjugación con el derivado de β-CD. A pesar de la amplia aplicabilidad de hidrogeles en la administración de fármacos existe
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poca información acerca de la generación de hidrogeles supramoleculares que contengan moléculas bioactivas. Igualmente, la obtención de hidrogeles supramoleculares de ácido algínico de relación M/G conocida conjugados con derivados de β-CD no ha sido descrita.19
2.- Hipótesis.
La formación de complejos de inclusión amido cumarinas sustituidas con mono-6-amino-6-desoxi-β-ciclodextrina permite mejorar los aspectos biológicos de las ACS en relación la actividad tripanocida. Asimismo, la encapsulación de las ACS en hidrogeles supramoleculares preparados a partir de bloques homopoliméricos de ácido algínico conjugado con mono-6-amino-6-desoxi-β -ciclodextrina, permite la liberación controlada de los biocompuestos.
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3.- Objetivos.
Objetivo general.
• Estudiar la relación estructura-actividad y formación de complejos de inclusión de amido cumarinas sustituidas (ACS), en cuanto a su actividad tripanocida y evaluar la liberación de ACS encapsuladas en hidrogeles supramoleculares.
Objetivos específicos.
• Caracterizar el mecanismo de oxidación y la capacidad antioxidante de las amido cumarinas sustituidas (ACS).
• Determinar los parámetros de inclusión de los complejos formados con mono-6-amino-6-desoxi-β-CD de las ACS y la difusión pasiva en membrana paralela artificial.
• Determinar la actividad citotóxica de ACS y complejos de inclusión frente a las formas epimastigote y tripomastigote del parásito de Trypanosoma cruzi Dm28c y células murinas RAW 264.7 y estudiar los posibles mecanismos tripanocida asociados a estrés oxidativo.
• Obtener y caracterizar las fracciones homo- y heteropoliméricas del alginato de sodio del alga parda Durvillaea antarctica y conjugar el bloque homopolimérico GG con 6-NH2-β
-CD.
• Preparar hidrogeles supramoleculares a partir del glicoconjugado de bloques homopoliméricos y estudiar la encapsulación y liberación de las ACS en los hidrogeles supramoleculares en función a la temperatura y pH.
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4.- Metodología.
4.1.- Materiales y equipos.
Las cumarinas utilizadas en este trabajo se sintetizaron y caracterizaron en el grupo del Dr. Eugenio Uriarte Villares de la Universidad de Santiago de Compostela, España102. Esta serie
contiene el grupo amida en la posición 3 u 8 de la estructura básica de la cumarina con diferentes sustituyentes y grupo hidroxilo en la posición 4 ó 7 (Figura 14).
Figura 14.- Estructura de amido cumarinas sustituidas (ACS) en estudio: A) serie de 3-amido cumarinas y B) serie de 8-amido cumarinas.
Los cultivos celulares de Trypanosoma cruzi en los estadíos tripomastigote y epimastigote y células de mamífero tipo macrófagos RAW 264.7, se obtuvieron en el Programa de Farmacología Molecular y Clínica del Instituto de Ciencias Biomédicas (ICBM) de la Universidad de Chile.
Se utilizaron dos muestras físicamente diferentes del alga parda Durvillaea antarctica (Durvillaceae, Phaeophyceae, Ochrophyta) colectadas en las zonas de Bahía El Aguila, Punta Arenas, Región de Magallanes (53° 28’ S, 70° 47’ O) y Seno Otway, San Isidro, Región de Magallanes (52° 53’ S, 71° 07’ O), identificadas por el Dr. Andrés Mansilla, Departamento de Ciencias y Recursos Naturales de la Universidad de Magallanes, Punta Arenas.
Los reactivos dihidrocloruro de 2,2′-azobis(2-amidinopropano) (ABAP), piridina anhidra (py), perclorato de tetrabutilamonio (PTBA), bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)- 2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT), éster metílico de tetrametilrodamina (TMRE), nifurtimox (NFX), fluoresceína (Fl), diacetato de 2’,7’-dihidrodiclorofluoresceína (H2DCF-DA), 5,5-dimetil-1-pirrolina-N-óxido (DMPO),
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sodio (NaN3), n-dodecano (C12H26), 1,1,2,2-tetracloroetano (C2H2Cl4), fosfato dibásico de sodio(Na2HPO4), fosfato monobásico de sodio (NaH2PO4),clorhidrato de 1-etil-(3-3-dimetilaminopropil)
carbodiimida (EDC), dimetil sulfóxido ((CH3)2SO), peróxido de hidrógeno 30% (H2O2), ferricianuro
de potasio (K3[Fe(CN)6]), cloruro de potasio (KCl), cianuro de potasio (KCN), ferrisulfato de
amonio (FeNH4SO4), dodecilsulfato de sodio (SDS), fosfato diácido de potasio (KH2PO4)
y fosfatidilcolina, se adquirieron en Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA). Cloruro de sodio (NaCl), cloruro de calcio (CaCl2), carbonato de sodio (Na2CO3), carbonato ácido de sodio
(NaHCO3), ácido clorhídrico fumante 37% (HCl), acetona técnica e hidróxido de sodio (NaOH) se
adquirieron en HES Ltda. (Santiago, Chile). β-ciclodextrina (β-CD), cloruro de p-toluensulfonilo (p-Ts), trifenilfosfina (PPh3) y N-hidroxisuccinimida (NHS) se adquirieron en AK Scientific Inc.
(Palo Alto, CA, EUA).
En el desarrollo del trabajo experimental se utilizó un oxígrafo con electrodo tipo Clark Yellow Springs Instrument, Yellow Spring, (Ohio, EUA), un espectrofotómetro de placa BioTek modelo Synergy HT (Vermont, EUA), espectrofotómetro de placa PerkinElmer EnSpire (Shelton, CT, EUA) y una campana de flujo laminar. Las centrifugaciones se realizaron usando centrifugas Kubota modelo KS-3000P (Tokio, Japón), Hettich modelo Universal 32 (Tuttlingen, Alemania) y una microcentrifuga Heraeus modelo Biofuge 13 (Buckinghamshire, Inglaterra). Se emplearon un evaporador rotatorio Büchi modelo R-110 (Glatthalde, Suiza), un pH-metro Hanna modelo pH-21 (Hanna Instruments, Woonsoket, RI, EUA), incubadora Memmert BE 500 (Frankfurt, Alemania) y un liofilizador Christ Alpha 1-2 (Osterode am Harz, Alemania).
4.2.- Caracterización espectroscópica.
Los extractos purificados y productos sintetizados se caracterizaron por espectroscopía de IR-TF en pastillas de KBr, en un espectrofotómetro Bruker modelo IFS 66ν (Billerica, MA, EUA). La caracterización por espectroscopía de RMN 1H y 13C mono y bidimensional se efectuó en un
equipo Bruker Advance 400 (Billerica, MA, EUA), equipado con una sonda inversa de banda ancha de 5 mm de diámetro de gradiente z, operando a una frecuencia de trabajo de 400,13 MHz (1H) y 100,62 MHz (13C). Las muestras de polisacárido se prepararon realizando previamente tres
intercambios isotópicos con agua deuterada (99% D2O) y se utilizó como patrón interno la sal de
sodio del ácido 3-(trimetilsilil)-1-propiónico-2,2,3,3-d4 (0,75 %) (TMSP-D4). Los espectros de los productos sintetizados a partir de β-CD se registraron en dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6).
Los espectros de resonancia de espín electrónico (REE) se registraron en la banda X (9,7 GHz) usando un espectrómetro ECS 106 (Bruker, Coventry, RU) con una cavidad rectangular y modulación de campo de 50 kHz, equipado con un resonador de alta sensibilidad a temperatura
