ACS a H aN ACS aH aN 1 1,8 13,5 7 2,0 13,4 2 2,0 13,5 8 2,1 13,8 3 2,2 13,7 9 2,1 14,0 4 2,1 13,6 10 1,7 13,6 5 1,8 13,7 11 1,6 13,7 6 1,8 13,7
Figura 21.- Reacción entre atrapador de espín (PBN) y el radical libre.
Para la ACS 9, que contiene el grupo hidroxilo en la posición 4 y el grupo fenilcarbamato en la posición 3, el espectro (Figura 22) da cuenta de la formación de un aducto de espín por atrapamiento de una especie radicalaria centrada en carbono. Asimismo, se pueden apreciar otras señales que indican la deslocalización del radical libre.
44
3440 3450 3460 3470 3480*
*
*
*
*
Campo magnético (G)*
Figura 22.- Espectro de REE del aducto de espín formado entre PBN y el radical libre generado por la
oxidación electroquímica del compuesto 9. (*) patrón hiperfino para el aducto PBN-cumarina.
En función a este resultado se decidió realizar la oxidación electroquímica sin la presencia del atrapador de espín PBN. Obteniendo un espectro de siete líneas (Figura 23) que indica la formación de una especie radicalaria estable.
A)
3450 3460 3470 3480
45
Figura 23.- Espectro de REE del radical generado electroquímicamente para el compuesto 9. A)
experimental y B) simulado.
La simulación computacional del espectro de REE da cuenta de la interacción del átomo de nitrógeno de la amida (aN=1,65 G) y de los 4 hidrógenos (aH=1,60 G) del anillo de benceno de la estructura básica de la cumarina.
En función a los resultados obtenidos se propone un mecanismo de oxidación para las amido cumarinas sustituidas que no contienen grupo hidroxilo (Figura 24). La oxidación ocurre en el nitrógeno del grupo amida y posterior transposición del átomo de hidrógeno para formar la especie radicalaria centrada en carbono, similar a lo descrito por Sánchez et al144, para amidas simétricas de ácido ferúlico .
Figura 24.- Mecanismo de oxidación propuesto para la amido cumarina sustituida no hidroxilada 1,
determinado por REE.
En la figura 25 se presenta el mecanismo propuesto para las cumarinas hidroxiladas distintas al compuesto 9 que involucra la formación del radical centrado en oxígeno del grupo hidroxilo y la posterior deslocalización del electrón desapareado generando un radical centrado en carbono.
46
Figura 25.- Mecanismo de oxidación propuesto para la amido cumarina sustituida hidroxilada 11,
determinado por REE.
En el caso de la cumarina hidroxilada que contiene a grupo fenilcarbamato en posición 3 (Figura 26), el mecanismo propuesto involucra la formación del radical centrado en oxígeno 145, en donde el electrón desapareado interactúa con los 4 hidrógenos del anillo aromático de la cumarina y el nitrógeno del grupo amido, generando un radical estable centrado en el oxígeno en posición 4.
Figura 26.- Mecanismo de oxidación propuesto para la amido cumarina sustituida hidroxilada 9, determinado
por REE.
A partir de la caracterización de las especies radicalarias generadas electroquímicamente, se propusieron los mecanismos de oxidación de las amido cumarinas sustituidas. Para el compuesto 9 se obtuvo un comportamiento diferente al generar una especie radicalaria estable sin la necesidad del uso de la técnica de atrapamiento de espín. Los mecanismos propuestos resultaron ser concordantes con lo determinado preliminarmente por voltametría cíclica, siendo esta última una de las metodologías útiles en la determinación de mecanismos de reacción146, 147.
5.3.- Determinación de la capacidad antioxidante de ACS.
Con la finalidad de evaluar la labilidad del átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo en las posiciones 4 y 7 de la estructura básica de la cumarina. Se determinó la capacidad de eliminación
47
de radicales centrados en oxígeno (ensayo ORAC-FL) de las ACS hidroxiladas 148. El perfil antioxidante expresado como índice ORAC-FL (Figura 27), permitió ordenar de mayor a menor índice ORAC-FL a los compuestos hidroxilados en estudio como: 3 > 9 > 7 > 5 > 11 ≈ 10.
0 1000 2000 3000 4000 5000 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 F /F0 tiempo (s) Blanco 6,0 uM 4,0 uM 2,0 uM 1,0 uM 0,5 uM A) 0 1 2 3 4 5 6 0 500 1000 1500 2000 2500 ABC NE T A [CAS 3]/ B)
Figura 27.- A) Perfil ORAC-FL para el compuesto 3; B) Área bajo la curva (ABC) en función de la
concentración del compuesto 3.
Los índices de ORAC-FL resultaron similares a los determinados para cumarinas con similitud estructural descritas por Muñoz et al. y Figueroa et al. 22, 41. Sin embargo, estos valores fueron inferiores a lo encontrado para la 4-hidroxicumarina. Lo anterior, debido a la menor labilidad del átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo por la formación de un enlace intramolecular entre la amida sustituyente y el átomo hidrógeno. También se observó que el grupo hidroxilo en posición
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7 disminuye aún más la capacidad de eliminación de radicales centrados en oxígeno posiblemente por la influencia del sustituyente del grupo amida en posición 8 y el anillo aromático de la estructura básica de la cumarina (Tabla 5).
Por otra parte, se determinó la reactividad contra el radical hidroxilo mediante espectroscopía de espín electrónico utilizando la técnica de atrapamiento de espín, a través de la disminución de la intensidad de las señales en el espectro de REE. La generación del radical se llevó a cabo mediante la reacción de Fenton no catalítica utilizando el atrapador de espín DMPO 106.
La figura 28 muestra el espectro de REE donde aparecen cuatro señales anchas correspondientes al blanco (sin adición de ACS hidroxiladas), que asignables a la formación de una mezcla de aductos de espín asignados a: DMPO-OH, DMPO-CH3 y DMPO-O2•- 149, 150. Estos se generaron por la reacción entre el radical hidroxilo y el dimetilsulfóxido usado en la mezcla de solventes.
3440 3460 3480 3500
Campo magnético (G)
Blanco CAS 5
Figura 28.- Espectros de REE para los ensayos de reactividad del blanco (azul) y ACS 5 (rojo), en buffer
fosfato (pH = 7,4) y DMSO.
Se ha encontrado que las intensidades de las señales en el espectro disminuían en presencia de las ACS hidroxiladas. El alto valor del apagamiento de las especies radicalarias resulto mayor a lo esperado en relación con los índice ORAC-FL determinados (Tabla 5). Esto podría estar relacionado con la formación de una especie similar a un ácido hidroxicinámico por apertura de la lactona en medio básico 151.
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Para obtener información del comportamiento antioxidante de las ACS en sistemas biológicos, se determinó la actividad antioxidante celular (AAC) de la serie en estudio en células murinas RAW 264.7 (Figura 29 A). Encontrando que los compuestos hidroxilados mostraron actividad antioxidante celular relacionada de forma directa con la lipofilia (coeficiente de distribución clogD) en el siguiente orden: 9 > 7 > 3> 5 > 11 > 10 (Tabla 5).
Figura 29.- Actividad antioxidante celular del compuesto 3 en la curva de formación ROS RAW 264.7 (A)
expresada como la fluorescencia normalizada frente al tiempo. (B) CAA versus ClogD (teórico), a 10 μM.
Esta relación se invierte para los compuestos no hidroxilados, donde a mayor lipofilia se observa una disminución en la actividad antioxidante (Figura 29 B), posiblemente por una mejor interacción con la membrana celular.
Por otra parte, los compuestos no hidroxilados presentan una actividad antioxidante celular elevada en relación con la serie en estudio. Este comportamiento puede ser explicada por la alta reactividad del enlace doble, para los compuestos que contienen al grupo acroilo. Así como también, la presencia de hidrolasas celulares que rompen el éster cíclico generando un derivado con estructura similar a un ácido hidroxicinámico con mayor capacidad antioxidante. Este efecto parece estar dominado por el tamaño del sustituyente en la amida con excepción de la ACS 9 150, 152.
A partir de estos ensayos se pudo establecer la influencia del grupo hidroxilo en las posiciones 4 y 7 de la estructura básica de la cumarina en la capacidad antioxidante de los compuestos. Encontrando que el grupo hidroxilo no aporta de forma significativa a la capacidad antioxidante de los compuestos en relación con el patrón de sustitución 4-hidroxicumarina. Además, se observó que todos los compuestos presentaron capacidad de disminución de especies radicalarias en medio biológico. Por lo que, se esperaría que las amido cumarinas sustituidas en
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estudio tendrían una actividad tripanocida baja. Se debe considerar que uno de los posibles mecanismos de acción de las cumarinas involucra la generación de especies radicalarias en el parásito que es deficiente en mecanismos antioxidantes endógenos. Por lo que, resulta de interés establecer una relación entre ambas actividades para postular un posible mecanismo de acción de las moléculas en estudio.
Tabla 5: Resultados obtenidos en ensayos de capacidad antioxidante de ACS.
Compuesto Apagamiento de
radicales (%)
Índice ORAC-FL
Actividad antioxidante celular (%) 10 µM 1 µM 1 -- -- 53,02 ± 1,09 46,60 ± 3,88 2 81,1 ± 1,7 0,02 ± 0,01 43,46 ± 1,31 31,76 ± 1,48 3 84,3 ± 1,1 2,19 ± 0,02 39,35 ± 3,13 23,73 ± 2,80 4 -- -- 39,71 ± 2,79 25,40 ± 2,12 5 95,6 ± 1,5 0,65 ± 0,03 34,48 ± 1,88 21,34 ± 2,72 6 -- -- 36,07 ± 1,81 22,12 ± 2,15 7 83,3 ± 2,1 1,06 ± 0,03 42,06 ± 2,46 23,58 ± 2,81 8 -- -- 31,31 ± 1,71 19,63 ± 2,01 9 82,7 ± 1,3 1,86 ± 0,04 70,78 ± 2,69 56,43 ± 1,87 10 83,8 ± 1,1 0,48 ± 0,01 23,37 ± 1,77 11,31 ± 1,42 11 96,6 ± 1,4 0,53 ± 0,02 26,18 ± 1,64 13,19 ± 2,01 4-OH 22 81,2 ± 7,3 4,20 ± 0,11 26,70 ± 2,50 21,90 ± 1,90 Trolox 30,3 ± 1,6 1,00 ± 0,20 25,51 ± 2,32 4,50 ± 0,41
5.4.- Actividad citotóxica y tripanocida de amido cumarinas sustituidas (ACS) frente a macrófagos RAW 264.7 y la forma tripomastigote y epimastigote de T. cruzi Dm28c.
Se realizó un estudio preliminar de la actividad tripanocida de las 11 ACS sobre la forma tripomastigote del parásito Trypanosoma cruzi, para seleccionar los compuestos más activos que se usarán en la formación de complejos de inclusión y estudios de liberación controlada de hidrogeles supramoleculares. Este estadio celular se seleccionó considerando que es la forma infectiva no replicativa del parásito, siendo el causante final de la enfermedad de Chagas 153.
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Adicionalmente, se determinó la citotoxicidad de las ACS en estudio sobre células murinas (RAW 264.7), mediante la determinación de la concentración inhibitoria del 50% de células (IC50, Tabla 6). Como se puede apreciar en la Figura 30, el compuesto 2 presentó la mayor actividad frente la forma tripomastigote del parásito. Siendo esta actividad similar a la de nifurtimox (NFX), cuyo mecanismo de acción tripanocida involucra la generación de metabolitos electrófilos tóxicos y/o especies radicalarias que generan estrés oxidativo en el parásito 154-156. La formación de estas últimas estaría mediada por la reducción reversible del grupo nitro a la correspondiente hidroxilamina 157. Cabe destacar que la 6-NH2-β-CD no presentó actividad citotóxica en el rango de concentración utilizado.
Figura 30.- Porcentaje de viabilidad de tripomastigotes de T. cruzi Dm28c a concentración de 100 µM y 10
µM de ACS y estructura de nifurtimox utilizado como control positivo. Diferencia significativa en comparación con el control (ANOVA de una vía con post-prueba de Dunnett; (***: p> 0,01).
100M
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Nifu rtimo x Con trol 0 50 100 *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** % v ia b il id a d10M
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Con trol 0 50 100 % v ia b ili d a d *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** ***52
La diferencia estructural del compuesto 2 con respecto al NFX, hace interesante el estudio de esta molécula como un agente tripanocida potencial. Como se puede apreciar (Tabla 6), la introducción del grupo hidroxilo en la posición 4 de la estructura básica de la cumarina disminuye significativamente la actividad tripanocida del compuesto 2, similar a lo descrito por Robledo- O’Ryan et al, para una serie de hidroxi-3-aril cumarinas 158. De igual forma esta ACS presentó baja toxicidad en células de mamífero, por lo que resulta interesante el estudio de esta molécula en una relación estructura-actividad.
Tabla 6: Porcentaje de viabilidad de tripomastigotes a 100 y 10 µM de ACS y valor de IC50 sobre células murinas.
Compuesto IC50 RAW 264.7 % de viabilidad sobre tripomastigotes
(Dm28c) 100 µM 10 µM 1 >100 53,66 ± 5,64 62,07 ± 5,07 2 80,12 ± 1,18 12,42 ± 2,28 45,34 ± 4,85 3 >100 34,96 ± 0,72 53,15 ± 7,55 4 >100 51,68 ± 1,81 55,38 ± 1,92 5 >100 47,99 ± 1,75 58,33 ± 6,31 6 >100 33,21 ± 2,20 53,71 ± 0,68 7 83,40 ± 2,26 42,28 ± 2,15 60,80 ± 0,56 8 16,20 ± 1,78 30,18 ± 1,32 57,53 ± 2,25 9 78,04 ± 1,75 31,39 ± 0,85 55,78 ± 1,58 10 62,69 ± 1,05 39,86 ± 4,03 54,10 ± 8,23 11 >100 51,95 ± 1,81 57,61 ± 2,38 NFX >100 17,82 ± 2,52 53,10 ± 3,46
En cuanto a la influencia de la capacidad antioxidante de los compuestos en la actividad tripanocida, no se logró establecer una relación inversa entre la actividad antioxidante celular y la actividad tripanocida (Figura 31) a diferencia de lo descrito en literatura 22, 40, 41, 158. Esto puede ser debido a que el mecanismo de acción tripanocida no solo implique la generación de especies radicarias.
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Figura 31.- Relación entre actividad antioxidante celular y actividad tripanocida contra la forma
tripomastigote de T. cruzi, en presencia de ACS.
Resulta igualmente interesante el estudio de la amido cumarina sustituida 6 que presenta una actividad tripanocida moderada y baja citotoxicidad en células de mamífero. Asimismo, este compuesto presenta en su estructura el grupo tiofeno, este heterociclo es similar al presente en el NFX. La actividad tripanocida del compuesto 8 fue superior a la del compuesto 6, pero el primero presenta una alta toxicidad hacia células murinas, por lo que fue descartado como un posible agente tripanocida, al igual que su análogo hidroxilado. En función de estos resultados se estudió la relación estructura actividad, formación de complejos de inclusión y liberación de hidrogeles supramoleculares de las amido cumarinas sustituidas 2, 3, 6 y 7 (Figura 32).
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La actividad tripanocida determinada fue mayor que lo descrito por Figueroa et al 22, quienes estudiaron compuestos que contienen el grupo cloracetamida en la posición 3 de la estructura básica de la cumarina y el grupo hidroxilo en posición 4. Además, fue posible observar una disminución de la actividad tripanocida en ambas formar celulares por la introducción del grupo hidroxilo, esta relación no fue observada en la actividad contra células mamíferas. Igualmente, la introducción del heterociclo aromático en la estructura disminuyo significativamente la actividad tripanocida en ambos estadios celulares (Tabla 7).
Por otra parte, es posible observar que la actividad sobre la forma tripomastigote fue mayor que sobre la forma epimastigote, potenciando el uso de las ACS como posibles agentes tripanocidas, considerando que la tripomastigote es la forma infectiva y causante de la enfermedad de Chagas. Adicionalmente, se determinaron los índices de selectividad (IS) hacia parásitos de T. cruzi, en los estadios epimastigote y tripomastigote, mediante la determinación del IC50 en ambas formas celulares (Tabla 7).
Tabla 7: IC50 de ACS sobre epimastigotes, tripomastigotes y células murinas e índice de selectividad. ACS IC50 µM RAW 264.7 IC50 µM IC50 µM IS* IS* Epimastigote (Dm28c) Tripomastigote (Dm28c) Epimastigote (Dm28c) Tripomastigote (Dm28c) 2 80,12 ± 1,18 53,21 ± 1,45 21,53 ± 1,21 1,51 3,72 3 >100 64,58 ± 1,42 36,41 ± 2,11 >1,55 >2,75 6 >100 65,26 ± 2,15 52,12 ± 1,71 >1,53 >1,92 7 83,40 ± 2,26 >100 56,92 ± 1,53 <0,83 1,47 NFX >100 10,04 ± 0,22 22,56 ± 1,03 >9,61 >4,43 ** Índice de selectividad: 𝐼𝐶50 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑅𝐴𝑊 264.7 𝐼𝐶50 𝑝𝑎𝑟á𝑠𝑖𝑡𝑜
El compuesto 2 presentó el índice de selectividad más alto de las ACS en estudio en la forma tripomastigote, similar a lo determinado para nifurtimox. Siendo este compuesto una posible base para modificaciones estructurales que permitan disminuir la actividad citotóxica del compuesto.
5.5.- Determinación de especies radicalarias en medio parasitario por REE.
Con la finalidad de establecer un posible mecanismo de acción de las ACS seleccionadas en relación con la generación de estrés oxidativo, se realizó la determinación de especies radicalarias en cultivos de epimasgotes Dm28c de T.cruzi, utilizando el atrapador de espín DMPO
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(óxido de 5,5-dimetil-1-pirrolina). DMPO puede permear las membranas celulares y reaccionar con radicales libres centrados en carbono y oxígeno, generando aductos de espín con mayores tiempos de vida media que las especies radicalarias atrapadas, que pueden ser detectados mediante REE 157, 159, 160. Se utilizó una solución de dimetilsulfóxido (DMSO) como control, sin detectar la generación de especies radicalarias. En este ensayo, los compuestos se usaron a una concentración de 2 mM en DMSO (Figura 33). Los compuestos no hidroxilados (2 y 6) generaron el mismo patrón espectral después de 10 minutos de incubación a 28 ° C. Las constantes de acoplamiento hiperfino (aN = aH ~ 14,86 G) de las señales más intensas son consistentes con la formación del aducto de espin DMPO-OH, generado por el atrapamiento del radical hidroxilo. Del mismo modo, se observó un triplete (aN ~ 15,46 G) correspondiente al compuesto paramagnético (DMPOX, 5,5-dimetil-2-oxo-pirrolin-1-oxilo). Los compuestos hidroxilados (3 y 7) generaron un patrón espectral similar, en donde se observó un cuarteto con contantes de acoplamiento hiperfino de nitrógeno e hidrogeno similar (aN ~ aH ~ 14,87 G), correspondiente al aducto de espin DMPO-OH. Además, se muestra un sexteto correspondiente al atrapamiento de un radical centrado en carbono (aN ~ 16,40 G, aH ~ 23,20 G), como describe Robledo-O'Ryan et al 158.
Adicionalmente, se registró el espectro de REE en presencia de menadiona, una quinona reconocida por la generación de estrés oxidativo, en medios parásitarios (Lapier et al 161 observándose la generación de un triplete correspondiente al aducto de espín DMPOX, que puede ser generado por la oxidación del aducto DMPO-OH. Estos resultados indican que el mecanismo de acción de ACS podría ser la generación de estrés oxidativo en el parásito, por la formación de especies reactivas de oxígeno (EROs). La caracterización de las especies generadas puede ser representada de mejor manera en la Figura 34, en donde se observa el metabolismo de cumarinas en el parásito en presencia de DMPO 133, 157. Estos estudios permiten concluir que La capacidad de generar estrés oxidativo en el parásitos T. cruzi, que es deficiente en mecanismos antioxidantes (enzimáticos y no enzimáticos) en comparación con células de mamíferos, parece ser el mecanismo de acción de las ACS seleccionadas 162.
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3420 3440 3460 3480 3500 Campo Magnético (G) A) B) C) D) + + # # # x x x x # # # +Figura 33.- Espectros de REE de los aductos de espín generados en la forma epimastigote de T. cruzi
(Dm28c) a temperatura ambiente: A) Espectro registrado con los epimastigotes incubados con el compuesto 2 y DMPO; B) Espectro registrado con los epimastigotes incubados con el compuesto 3 y DMPO; C) Espectro registrado con los epimastigotes incubados con menadiona y DMPO; D) Espectro del control (DMSO). El patrón hiperfino correspondiente al aducto de espin DMPO-OH ha sido marcado con (X). El (#) indica el aducto entre un radical centrado en carbono y DMPO y (+) indica el aducto DMPOX.
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Figura 34.- Esquema de generación de especies radicalarias en epimastigotes de T. cruzi, generación de
metabolitos y su interacción con el atrapador de espín DMPO. DMPO-CUM (sexteto de intensidad 1:1:1:1:1:1), DMPO-OH (cuarto de intensidad 1:2:2:1) y DMPOX (tripl ete de intensidad 1:1:1).
5.6.- Determinación de efecto sobre el consumo de oxígeno y potencial de membrana mitocondrial en epimastigotes de T. cruzi, por ACS.
Se ha descrito que la generación de estrés oxidativo en parásitos de T. cruzi se podría asociar a la disfunción mitocondrial. Los parásitos de T. cruzi poseen solo una mitocondria, la cual es fundamental para su supervivencia y regula los procesos relacionados con el balance energético y la modulación de la apoptosis 163-165. Este podría ser el objetivo intracelular de los compuestos en estudio. En este trabajo, se evaluó el metabolismo mitocondrial mediante el efecto sobre el consumo de oxígeno y variación del potencial de membrana mitocondrial, por la adición de ACS. El consumo de O2, es un paso importante de la fosforilación oxidativa dentro de la matriz mitocondrial. Las variaciones del consumo de oxígeno son indicativas de disfunciones en este organelo, las cuales podrían estar relacionadas a la inhibición de la enzima GAPDH (Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa), la cual ha sido descrita para cumarinas de origen natural 35, 44, 166.
Los estudios realizados indicaron que no hubo alteración en el consumo de oxígeno de los epimastigotes demostrando que no existe efecto sobre la matriz mitocondrial lo permite postular
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en primera instancia, que el mecanismo de acción de los compuestos no se relaciona directamente con la disfunción mitocondrial en los parásitos.
También se estudió el efecto de las ACS sobre el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) en epimastigotes Dm28c. El ΔΨm es relevante para la producción de ATP por el complejo ATP sintasa, también está implicado en el transporte de proteínas dentro de este organelo y en la regulación del proceso de glicólisis. Las variaciones de este potencial se asocian a un ciclo de retroalimentación ineficiente de la cadena transportadora de electrones, incrementos en la fuga de electrones y sobreproducción de especies reactivas de oxígeno. Además, las variaciones en el ΔΨm se suelen utilizar como un marcador temprano de muerte celular programada de mamíferos y protozoos. 37, 41, 121, 122, 163, 167-169
La figura 35 muestra la disminución de la intensidad de la fluorescencia de la sonda TMRE indicativa de variaciones en el potencial de membrana mitocondrial. Para las ACS seleccionadas, se observaron efectos menores sobre el potencial de membrana que para el agente desacoplante CCCP y lo encontrado por Muñoz et al41, para una serie de 3-carboxiamida cumarinas. En función a estos resultados, se postula que existe un efecto sobre la función mitocondrial, que podría asociarse a la generación de estrés oxidativo en los parásitos de T. cruzi, tal como se demostró mediante REE. Sin embargo, los resultados obtenidos mediante oxigrafía denotan que no existe un efecto pronunciado de las ACS sobre este organelo, ya que no se evidenciaron diferencias estadísticamente significativas. Esto último podría estar relacionado con la capacidad de los compuestos de permear la membrana celular y alcanzar el objetivo intracelular.
CON TROL CC CP CA S 2 CA S 3 CA S 6 CA S 7 0 20 40 60 80 100 *** F /F0 d e T M R E
Figura 35.- Porcentaje de incorporación a la mitocondrial de la sonda fluorescente TMRE 50 mM, utilizando
CCCP como control positivo. Los resultados son expresados como el promedio ± SD de tres experimentos independientes. Diferencia significativa en comparación con el control (ANOVA de una vía con post-prueba de Dunnett; (***: p> 0.01).