DIHIDROFOLATO REDUCTASA

Una vez dentro de la célula, el folato se convierte en sus formas activas mediante dos reducciones sucesivas de la parte pirazina del anillo de pteridina. Ambas reacciones son catalizadas por la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) que utiliza como cofactor NADPH. La primera reducción da lugar a 7,8-dihidrofolato (DHF) y la segunda reducción genera 5,6,7,8-tetrahidrofolato (THF)

(Figura 1.25). Aunque la DHFR puede actuar sobre el folato o sobre el DHF, el sustrato preferido de la enzima es el DHF, de ahí su nombre.

Como se describió con anterioridad, la función coenzimática del THF es fundamental para el metabolismo nitrogenado de la célula, lo que hace que la inhibición de la DHFR sea crítica al provocar un bloqueo de la síntesis, la metilación y la reparación del ADN que conlleva a la muerte celular por apoptosis. Esto hace que esta enzima sea muy interesante como diana farmacológica, no sólo frente a células tumorales, sino también frente a hongos, protozoos, bacterias o células responsables de procesos autoinmunes (Blakley, 1969). De hecho, esta enzima es la diana de los fármacos conocidos como antifolatos.

1.3.2.1. Mecanismo de acción

Tanto la cinética como el mecanismo de acción de la DHFR han sido estudiados en profundidad utilizando enzima proveniente de diversas fuentes biológicas. Uno de los estudios pioneros en esta caracterización fue llevado a cabo por el grupo del Profesor Benkovic (Fierke et al., 1987), quien propuso un esquema catalítico completo para la actuación de la DHFR de Escherichia coli (ecDHFR) (Figura 1.26). Según este modelo, la unión del sustrato (DHF) al holoenzima (E:NADPH), conduciría a la formación del complejo ternario de Michaelis (E:DHF:NADPH) el cual, tras la transferencia del ión hidruro, formaría el complejo ternario de productos (E:THF:NADP+). La disociación del cofactor oxidado conduce a la formación del complejo binario del producto (E:THF) el cual vuelve a unir NADPH para formar el complejo de liberación del producto (E:THF:NADPH) donde la entrada de

THF DHF Ácido fólico DHFR DHFR Antifolatos

Ácido fólico

THF

DHF

DHFR

DHFR

Antifolatos

NADPH favorece la liberación de THF. Así, la forma libre de la enzima no se genera durante la reacción y el complejo E:NADPH comienza un nuevo ciclo catalítico. A pesar de que el evento químico fundamental es la transferencia del hidruro desde el NADPH al DHF, este paso no es la etapa limitante de la reacción. La etapa limitante es un proceso físico, la entrada del NADPH que facilita la liberación de THF.

En la actualidad existen discrepancias sobre la procedencia del protón transferido al N5 del grupo de la pterina en el DHF durante la reacción de la DHFR. Un residuo de ácido aspártico (Asp-27) en las enzimas bacterianas y uno de ácido glutámico (Glu-30) en las animales son los únicos grupos ionizables en el centro activo de la enzima y, por lo tanto, capaces de donar un protón al sustrato. Estudios de mutagénesis dirigida de este residuo en la DHFR bacteriana parecen apoyar esta función catalítica del Asp-27 (Howell et al., 1986). La velocidad de transferencia del protón es dependiente del pH, con un pKa de 6.5, el cual ha sido atribuido al Asp-27. Este alto valor de pKa para este residuo de aspartato parece estar relacionado con el entorno que rodea a este residuo en el centro activo de la enzima. Sin embargo, otros autores discrepan sobre el hecho de que la procedencia del protón pueda ser el Asp-27 o el Glu-30, ya que estos residuos se sitúan a más de 5 Å del N5 del DHF, lo que imposibilitaría la transferencia directa de estos protones. Según estos autores la transferencia del protón sería directa a través del disolvente (Chen et al., 1994). Este último mecanismo también ha sido apoyado por estudios basados en cálculos teóricos (Rod y Brooks, 2003).

Las DHFRs eucariotas presentan ciertas diferencias respecto a su ciclo catalítico. Por ejemplo, en la enzima humana (hDHFR) las velocidades de disociación del THF y del NADP+ del complejo ternario son similares, lo que hace que sean posibles dos rutas de liberación de producto. Si se disocia primero el NADP+, queda el complejo binario E:THF. Dado que la liberación del THF es mucho más rápida cuando se une el NADPH, una nueva molécula de NADPH forma el complejo ternario mixto. La velocidad de reacción en este caso se encuentra limitada parcialmente por la liberación del NADP+ y del THF del complejo ternario mixto y aumenta al aumentar la concentración de NADPH. Pero si se disocia primero el THF del complejo ternario de productos, se genera el complejo binario E:NADP+, el cual puede unir DHF formando el complejo ternario mixto E:NADP+:DHF, para el cual la liberación del NADP+ es lenta y limitante de velocidad, por lo que a este complejo ternario se le considera un complejo sin salida. Sin embargo, a bajas concentraciones de DHF, puede disociarse el NADP+ del complejo E:NADP+, y el flujo a través de esta ruta es potencialmente más rápido que a través del complejo E:NADP+:DHF. Cuando la concentración de DHF es muy baja, su unión para la formación del

complejo E:NADPH:DHF es la etapa limitante por lo que el flujo a través de esta ruta viene dictado principalmente por la concentración de DHF. Pero aún en condiciones óptimas la kcat de esta ruta es nueve veces inferior a la de la ruta en la que se disocia primero el NADP+.

1.3.2.2. Estructura de la DHFR

La gran importancia biológica de la DHFR en la producción de nuevos fármacos ha hecho que se desarrollen múltiples estudios estructurales sobre esta enzima. La DHFR ha sido aislada y purificada de múltiples organismos, desde humanos hasta bacterias. Su estructura cristalina, en la mayoría de los casos, ha sido resuelta por difracción de rayos X, existiendo más de 40 estructuras en la base de datos del Protein Data Bank (Schnell et al., 2004).

Los primeros estudios de cristalización se realizaron con la ecDHFR, que es una proteína pequeña (18 kDa) con una estructura constituida por 8 láminas  (denominadas A-H) y 4 hélices α (denominadas αB, αC, αE, y αF) conectadas entre sí por bucles o loops (Figura 1.27). La hendidura del centro activo divide a esta estructura en dos dominios estructurales: el dominio de unión a la adenosina y el dominio principal.

El dominio de unión a la adenosina (correspondiente a los residuos 38-88 en ecDHFR) es el más pequeño de los dos y constituye el sitio de unión para la cadena de adenosina del NADPH. El dominio principal está formado por los residuos 1-37 y 89-159 y contiene un total de tres bucles donde se sitúa la región de unión a los ligandos alrededor del centro activo. Estos bucles constituyen el 40-50% de la longitud total del dominio principal, por lo que también es conocido como el “dominio bucle”. Estos bucles se denominan bucle Met20 (residuos 9-24), F-G (residuos 116-132) y G-H (residuos 142- 150). Los bucles Met20 y F-G también son denominados bucles 1 y 2, respectivamente, por otros autores. El libre giro alrededor de los residuos Lys-38 y Val-88 permite al dominio de unión a la

Met20 loop F-G loop G-H loop NADP+ Folato Lys38 Val88 Dominio de unión a adenosina Dominio principal

Figura 1.27. Estructura tridimensional de la enzima DHFR unida a NADP+ y al ácido fólico mostrando sus distintos dominios, así como los distintos loops y los aminoácidos más relevantes para su estructura y función.

adenosina moverse relativamente sobre el dominio principal una vez que se han unido los ligandos, lo que permite cerrar la entrada al centro activo (Bystroff y Kraut, 1991; Schnell et al., 2004). Las DHFRs animales poseen entre 20 y 30 residuos más que las bacterianas, los cuales se reparten en nueve inserciones a lo largo de la secuencia primaria de la proteína y se sitúan, en su mayoría, en bucles alejados del centro activo.

1.3.2.3. El centro activo de la DHFR y su movimiento durante el ciclo catalítico

El centro activo del enzima está localizado en una hendidura hidrofóbica situada en la zona de unión entre los dos dominios, con los residuos Lys38 y Val88 actuando como bisagra entre ambos. En el complejo ternario con NADPH y ácido fólico, el anillo de pterina del sustrato y el anillo de nicotinamida del cofactor están muy próximos, con el átomo donador (C4 del NADPH) y aceptor del protón (C6 del anillo de pterina) a distancias óptimas para interacciones de Van der Waals (Bystroff y Kraut, 1991). El bucle Met20 protege al centro activo de su interacción con el disolvente y es el principal componente estructural que determina la estructura del centro activo. Los bucles F-G y G-H juegan un papel estabilizador de la estructura gracias a su interacción mediante puentes de hidrógeno con el bucle Met20.

En base a estudios de rayos X realizados con ecDHFR, libre y unida a varios ligandos, Sawaya y Kraut propusieron un modelo estructural para los cambios conformacionales que ocurren durante el ciclo catalítico. El factor determinante para que la enzima se encuentre en una u otra conformación es la unión de los sustratos y/o el cofactor al centro activo de ésta (Sawaya y Kraut, 1997). Este modelo sugiere que el loop Met20 adopta una conformación cerrada cuando el anillo de nicotinamida del NADPH está localizado en el centro activo, es decir en el holoenzima (E:NADPH) y en el complejo de Michaelis (E:NADPH:DHF). Tras la transferencia del ión hidruro, el anillo de nicotinamida sería excluido del bolsillo de unión debido a un choque estérico con el anillo de pterina del THF, de manera que el resto de los complejos del ciclo catalítico (E:NADP+:THF, E:THF y E:NADPH:THF) adoptarían una conformación ocluida (Figura 1.28). Además de estas dos conformaciones, se ha descrito que la enzima puede adoptar las conformaciones abierta y desordenada, pero éstas serían estados intermedios entre las conformaciones cerrada y ocluida que no se generarían durante el ciclo catalítico de la enzima.

Las conformaciones cerrada y ocluida difieren en la estructura que adopta el bucle Met20 y en las interacciones por puentes de hidrógeno entre el bucle Met20 y los bucles F-G y G-H (Figura 1.28). En el estado ocluido, la zona central del bucle Met20 forma una hélice con los residuos Met-16 y Glu- 17 ocupando el centro activo de la enzima, donde obstruyen la unión del anillo de la nicotinamida del cofactor (Sawaya y Kraut, 1997). Además, la conformación ocluida se estabiliza por puentes de hidrógeno entre Asn-23 en el bucle Met20 y Ser-148 en el bucle G-H. Por el contrario, en la conformación cerrada, los residuos Met-16 y Glu-17 se encuentran fuera del centro activo, permitiéndose, así, la unión del cofactor a la enzima. Además, las cadenas de Asn-18 y Met-20 permiten la estabilización del complejo ternario y las interacciones entre Asn-23/Ser-148 se rompen, generándose nuevas interacciones entre el Asp-122 del bucle F-G y dos residuos (Gly-15 y Glu-17) del bucle Met20. De esta manera, este cambio entre las distintas conformaciones modularía la actividad de la enzima, así como su unión a sustratos, cofactores y productos.

1.3.2.4. El gen de la DHFR

El gen de la DHFR (DHFR) está localizado en el cromosoma 5q11.2-q13.2, tiene una longitud total de 30 kb y contiene 6 exones separados por 5 intrones (Chen et al., 1984). Debido a la importancia de este gen para el funcionamiento general del organismo, son pocas las variaciones y mutaciones encontradas en él ya que, probablemente, cualquier mutación llevaría a la inviabilidad del organismo. Este gen ha sido objeto de estudio debido a que se encuentra frecuentemente amplificado en células que presentan una alta resistencia a los antifolatos (Göker et al., 1995; Lesuffleur et al., 1991; Singer et al., 2000). Goker y colaboradores (1995) demostraron que la amplificación de la DHFR es responsable de la resistencia a MTX en pacientes con leucemia linfoblástica aguda (ALL) y que esta amplificación estaba asociada a mutaciones en el gen TP53. Además, Srimatkandada y colaboradores describieron, en células de cáncer de colon resistentes a MTX, la amplificación de una variante del gen de la DHFR que presentaba una sustitución de fenilalanina por serina en la posición 91 que originaba una enzima con una afinidad por el MTX unas 25 veces inferior a la enzima nativa (Srimatkandada et al., 1989).