MEDIDA DE LA ACTIVIDAD PP2A

La proteína fosfatasa 2A (PP2A) cataliza la eliminación de grupos fosfato unidos a aminoácidos serina o treonina de un amplio rango de fosfoproteínas. Esta serín-treonín fosfatasa tiene un papel esencial en el control de la homeostasis celular ya que regula procesos tan diversos como el metabolismo, la transcripción de genes, la progresión en el ciclo celular o el desarrollo embrionario, a través de la regulación negativa de muchas de las cascadas de señalización desencadenadas por quinasas. Puesto que muchos cánceres se caracterizan por la actividad aberrante de quinasas oncogénicas, la PP2A ha sido considerada como un potencial supresor tumoral. Esta proteína fosfatasa presenta una estructura trimérica que puede presentar varias formas, pero siempre consta de una subunidad catalítica (subunidad C), asociada a una subunidad reguladora (subunidad A). Este complejo se asocia además a una tercera subunidad variable (subunidad B), que confiere distintas propiedades al holoenzima. Puesto que diversos estudios han puesto de manifiesto que esta proteína es activada por metilación de su subunidad catalítica, durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral analizamos el efecto del tratamiento con MTX (que tiene un efecto desmetilante) sobre la actividad de esta proteína. Los ensayos de actividad PP2A se llevaron a cabo utilizando el Kit PP2A Immunoprecipitation Phosphatase Assay (Upstate Biotechnology) que permite la detección de la actividad PP2A a partir de la medida del fosfato inorgánico liberado por la acción de la enzima sobre un fosfopéptido sintético (K-R-p-T-I-R-R). En este ensayo, la cantidad de fosfato libre se determina a partir de la reacción del fosfato inorgánico presente en la muestra con el reactivo Verde Malaquita para formar un compuesto de color verde que puede ser cuantificado espectrofotométricamente. Procedimiento:

Elaboración de la recta de calibrado

En primer lugar se obtuvo la recta de calibrado mediante la preparación de una serie de disoluciones de concentración de fosfato creciente a partir de una disolución estándar de fosfato (0.1 mM) proporcionada por el proveedor. Se transfirieron 25 µL de cada una de estas disoluciones a pocillos de una placa de microtitulación proporcionada por el proveedor y se adicionaron 100 µL de la solución de verde malaquita a cada pocillo con cuidado de no formar burbujas. La placa se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente para permitir el desarrollo de color y se midió la absorbancia a 630 nm en un lector de placas utilizando agua Milli Q como blanco. Los volúmenes de fosfato estándar y de agua Milli Q, así como la cantidad de fosfato presente en 25 µL de disolución se detallan en la siguiente tabla:

Volumen (µL) fosfato estándar (0.1 mM) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Volumen (µL) de agua milli Q 250 230 210 190 170 150 130 110 90 70 50 pmoles de fosfato/ 25 µL de disolución 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

La recta patrón, obtenida de la representación de la absorbancia a 630 nm frente a los pmoles de fosfato, se muestra en la figura 3.28.

Preparación de la solución de Verde Malaquita para la detección de fosfato

Para preparar la solución de Verde Malaquita para la detección de fosfato inorgánico, se añadieron 10 µL de disolución B por cada mililitro de disolución A del kit. Se requieren 100 µL de esta mezcla por cada pocillo de la placa de microtitulación. La solución de verde malaquita se puede mantener a temperatura ambiente durante su utilización, pero se debe preparar solamente la cantidad requerida para cada ensayo.

Preparación de los lisados celulares

Las células se sembraron en frascos de cultivo de 75 cm2 y se sometieron al tratamiento con MTX a las concentraciones y tiempos correspondientes en cada ensayo. Se retiró el medio de cultivo y las células se recogieron mediante raspado en 750 µL de tampón de extracción de fosfatasa (imidazol-HCl 20 mM, EDTA 2 mM, EGTA 2 mM, pH 7.0, conteniendo 10 µg/mL de aprotinina, leupeptina, antipaína, inhibidor de tripsina de soja, benzamidina 1 mM y PMSF 1 mM). La suspensión celular resultante se sometió a sonicación mediante 4 pulsos on/off de 10 segundos en hielo. Los extractos se centrifugaron a 2 000xg durante 5 minutos a 4°C y los sobrenadantes fueron transferidos a un nuevo tubo eppendorf estéril y mantenidos en hielo hasta la realización del ensayo de actividad PP2A.

Ensayo enzimático de actividad PP2A

En primer lugar, se cuantificó la cantidad de proteína presente en cada muestra mediante la técnica de Bradford. A continuación, se realizó una inmunoprecipitación de la PP2A presente en las muestras. Para ello, se tomó, de cada muestra, el volumen correspondiente a 800 µg de proteína y se adicionaron 5 µL de anticuerpo frente a PP2A y 30 µL de suspensión de proteína A-agarosa. Además, se añadió a cada muestra el volumen correspondiente de pNPP Ser/Thr Assay Buffer (proporcionado

y = 0,0006x + 0,1191 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 0 400 800 1200 1600 2000 2400 A b sor b an ci a a 630 n m pmoles de fosfato

Recta patrón de fosfato

Diluciones

por el kit) hasta alcanzar un volumen final de 500 µL. Las muestras se incubaron durante 2 horas a 4°C con rotación vertical. Una vez finalizada la incubación, las muestras se lavaron 3 veces con 700 µL de TBS y una última vez con 500 µL de pNPP Ser/Thr Assay Buffer. Tras cada lavado, se sedimentaron las microesferas de agarosa mediante centrifugación a 1 200 rpm durante 5 minutos y se volvieron a resuspender de nuevo en tampón de lavado agitando con el vórtex. Por último, se adicionaron a cada muestra 60 µL de fosfopéptido y 20 µL de pNPP Ser/Thr Assay Buffer (ambos proporcionados por el kit) y se incubaron a 30°C durante 1 hora para permitir la actuación de la enzima PP2A presente en las muestras sobre el fosfopéptido para liberar fosfato inorgánico. Pasado este tiempo de incubación, se transfirieron 25 µL de cada muestra a pocillos de una placa de microtitulación y se adicionaron 100 µL de la solución de Verde Malaquita a cada pocillo con cuidado de no formar burbujas. Esta placa se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente para permitir la reacción del fosfato libre presente en las muestras con el reactivo Verde Malaquita para dar un compuesto de color verde. Por último, se midió la absorbancia a 630 nm y se calculó la cantidad de fosfato presente en cada muestra mediante interpolación en la recta de calibrado. Tanto el tampón de extracción de fosfatasa, como el TBS se prepararon utilizando agua Milli-Q para evitar introducir fosfato exógeno en las muestras. Antes de realizar los ensayos, se comprobó que tanto el agua como los tampones y las muestras estaban libres de fosfato contaminante, mediante la adición de 100 µL de solución de Verde Malaquita a las correspondientes alícuotas de los mismos.