INMUNOHISTOQUÍMICA E INMUNOHISTOFLUORESCENCIA

La inmunohistoquímica (IHQ) es una técnica que permite la detección de un antígeno en secciones de tejidos gracias al uso de anticuerpos dirigidos específicamente frente a dichos antígenos. Para poder visualizar la unión antígeno-anticuerpo se utilizan anticuerpos marcados por su unión a enzimas como la peroxidasa que, al actuar sobre ciertos sustratos, da lugar a un producto coloreado. Una variante de esta técnica es la inmunohistofluorescencia (IHF) que utiliza anticuerpos marcados con fluorocromos para la detección de antígenos en dichas secciones de tejidos. Tanto la IHQ como la IHF se pueden llevar a cabo mediante un método directo o mediante un método indirecto. En el caso del método directo, el anticuerpo específico frente al antígeno que se desea detectar está unido directamente a una enzima o bien a un fluorocromo. En el método indirecto, el anticuerpo dirigido frente al antígeno que se desea detectar (anticuerpo primario) no está marcado, sino que se emplea un segundo anticuerpo, dirigido específicamente frente al primer anticuerpo, que está marcado por su unión a una enzima o a un fluorocromo (anticuerpo secundario). Existen diversas estrategias que permiten amplificar la señal de estos métodos indirectos basadas en la gran afinidad que presentan la estreptavidina (de Streptomyces avidinii) o la avidina (del huevo) por la vitamina biotina. Estos métodos, utilizan un anticuerpo secundario biotinilado y unos complejos formados por la unión de estreptavidina o avidina a la enzima peroxidasa, de manera que se consigue que, por cada unión antígeno-anticuerpo primario-anticuerpo secundario, haya múltiples moléculas de peroxidasa, lográndose un considerable aumento de la sensibilidad de detección del antígeno.

Durante la realización de esta Tesis Doctoral, se realizó IHQ e IHF de muestras histológicas mediante el método indirecto, utilizando anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa y con fluorocromos respectivamente (Figura 3.14).

Fluorescencia Fluorocromo Anticuerpo secundario Anticuerpo primario Proteínas celulares Inmunohistofluorescencia indirecta Célula/Tejido Producto coloreado DAB Peroxidasa Anticuerpo secundario Anticuerpo

primario Proteínas _celulares

Inmunohistoquímica indirecta

Célula/Tejido

Luz

Procedimiento:

Fijación, inclusión en parafina y corte de las muestras de tejido

En primer lugar, las muestras de tejido fresco de sometieron a fijación con formaldehido al 10% durante, al menos, 12 horas para mantener su morfología y composición lo más parecidas posible al estado in vivo. Esto se logra gracias a que el fijador provoca la generación de enlaces cruzados entre proteínas, lo que mantiene las estructuras celulares e inactiva ciertas enzimas celulares que, de otra manera, iniciarían la autolisis y la degeneración post mortem. A continuación, las muestras de tejido fijado se sometieron a deshidratación mediante una serie de pases por alcohol etílico de concentración creciente (un pase de 1 hora en etanol 50°, un pase de 1 hora en etanol 70°, dos pases de 1 hora en etanol 96°, dos pases de 1 hora en etanol 100°). Tras la deshidratación, se procedió al aclaramiento de las muestras mediante dos pases de 1 hora en sustitutivo de xilol, con el objetivo de embeberlas en una sustancia miscible con la parafina. A continuación, se realizó un pase más de 1-2 horas en una mezcla de parafina líquida y sustitutivo de xilol al 50%. P

or último, las muestras se incluyeron en parafina mediante dos pases, de 4 y 6 horas de duración, en parafina líquida en la estufa a 57-60°C. Durante este proceso, la parafina penetra en los espacios inter e intracelulares, embebiendo todo el tejido para facilitar la posterior obtención de cortes. Para la generación de bloques, las piezas de tejido embebidas en parafina se colocaron en un molde rectangular que contenía parafina fundida y se dejaron enfriar. Una vez obtenidos los bloques, se realizaron secciones de 5 µm de espesor utilizando un micrótomo Leica RM2155 (Leica Microsystems) y estas secciones se adhirieron a portaobjetos con recubrimiento de polilisina mediante incubación en la estufa a 37°C durante 2 horas.

Desparafinado e hidratación de los cortes histológicos

Una vez obtenidos los cortes de tejido, se marcó en los portaobjetos el área de la muestra con un lápiz de diamante. A continuación, se procedió al desparafinado y rehidratación de los cortes mediante dos pases de 5 minutos en sustitutivo de xilol, un pase de 3 minutos en etanol 100°, un pase de 3 minutos en etanol 96°, un pase de 3 minutos en etanol 70° y un pase de 5 minutos en agua.

Desenmascaramiento antigénico

La fijación con formaldehido provoca la disminución o incluso la pérdida de inmunorreactividad del tejido debido a que da lugar a la formación de enlaces cruzados intra e interproteicos que alteran la estructura tridimensional de los antígenos. Aunque algunos antígenos son resistentes al procesamiento con formaldehído, la mayoría de los epítopos antigénicos pierden su reactividad inmunológica tras el procesamiento de rutina y necesitan ser recuperados. Para poder determinar estos antígenos se han desarrollado técnicas de desenmascaramiento antigénico tales como tratamiento proteolítico (con pronasa, proteinasa K, tripsina, pepsina, etc.) o el tratamiento con calor en soluciones tamponadas con un pH determinado. Durante la realización de esta Tesis Doctoral se realizó desenmascaramiento antigénico de las muestras con proteinasa K. Para ello se cubrieron las muestras de tejido con una disolución de proteinasa K (20 µg/mL) en tampón TE-T (Tris 50 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 0.5%, pH 8) y se incubaron en una cámara húmeda durante 15 minutos a 37°C. A continuación, las muestras se lavaron con PBS durante 3 minutos en una jarra Coplin.

Inhibición de la actividad peroxidasa endógena

Algunos tejidos presentan una elevada actividad peroxidasa endógena que puede dar lugar a tinción inespecífica al realizar inmunohistoquímica con anticuerpos conjugados con peroxidasa. Durante la realización de esta Tesis Doctoral, para bloquear la actividad peroxidasa endógena del tejido, se sumergieron las muestras en una solución de H2O2 al 3% en metanol en un recipiente Coplin protegido de la luz durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las muestras se sometieron a un lavado en PBS durante 5 minutos, seguido de otro lavado de 5 minutos en PBT (PBS conteniendo un 0.05% (v/v) de Tween-20).

Bloqueo de las uniones inespecíficas

Previamente a la incubación con los anticuerpos, las muestras fueron incubadas con BSA al 5% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda para bloquear las uniones inespecíficas del tejido. Tras el bloqueo, las muestras se lavaron dos veces en PBT durante 5 minutos.

Inmunohistoquímica o Inmunohistofluorescencia

Tras el bloqueo de las uniones inespecíficas, las muestras se incubaron con los anticuerpos primarios diluidos en BSA al 1% en PBS durante la noche a 4°C a la concentración indicada por el fabricante. Tras la incubación con los anticuerpos primarios, las muestras se lavaron dos veces con PBT durante 5 minutos y se incubaron con los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (en el caso de IHQ) o con fluorocromos (en el caso de IHF) diluidos en BSA al 1% en PBS a la concentración indicada por el fabricante durante 2 horas a temperatura ambiente. Tras la incubación con los anticuerpos secundarios, las muestras se lavaron dos veces con PBS durante 5 minutos.

En el caso de la IHQ, la actividad peroxidasa de las muestras se reveló mediante incubación con el sustrato de la peroxidasa 3, 3’-diaminobenzidina (DAB) que, al ser oxidado por la peroxidasa, da lugar a un producto marrón-anaranjado en aquellos lugares donde se localiza el antígeno de interés. Para ello, se sumergieron las muestras en una jarra Coplin conteniendo una disolución formada por 25 mg de DAB y 25 µL de H2O2 en 50 mL de PBS, entre 1 y 10 minutos, para permitir el desarrollo del marcaje marrón-anaranjado. Tras esta incubación, las muestras se lavaron con agua destilada y se visualizaron al microscopio para comprobar la intensidad del marcaje.

En el caso de la IHF, tras la incubación con los anticuerpos y los lavados, se procedió directamente al montaje de las preparaciones.

Tinción con hematoxilina-eosina

Tras el revelado de la actividad peroxidasa, las muestras sometidas a IHQ se tiñeron con hematoxilina-eosina para dar mayor contraste al tejido y facilitar la identificación de las estructuras celulares y tisulares. Para ello, los portas se introdujeron durante 10 minutos en Hematoxilina de Mayer. A continuación, se lavaron con agua del grifo hasta eliminar los restos de colorante. Seguidamente, se introdujeron en eosina alcohólica durante 30 segundos y se lavaron con alcohol de 70°.

Deshidratación

Tras la tinción con hematoxilina-eosina, las muestras de IHQ se sometieron a deshidratación mediante un pase de 2 minutos en etanol de 96° y un pase de 2 minutos en etanol de 100°. Por último, se aclararon mediante un pase de 3 minutos en sustitutivo de xilol.

Montaje de las preparaciones

En el caso de la IHF, las preparaciones se montaron directamente tras la incubación con los anticuerpos secundarios. Para ello, se eliminó el exceso de líquido, se añadió junto a la muestra una gota de medio de montaje ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI (Life Technologies) y se colocó el cubreobjetos. Las muestras se dejaron secar durante la noche a temperatura ambiente y, una vez secas, se sellaron con esmalte de uñas y se almacenaron a -80°C en oscuridad hasta su visualización en el microscopio.

En el caso de la IHQ, tras el revelado de la actividad peroxidasa, la tinción con hematoxilina- eosina y la deshidratación de las muestras, se montaron las preparaciones mediante la adición de una gota de medio de montaje junto a la muestra y la colocación de un cubreobjetos. Las muestras procesadas mediante IHQ se conservaron a temperatura ambiente.