ENSAYOS DE VIABILIDAD CELULAR

3.2.1.1. Ensayo con azul tripán

El azul tripán (diamina azul o azul Niágara) es un colorante azoico derivado de la toluidina utilizado para ensayos de viabilidad celular puesto que se trata de un colorante vital que permite diferenciar células vivas de células muertas. Con esta tinción, las células vivas no se colorean debido a que la membrana celular es selectiva respecto a qué compuestos pueden atravesarla. De esta manera, el azul tripán no penetra en las células viables con la membrana intacta, mientras que este colorante si es capaz de atravesar la membrana de las células muertas. Por lo tanto, las células muertas se tiñen con un distintivo color azul, mientras que las células vivas aparecen refringentes y sin colorear bajo el microscopio. Sin embargo, hay que tener en cuenta que este método no permite diferenciar entre células muertas por necrosis o por apoptosis. Debido a que las células vivas excluyen el colorante y no se tiñen, este método también se denomina método de tinción por exclusión.

El procedimiento general para realizar un recuento con azul tripán consiste en mezclar volúmenes iguales de la suspensión celular que se desea contar y de una disolución de azul tripán al 0.4%, aunque también se puede recurrir a otras diluciones de la suspensión celular siempre y cuando se tenga en cuenta el factor de dilución correspondiente en los cálculos finales. Una vez teñida con azul tripán, la suspensión celular se homogeniza y puede ser sometida a recuento. Durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral, los recuentos se realizaron utilizando un hemocitómetro o cámara de Neubauer, o bien utilizando el contador de células automático TC10 de Bio-Rad Laboratories.

Hemocitómetro o Cámara de Neubauer

El hemocitómetro es un portaobjetos especializado en cuya parte central presenta una ligera depresión grabada con una retícula cuadrangular (Figura 3.5). Esta retícula tiene unas dimensiones de 3 mm x 3 mm y está dividida a su vez en 9 cuadros de 1 mm2 (cuadro rojo) cada uno. Los cuatro cuadros localizados en las esquinas de esta cámara se dividen, a su vez, en 16 cuadros (cuadro azul) de 0.0625 mm2. Sobre la parte central de la cámara se coloca un cubreobjetos de cristal de 22 mm x 22 mm y se introduce (por capilaridad y con ayuda de una pipeta) un volumen de la suspensión celular teñida con azul tripán entre el cubreobjetos y la cámara. Puesto que el espacio que queda entre el cubreobjetos y la cámara es de 0.1 mm de altura y las dimensiones de los cuadros grabados en la cámara también son conocidas, tanto el volumen de líquido contenido entre el hemocitómetro y el cubreobjetos, como el volumen en cada uno de los cuadros que componen la cuadrícula son conocidos. Esto permite el cálculo del número de células por unidad de volumen (concentración) de la suspensión celular de partida, teniendo en cuenta el factor de dilución con el azul tripán.

Para los ensayos de viabilidad realizados durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral, se observó la cámara bajo el microscopio óptico y se realizó un recuento del número de células vivas (sin colorear y refringentes) y muertas (teñidas de azul) en cada uno de los cuatro cuadrados de 1 mm2 localizados en las esquinas de la cámara y se realizó un promedio entre los cuatro cuadros.

El número de células viables, de células muertas y de células totales por mililitro de la suspensión celular de partida se calculó de la siguiente forma:

En las ecuaciones anteriores, el número promedio de células por cuadro se multiplica por 10 000 ya que el volumen correspondiente a la región contada en la cámara es de 0.1 mm3 (1 mm de lado x 1 mm de lado x 0.1 mm de altura). De esta manera, para obtener el número de células contenidas en 1 mL a partir del número de células contenidas en 0.1 mm3 (= 0.1 µL) hay que multiplicar por 10 000. FD hace referencia al factor de dilución de la suspensión celular en azul tripán.

Para estimar el porcentaje de viabilidad celular se utilizó la siguiente ecuación:

La cámara de Neubauer permite una estimación de la viabilidad cuando la suspensión celular tiene una concentración de entre 2.5x105 y 2.5x106 células/mL, siendo la concentración óptima de 1x106 células/mL. Por debajo de 2.5x105 células/mL la cantidad de células no es suficiente para poder dar una estimación real de la concentración y, por encima de 2.5x106 células/mL el número de células es tan grande que la probabilidad de cometer errores de conteo es demasiado alta y conviene diluir más la muestra para acercar la concentración al rango óptimo.

Contador de células automático TC10 de Bio-Rad

Para realizar un ensayo de viabilidad celular utilizando el contador de células automático TC10 se introducen 10 µL de la mezcla de suspensión celular y azul tripán en una cámara de plástico especial y ésta se inserta en el contador. El software del instrumento autoenfoca y realiza un recuento utilizando un análisis de múltiples planos focales para determinar la viabilidad celular con una elevada precisión.

Portaobjetos

Cubreobjetos Cámara con 0.1 mm _{de profundidad}

1 mm

A B

C D

Figura 3.5. Imagen y esquema de la Cámara de Neubauer utilizada para realizar los recuentos celulares, mostrando los distintos cuadrantes de los que consta, así como una imagen al microscopio óptico de un recuento con azul tripán.

El contador detecta automáticamente la presencia de azul tripán en la muestra y realiza los cálculos por defecto teniendo en cuenta una dilución 1/2 de la muestra en azul tripán. Si la dilución de la muestra es distinta se deben realizar los cálculos pertinentes para determinar la concentración real de la muestra, o bien cambiar los parámetros de dilución en el aparato antes del recuento. Este contador permite realizar recuentos de células con un diámetro comprendido entre 6 y 50 µm en un rango de concentración entre 5x104 y 1x107 células/mL.

Este contador proporciona un recuento de células totales y de células vivas por mililitro, así como el porcentaje de viabilidad celular. Además, proporciona una imagen a distintos aumentos de las células que han sido contadas y un histograma que indica la distribución de células vivas y muertas en función del tamaño.

3.2.1.2. Ensayo con MTT

El ensayo con MTT es un método colorimétrico sensible y cuantitativo que permite medir la viabilidad y la proliferación celular. Se basa en la capacidad de la enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa de las células vivas para convertir un sustrato denominado bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio (MTT), de color amarillo y soluble en agua, en su forma formazano, de color azul-morado e insoluble en agua. Este producto forma cristales insolubles en agua que no pueden atravesar la membrana plasmática y quedan retenidos en el interior de las células. Para liberar este producto, es necesario solubilizar las células, utilizando disolventes orgánicos (DMSO, isopropanol-HCl o etanol), antes de realizar la colorimetría. La cantidad de formazano producida se puede medir por colorimetría y es directamente proporcional al número de células (en un rango de concentración). La capacidad de las células para reducir el MTT es un índice de la integridad y actividad de las mitocondrias, por lo que los resultados pueden ser interpretados como una medida de la viabilidad y/o número de células (Figura 3.7).

Figura 3.6. (A) Contador de células automático TC10 junto al reactivo azul tripán y un portaobjetos especializado de recuento. (B) Esquema del análisis de múltiples planos focales realizado por el contador TC10 durante el recuento. (C) Captura de pantalla de un recuento celular con azul tripán. (D) Captura de pantalla de la imagen de las células en la cámara proporcionada por el contador. (E) Captura de pantalla del histograma, proporcionado por el contador, indicando el número de células vivas (línea roja) y muertas (línea verde) frente a su diámetro en un recuento con azul tripán.

Durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral se realizaron ensayos con MTT para la elaboración de las curvas de crecimiento de cada una de las líneas celulares utilizadas. Para ello, se sembraron placas con cantidades crecientes de células y se cuantificó mediante MTT el aumento del número de células con el tiempo. El ensayo con MTT también se utilizó para la realización de ensayos de citotoxicidad. En estos ensayos se determinó la capacidad para reducir MTT a formazano de células sometidas a distintos tratamientos en comparación con células en una situación control.

Procedimiento:

Para la realización de los ensayos con MTT en placas de 96 pocillos se prepararon 5 mL de una disolución madre de MTT (5 mg/mL) en medio de cultivo sin rojo fenol y sin suplementos por cada placa incluida en el ensayo. Se filtró esta disolución a través de un filtro de 0.22 µm para esterilizarla y para eliminar los residuos insolubles. Esta disolución filtrada se puede guardar a 4°C y protegida de la luz durante aproximadamente un mes. A continuación, se retiró el medio de cultivo de la placa de 96 pocillos que contiene las células sometidas a las condiciones deseadas y se añadieron 200 µL/pocillo de medio fresco sin rojo fenol y 50 µL/pocillo de la disolución madre de MTT. Las placas se protegieron de la luz cubriéndolas con papel de aluminio, se agitaron orbitalmente y se incubaron a 37°C durante 2-4 horas (dependiendo de la línea celular). Pasado el tiempo de incubación, se retiró el medio de cultivo con MTT y se añadieron 100 µL de DMSO para solubilizar los cristales de formazano. Se agitó la placa durante 10 minutos y se midió la absorbancia a 570 nm utilizando la absorbancia a 690 nm como referencia para el plástico de la placa. Durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral la medida de la absorbancia en los ensayos con MTT se realizó utilizando un lector de placas FLUOstar Omega (BMG Labtech).

3.2.1.3. Ensayo con XTT

Es un método colorimétrico similar al MTT que emplea una sal de tetrazolio distinta. Este ensayo se basa en la capacidad de la enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa de las células metabólicamente activas para convertir el 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2-H-tetrazolio-5- carboxanilida (XTT), de color amarillo, en un derivado formazano de color naranja que, en este caso, es soluble en agua. Aunque la biorreducción del XTT es menos eficaz que la del MTT, se consiguen resultados similares realizando el ensayo en presencia de menadiona (Vitamina K3) que actúa sobre la cadena de transporte electrónico mitocondrial. La principal ventaja que presenta este método es que, dado que el producto final es soluble en agua, no es necesario utilizar agentes como el DMSO para romper las células y solubilizarlo, por lo que se pueden recuperar las células después del ensayo. Además el XTT es menos tóxico que el MTT. Éste ensayo permite valorar la proliferación celular y la citotoxicidad de compuestos en líneas celulares no adherentes, en las que no es posible realizar el ensayo MTT puesto que crecen en suspensión y no se puede retirar el medio de cultivo de la placa (Figura 3.7).

Procedimiento:

Para la realización de los ensayos con XTT en placas de 96 pocillos se prepararon 5 mL de una disolución madre de de XTT (1 mg/mL) en medio de cultivo sin rojo fenol y sin suplementos y una disolución de menadiona (10 mM) en acetona. Para preparar la disolución de trabajo se añadieron 10 µL de esta disolución de menadiona por cada mL de disolución de XTT. Por cada placa de 96 pocillos se prepararon 5 mL de disolución de XTT/Menadiona.

Se añadieron 50 µL/pocillo de la disolución de XTT/Menadiona a cada pocillo de la placa que previamente contenía 200 µL de medio. La placa se agitó orbitalmente, se protegió de la luz con papel de aluminio y se incubó a 37°C durante 4 horas. Pasado el tiempo de incubación, se agitó la placa y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando la absorbancia a 570 nm como referencia para el plástico de la placa. Durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral, la medida de la absorbancia en los ensayos con MTT se realizó utilizando un lector de placas FLUOstar Omega (BMG Labtech).